The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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English Version | Other Languages
1Dept of Physics, MIT - Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, MIT - Massachusetts Institute of Technology
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Mittal, N., Flavin, S., Voldman, J. Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip. J. Vis. Exp. (8), e318, doi:10.3791/318 (2007).
सेल सेल diffusible संकेतन और सेल सेल संपर्क (juxtacrine संकेतन) से मिलकर बातचीत ट्यूमर के विकास, स्टेम सेल भेदभाव, और स्टेम सेल आत्म नवीकरण जैसे कई जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण हैं. तरीकों का एक नंबर वर्तमान में इन विट्रो में सेल संकेतन मिलाना मौजूद है. Modulating diffusible संकेतन की कुल राशि का एक तरीका संस्कृति के दौरान सेल बोने घनत्व भिन्न है. सेल बोने, वास्तविक रिक्ति सेल सेल और सेल सेल संपर्क की राशि में काफी भिन्नता में इस परिणाम, और स्थानीय पर्यावरण लिख नहीं कर सकते के यादृच्छिक प्रकृति के कारण. Modulating संकेतन सेल के लिए एक अधिक विशिष्ट दृष्टिकोण आणविक inhibitors या आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए नीचे विशिष्ट संकेत प्रोटीन दस्तक है, लेकिन इन दोनों तरीकों में से सबसे अच्छा अणुओं के छोटे संख्या से छेड़छाड़ करने के लिए अनुकूल हैं. यहाँ, हम modulating संकेतन सेल सेल है कि एक सब्सट्रेट पर वांछित स्थानों पर कोशिकाओं के विभिन्न संख्या रखकर कोशिकाओं का एक समूह के स्थानीय पर्यावरण modulates एक नया दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है. यह विधि एक पूरक कोशिकाओं के बीच स्थानीय diffusible और juxtacrine संकेतन नियंत्रण प्रदान करता है. हमारे विधि जैव फ्लिप चिप (BFC) का उपयोग, एक microfabricated सिलिकॉन चिप microwells, प्रत्येक आकार के सैकड़ों हजारों युक्त या तो एक एकल कक्ष या कक्षों की छोटी संख्या पकड़ बनाता है. हम बस उन्हें कुओं की सरणी पर pipetting और सरणी बंद उतार कोशिकाओं धोने के द्वारा कोशिकाओं के साथ चिप लोड. चिप तो एक सब्सट्रेट पर रूप से फ़्लिप किया है, जिससे कोशिकाओं कुओं और सब्सट्रेट बाहर गिर, उनके patterning को बनाए रखने. बाद कोशिकाओं संलग्न है, चिप (या पर बाईं) हटाया जा सकता है. सेल patterning के लिए इस दृष्टिकोण में अद्वितीय है कि: 1) सब्सट्रेट के रसायन शास्त्र को बदल नहीं करता है किसी भी सब्सट्रेट पर इस तरह कोशिकाओं को पैदा करना और की ओर पलायन की अनुमति, 2) patterning की अनुमति देता है ऊतक संस्कृति polystyrene, कांच, matrigel सहित, और यहां तक कि सेल परतों फीडर, और 3) पारंपरिक microcontact मुद्रण के साथ संगत है, उन द्वीपों के अंदर रखा कोशिकाओं के साथ बाह्य मैट्रिक्स द्वीपों के सृजन की अनुमति है. इस वीडियो में, हम माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं ऊतक संस्कृति polystyrene पर BFC का उपयोग patterning प्रदर्शित करता है.
एक BFC बनाना
BFCs एक 4 "सी मास्टर वफ़र पर ढलाई polydimethylsiloxane (PDMS) द्वारा किए गए हैं.
एक मास्टर वफ़र करना
मोल्डिंग चिप्स
उपयोग के लिए BFC तैयारी
BFC साथ patterning कोशिकाओं
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हालांकि प्रोटोकॉल और वीडियो यहाँ दिखाया पैटर्न माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESCs) BFC एक का उपयोग कर का वर्णन करने के लिए, BFCs व्यावहारिक रूप से ब्याज की किसी भी कोशिका प्रकार के पैटर्न के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. केवल परिवर्तन एक को बनाने की आवश्यकता हो सकती है microwells के आकार को बदलने के लिए है. हमारे अनुभव में, किसी अन्य कोशिका प्रकार, एक microwell व्यास और 10 माइक्रोन स्वाधीन सेल व्यास की तुलना में अधिक से अधिक के बराबर ऊंचाई के पैटर्न एकल कक्षों BFC का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा काम करता है.
BFCs पैटर्न कोशिकाओं को भी अन्य कक्षों सहित अन्य substrates, पर कर सकते हैं प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण बदलाव के बिना इस्तेमाल किया जा. एक मौजूदा सेल परत पर patterning के बाद mESCs और मानव ESCs सहित कुछ celltypes, समर्थन या फीडर कोशिकाओं उनकी संस्कृति में उचित phenotype बनाए रखने के लिए आवश्यकता होती है पारंपरिक सेल patterning दृष्टिकोण से अधिक BFC दृष्टिकोण का एक फायदा है.
BFC है कि हम पीछा कर रहे हैं एक आवेदन करने के लिए BFC का उपयोग करने के लिए माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के बीच संकेत जांच है. अलग ग्रिड spacings के साथ वर्ग lattices में एकल कक्षों के बीज बोने की क्रिया करके, हम दर जिस पर संकेतन अणुओं कोशिकाओं द्वारा विमर्श कर रहे हैं मिलाना. बड़ा कुओं (40 microns के एक व्यास के साथ) करके, हम भी किसी स्थान पर बड़ा (~ 2-10) संख्या कोशिकाओं जमा कर सकते हैं हैं, स्थानीय सेल घनत्व फेरबदल. इसके अलावा, हम एक दूसरे के करीब निकटता में छोटे कुओं की एक संख्या जगह है, जहां स्थानीय सेल घनत्व अधिक है द्वारा कोशिकाओं के संपर्क में नहीं हैं एक सब्सट्रेट पैटर्न में परिणाम कर सकते हैं. इस फैशन में, हम स्वतंत्र रूप से कोशिकाओं के बीच diffusible और juxtacrine संकेत न्यूनाधिक कर सकते हैं. एक ग्रिड में कोशिकाओं के बाद भी कई दिनों से अधिक कोशिकाओं को ट्रैक करना आसान बनाता है. हम मानते हैं कि BFC के साथ सेल patterning के आराम के अन्य शोधकर्ताओं ने अपने अध्ययन में उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित करेंगे.
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इस काम NIH अनुदान EB007278 द्वारा समर्थित किया गया था.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Silicon master mould | |||
| Tissue culture dishes | Falcon BD | 35-3001 | 35 mm |
| 3/4" binder clips | |||
| PBS | |||
| hexamethyldisiloxane | Shin-Etsu MicroSi | ||
| New Item | MicroChem Corp. | SU8-2050 | |
| PM acetate | |||
| Isopropanol | |||
| BSA | 7.5% Bovine Serum Albumin |
1. Rosenthal A., Macdonald A., Voldman J. Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment. Biomaterials 28, 3208-3216 (2007).
