Kwantificeren agonistische activiteit heeft op G eiwit-gekoppelde receptoren

1. Meting van de agonist concentratie-respons curves: geen constitutieve activiteit

1. Voor de schatting van de relatieve agonist K _b-waarden (RA _i), is een reeks van ten minste twee agonist concentratie-respons curves vereist. Elke in vitro test voor de functionele respons van een GPCR gemeten kan worden op voorwaarde dat de concentratie van de agonist kan worden gecontroleerd en een enkel type van receptor medieert de reactie. Geschikte cel-gebaseerde testen omvatten de meting van cAMP ^4,7 en ^8,9 inositolphosphate accumulatie in een cellijn die een recombinante receptor. Voorbeelden van hele weefsel testen omvatten het meten van de samentrekking van gladde spieren ¹⁰ of M ₂ muscarine receptor-en β _{1-adrenoceptor-gemedieerde} veranderingen in de samentrekking van het veld-gestimuleerde rat linker atrium ^11.
2. Kies een serie van agonisten voor de analyse, waaronder een zeer effectief agonist(Bv. endogene ligand). In een gegeven experiment, meten volledige concentratie-respons curves voor elke agonist. Als het aantal van agonisten is te groot om de test te voltooien in een enkel experiment, verdeel de agonisten in subgroepen, die elk bestaan ​​uit een beheersbaar aantal agonisten voor een enkel experiment. Voor elke subgroep, samen het meten van de concentratie-respons curve van de zeer effectief agonist met die van de andere agonisten in de subgroep (zie figuur 3). Herhaal het experiment voor elke subgroep 3 tot 6 keer, ongeveer, afhankelijk van de variabiliteit van de gegevens.
3. Voor elke concentratie-respons curve, het meten van de respons in de afwezigheid van agonist (basale respons), en in de aanwezigheid van toenemende concentraties van agonist. De ruimte van de agonist concentraties gelijkmatig op een log schaal ongeveer elke 0,3 tot 0,7 log ₁₀ eenheden, die het bereik van de reacties en het bepalen van de maximale respons (E _max) (zie figuur 3). Voor experimouders op cellijnen, is elke meting gedaan in drievoud.
4. Trek de basale reactie van die gemeten in de aanwezigheid van elke concentratie van de agonist. De reacties die zijn uitgezet in figuur 3 zijn berekend op deze manier.

2. Voorlopige analyse van agonist concentratie-respons curves: geen constitutieve activiteit

1. Vul de gegevens van de concentratie-respons experimenten (bijv. figuur 5) in een gegevenstabel in Prisma. Alle van de log agonist concentraties zijn opgenomen in de kolom met de naam X. De respons metingen voor de agonist die lijkt te hebben de grootste E _max waarde worden ingevoerd in kolom A, en die voor de andere agonist worden ingevoerd in aangrenzende letters kolommen. Repliceren metingen van een concentratie-respons curves worden ingevoerd in sub-kolommen van een bepaalde letters kolom.
2. Selecteer de grafiek blad waarop de gegevens worden uitgezet, en analyseren van de gegevens door niet-lineaire regressie analyse met behulp vande vergelijking gerechtigd, log (agonist) vs reactie - Variabele helling (vier parameters). Beperken de "Bottom" parameter op nul, en het uitvoeren van de regressie-analyse. Kopieer de "Top" (E _max) en log EC ₅₀ parameters in een Excel-spreadsheet voor gebruik in de berekening van de initiële parameterschattingen. De agonist met de grootste E _max schatting wordt aangeduid als de "standaard agonist", terwijl de andere agonisten worden aangeduid als "test-agonisten".
3. Bereken de initiële raming van log τK _OBS (LOGR1) als de negatieve log EC _50-waarde van de standaard agonist (-log EC ₅₀ ').
   
   Bereken de initiële raming van de log-RA _i-waarde van elke test agonist (LOGRA) als log {(Top * EC ₅₀ ') / (Top' * EC _50)}, waarbij de parameters van de standaard-agonist worden aangeduid met een apostrof .
   
   Bereken de log affiniteit constants van de test-agonisten (LOGK2 - LOGK5) als de negatieve logboek van hun respectieve EC _50-waarden.

3. Schatting van de agonist RAI waarden met niet-lineaire regressie-analyse: geen constitutieve activiteit

1. Voer de gegevens in een Data tabel in Prisma, zoals hierboven beschreven onder 2.1. Zorg ervoor dat de gegevens voor de standaard agonist worden ingevoerd in kolom A.
2. Voer een door de gebruiker gedefinieerde vergelijking, "log RAI", in de Prism op verschillende lijnen zoals aangegeven voor het geval waarbij een totaal van vijf agonisten:
   • <A> P = LOGK1
   • <A> Q = LOGR
   • <~ A> Q = LOGR + LOGRA
   • <B> P = LOGK2
   • <C> P = LOGK3
   • <D> P = LOGK4
   • <E> P = LOGK5
   • Y = Msys / (1 + {[(1 +10 ^ (X + P)) / (10 ^ (X + Q))] ^ M})
3. Geef de eerste parameterschattingen als volgt:
   Geef een willekeurig lage waarde van 0 voor de log affiniteitsconstante (LOGK1) van de standaard agonist.
   
   Geef de eerste schatting vanLOGR en de affiniteit constanten (LOGK2 - LOGK5) en log RAI waarden (LOGRA) van de test agonisten.
   
   Wijs de initiële raming van de transducer helling factor (M) een waarde van 1,0.
   
   Wijs de eerste schatting voor de maximale respons van het systeem (Msys) een waarde gelijk aan de E _max van de standaard agonist (Top ').
4. Gelden de volgende parameter beperkingen: LOGK1 beperkt tot de constante, 0; LOGR1, Msys en M, gedeelde waarde voor alle reeksen gegevens; LOGK2 - LOGK5 en LOGRA, geen beperkingen.
5. Initiëren niet-lineaire regressie-analyse. De resultaten leveren de log K _obs en log RA _i-waarden van de test agonisten. Als de standaard agonist is een volledige agonist, dan is de zowel de log K _obs en log RA _i-waarden juist zijn. Als de meest effectieve agonist (standaard agonist) is eigenlijk een partiële agonist, dan is de K _obs waarden van de meer doeltreffende agonists kan worden overschat. Niettemin, de schattingen van de log RA _i zijn nog steeds nauwkeurig in deze situatie.
6. Als de regressie niet convergeren, kan de experimentator wens om de theoretische curve gedefinieerd door de eerste parameterschattingen plot. Als er grote afwijkingen tussen de gegevens punten en de theoretische curves, controleer dan de berekening van de initiële parameterschattingen. Indien een of meer agonisten E _max-waarden gelijk aan die van de standaard-agonist, kan het nodig zijn om hun log K beperken _obs waarden op 0 voor de regressie om te convergeren op een oplossing.

4. Meting van de agonist concentratie-respons curves in cel-gebaseerde testen vertonen constitutieve receptor activiteit

1. Voor de schatting van agonist K _b waarden in absolute eenheden van M ^-1, cel-gebaseerde in vitro assays worden gebruikt die vertonen constitutieve receptor activiteit. Grondwettieve receptor activiteit wordt gedefinieerd als de toename van de respons boven het basale niveau wordt veroorzaakt door expressie van de receptor van belang.
2. Kies agonisten en vormgeving het experiment, zoals hierboven beschreven in paragraaf 1.2.
3. Voor elke concentratie-respons curve, het meten van de respons in de afwezigheid van agonist in niet-getransfecteerde cellen (basale respons) en in de cellen getransfecteerd met de receptor van belang (basale reactie + constitutief respons). Meet de respons in de aanwezigheid van verschillende concentraties van de verschillende agonisten, zoals hierboven beschreven in paragraaf 1.3.
4. Bereken constitutieve receptor activiteit en de reacties op de concentratie van agonist als de gemeten respons minus de basale respons in cellen niet getransfecteerd met de receptor. Figuur 6 toont de antwoorden op de verschillende agonisten berekend op deze manier voor een signaleringsroute vertoont een zeer lage constitutieve activiteit.

5. Voorlopige eenALYSE agonist concentratie-respons curves vertonen constitutieve activiteit

1. Voer de gegevens (bijvoorbeeld figuur 6) in een Data tabel in Prisma, zoals beschreven in paragraaf 3.1, maar ook voer de reactie wordt veroorzaakt door constitutieve receptor activiteit in de juiste letters kolommen die overeenkomt met een log agonist concentratie van -20. Een grote negatieve logaritme is ingevoerd om bij benadering een agonist concentratie van nul.
2. Analyseren van de gegevens zoals hierboven beschreven in paragraaf 2.2, maar met de "Bottom" parameter zo beperkt dat het "gedeeld voor alle reeksen gegevens." Kopieer de "Top" (E _max), gedeelde "Bottom" en meld je EC50 parameters in een Excel-spreadsheet voor gebruik in de berekening van de initiële parameterschattingen.
3. Bereken de eerste parameterschattingen als volgt:
   
   De log affiniteitsconstante van de standaard agonist (LOGK1) of een volledige-, test-agonist moet worden vastgesteld in afzonderlijke experimenten zoals eerder beschreven ^drie
   Bereken de initiële raming van de log K _obs waarde van elk deeltest agonist (dat wil zeggen, alleen LOGK2 in dit geval) als log {(Top'-Top) / (EC ₅₀ (Top'-Bottom))}, waarin "Bottom "geeft de reactie wordt veroorzaakt door constitutieve receptor activering.
   
   Bereken de initiële raming van log K _b (LOGKb) voor elke agonist als log {Top / (EG ₅₀ Bottom)}.
   
   Bereken de initiële raming van log τ _sys (LOGTsys) als log {Bottom / (Top '- Bottom)}.

6. Schatting van de agonist Kb waarden voor reacties vertonen constitutieve receptor activiteit met behulp van niet-lineaire regressie-analyse

1. Voer de gegevens in een Data tabel in Prisma, zoals hierboven beschreven onder 3.1
2. Voer een door de gebruiker gedefinieerde vergelijking, "Log Kb", in de Prism op verschillende lijnen zoals weergegeven voor de toestand van twee agonisten:
   • <A> LOGKOBS = LOGK1
   • <B> LOGKOBS = LOGK2
   • A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) +1
   • B = 10 ^ (X + + LOGTSYS LOGKB)
   • C = (10 ^ (LOGTSYS))
   • Y = Msys / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]}
3. Geef de eerste parameterschattingen als volgt:
   
   Voer de affiniteitsconstanten van elke agonist (LOGK1 - voer de waarde bepaald volgens stap 5.3).
   
   Voer de K _obs schattingen van elke test agonist.
   
   Voer de Kb schattingen van de agonisten.
   
   Geef log τ _sys (LOGTsys) te schatten.
   
   Wijs de transducer helling factor (M) en de maximale respons van het systeem (Msys)-waarden van 1,0 en Top '(E _max van de standaard agonist), respectievelijk.
4. Gelden de volgende parameter beperkingen: LOGTsys, Msys en M, gedeelde waarde voor alle reeksen gegevens, LOGK2 en LOGKb, geen beperkingen.
5. Initiëren niet-lineaire regressie-analyse. De resultaten leveren de log K _b van de standaard-agonist, de log K _obs K _b waarden van de partiële agonisten, en de maximale respons van het systeem (Msys), de τ _sys waarde voor de gratis receptor complex (LOGTsys), en de transducer helling factor in het operationele model (M).
6. Als de regressie niet convergeren, volg dan de stappen beschreven hierboven onder punt 3.6.

7. Representatieve resultaten

Figuur 5 toont een aantal van onze eerder gepubliceerde gegevens over muscarine agonist-geïnduceerde fosfoinositide hydrolyse in Chinese hamster ovarium cellen die stabiel de uiting van de M ₃ muscarine receptor ^12. De concentratie-respons curven van geselecteerde muscarine agonisten werden gemeten in deze test. De gegevens werden geanalyseerd zoals hierboven beschreven onder Sectie 3 tot en met de K _b waarde van elk agonist schatten, uitgedrukt in verhouding tot die van oxotremorine-M. Deze log RA _i ramingen zijn, carbachol, -0,56 ± 0.063; Arecolijn, -0,60 ± 0.074, pilocarpine, -1,20 ± 0,15, en McN-A-343, -1,92 ± 0,31. De theoretische curves vertegenwoordigen de kleinste kwadraten van de regressievergelijking om de gegevens (paragraaf 3.2). De ramingen van de maximale respons van het systeem (M _sys) en de transducer helling factor (M) waren 53,9 ± 1,3 en 1,15 ± 0,09, respectievelijk. De log K _obs waarden van de agonisten, met uitzondering van oxotremorine-M waren, carbachol, 5,19 ± 0,14; arecoline, 5,49 ± 0,12, pilocarpine, 5,58 ± 0,16 en McN-A-343, 5,27 ± 0,33.

Figuur 6 toont de resultaten van experimenten op muscarine agonist-gestimuleerde fosfoinositide hydrolyse in HEK 293 cellen die stabiel tot expressie G _α15 ^3. Transiënte expressie van de M ₃ muscarine-receptor veroorzaakt een toename van de basale fosfoinositide hydrolyse, die werd toegeschreven aan constitutieve receptor activheid. De gegevens werden geanalyseerd om de log K _b-waarden van oxotremorine-M en de MCN-A-343 schatting zoals beschreven in punt 6. Deze analyse log K _b-waarden van 8,30 ± 0,59 en 6,59 ± 0,77 leverde voor oxotremorine-M en de MCN-A-343, respectievelijk. De theoretische curves vertegenwoordigen de kleinste kwadraten van de regressievergelijking om de gegevens (zie paragraaf 6.2). De schattingen van log τ _sys, M _sys en M waren -2,29 ± 0,59, 95,8 ± 2,8 en 0,72 ± 0,08, respectievelijk. De schatting van de K-waarde van de _obs McN-A-343 was 5,35 ± 0,46.

Figuur 1. Verband tussen single-receptor activiteit en het gemiddelde niveau van de activering van de receptor bevolking. Single receptor-activiteit, de theoretische gedrag van een enkele receptor ondergaat transitions tussen actieve (On) en inactief (uit) staten in de aanwezigheid van een agonist wordt getoond. De affiniteit constanten van de agonist voor de actieve en inactieve toestanden worden aangeduid met K _b en K _a, respectievelijk. Bevolking gedrag, de theoretische gedrag van de verschillende receptoren die een willekeurige overgangen tussen actieve en inactieve staten in de aanwezigheid van een agonist wordt getoond. Bevolking gemiddelde, is het gemiddelde niveau van de receptor activering in een populatie van receptoren in de aanwezigheid van een specifieke concentratie van de agonist getoond. De activering niveau van de receptor bevolking staat bekend als de stimulus.

Figuur 2. Verband tussen de receptor activering van de functie en de werkzaamheid (ε) en de waargenomen affiniteitsconstante (K _OBS) van de agonist. Bevolking gemiddeld, het gemiddelde niveau vanreceptor activering opgewekt door toenemende concentraties van agonist wordt getoond. Receptor activering wordt het gemiddelde niveau van de receptor activering uitgezet agonist de log concentratie van de agonist. De negatieve log concentratie van de agonist die nodig is voor half-maximale receptor activering is gelijk aan de log waargenomen affiniteitsconstante van de agonist (log K _obs). Het maximum van de receptor activatie functie is aangeduid als werkzaamheid (ε).

Figuur 3. Voorbeelden van concentratie-respons curves voor de stimulatie van ^[3 H] inositolphosphate accumulatie door diverse muscarine agonisten in Chinese hamster ovarium cellen die het menselijk M ₃ muscarine receptor. Een totaal van negen agonist concentratie-respons curves werden gemeten. Het experiment kan worden onderverdeeld in twee delen. Voor elk onderdeel, de standaard agonist (oxotremorineM) is altijd getest in combinatie met extra agonisten. Dus twee experimenten van het type getoond in a en b zijn nodig om de concentratie-respons curves van negen-agonisten te meten al was het maar vijf-agonisten kan worden getest in een keer. De gegevens zijn afkomstig Ehlert et al.. ^12.

Figuur 4. Voorbeelden van concentratie-respons curves voor de stimulatie van ^[3 H] inositolphosphate accumulatie door diverse muscarine agonisten in HEK 293 cellen die het menselijk M ₂ muscarine receptor en G _α15. Expressie van de _M-2-receptor veroorzaakte een 30 - 35% ^[3 H] inositolphosphate reactie, die werd toegeschreven aan constitutieve receptor activiteit. De gegevens zijn afkomstig Ehlert et al.. ^12.

Figuur 5. 3 muscarine receptor. De concentratie-respons curves van geselecteerde muscarine agonisten voor het stimuleren van fosfoinositide hydrolyse worden weergegeven. Gemiddelde waarden van drie experimenten ± SEM worden weergegeven. De gegevens zijn afkomstig Ehlert et al.. ^12.

Figuur 6. Oxotremorine-M-en de MCN-A-343-gemedieerde fosfoinositide hydrolyse in HEK 293 cellen die G _α15 en de M ₃ muscarine receptor. Fosfoinositide hydrolyse wordt uitgedrukt ten opzichte van de E _max van oxotremorine-M. Bij het ​​ontbreken van agonist, fosfoinositide hydrolyse toegeschreven aan expressie van de _M-3-receptor goed voor ongeveer 2% van de respons. De middelen van de drie experimenten ± SEM worden weergegeven. De data zijn van Ehlert et al.. ^3.

Omdat onze methode voor het schatten van RA _i (relatieve K _b-waarde) alleen vereist de meting van de agonist concentratie-respons curves, kan onze analyse gedaan worden altijd deze curves worden gemeten.

Als dag-tot-dag variatie in de reactie van de experimentele opstelling (bv, cellen of weefsel) groot is, kan de respons metingen van elke concentratie-respons-curve ten opzichte van de "Top"-raming van de standaard-agonist voor genormaliseerd worden elke dag experiment. Een schatting van Top en log EC ₅₀ is geschat voor elk replicatieonderzoek concentratie-response curve van de standaard agonist door regressie-analyse, zoals beschreven in de artikelen 2 en 5. De reactie waarden van alle van de agonist concentratie-respons curves op een bepaalde dag zijn ten opzichte van de Top schatting van de standaard-agonist voor die dag genormaliseerd. Deze genormaliseerde gegevens worden vervolgens geanalyseerd zoals hierboven beschreven BeginnING op hoofdstuk 3.

De nauwkeurigheid van het schatten K _b hangt af van een nauwkeurige schatting van de constitutieve receptor activiteit. In ons geval, transfectie van de _M-3-receptor in HEK 293 cellen veroorzaakt een toename van de fosfoinositide hydrolyse, dat varieerde van ongeveer 500 - 1000 cpm van ^[3 H] inositolphosphates gemeten in de aanwezigheid van lithium in cellen pre-gelabeld met [3H] inositol . De maximale respons op carbachol was circa 50.000 - 60.000 cpm. Had de constitutieve reactie is groter en minder variabel, onze schatting van de K _b waarden van de oxotremorine-M en de MCN-A-343 zou zijn geweest nauwkeuriger. De schatting van de _K-b is ook afhankelijk van het hebben van een nauwkeurige schatting van de transducer helling factor (M) in de operationele model. Bijgevolg kunnen meer nauwkeurigheid worden bereikt, indien de concentratie van agonist waren dicht bij elkaar gelegen, zoals aanbevolen in rubriek 1.3. Running extra agonisten in het experiment ook sterk verhoogt de nauwkeurigheid van de schatting van M, en dus van K _b.

Als er verschillende actieve toestanden van de receptor dat signaal door verschillende koppeling eiwitten (bijv. G-eiwitten), dan, onze methode van analyse een nauwkeurige schatting van de agonist K _b en RA biedt _i-waarden voor elke effector weg ^3,6. Als er meer dan een actieve toestand draagt ​​bij aan een gemeten respons, dan is onze methode voor de schatting van RA _I en K _b vertegenwoordigt een gewogen gemiddelde van verschillende actieve toestanden, afhankelijk van hun relatieve overvloed en activiteit ^3.

Constitutieve receptor activiteit kan worden geïnduceerd door meer dan de uiting van de GPCR en de aanvullende G-eiwit ^13. Dit kan veranderen de waargenomen affiniteit en werkzaamheid van het agonist-receptor complex en kan leiden tot niet-physiological signalering. Maar veranderingen in de aard van de respons en de waargenomen affiniteit en werkzaamheid van de receptor bevolking heeft geen wijziging in de fundamentele quantale staten van de receptor, maar een verandering in het aantal en de waarschijnlijkheid van isomerisatie. Zo, G-eiwitten zijn niet zozeer een determinant van de effecten van geneesmiddelen zo veel als een venster op verschillende effector-selectieve staten van de receptor. Als onze methode van analyse wordt toegepast op specifieke GPCR signalering assays betrokkenheid van een enkele effector (bijv. G-eiwit) moet het mogelijk zijn om agonist K _b-waarden te meten voor de effector-selectieve staten van de receptor - de ultieme maatstaf van de agonist bias.