Los patrones de las células madre embrionarias usando el Flip Chip Bio

Hacer una BFC

BFC son hechas por moldeo polidimetilsiloxano (PDMS) en un 4 "oblea de silicio maestro.

Hacer una oblea de maestro

1. Comience por la deshidratación de la obleas de silicio durante 30 minutos a 130 ° C.
2. Lugar de la oblea en un spin-aplicador, vierta SU8-2050 (Microchem) sobre la oblea, rampa de 300 rpm / s de 3000-4000 rpm, y el giro de 30 s para obtener la altura característica de 40-30 mm, respectivamente.
3. Después de girar, el lugar de la oblea en una placa 65 ° C, inmediatamente rampa encima de la temperatura a 95 ° C durante 5-6 minutos, y luego la rampa de bajada a 65 ° C.
4. Exponer las obleas a una dosis UV de 200 mJ / cm ² en un alineador de contacto usando una máscara de campo oscuro.
5. Coloque las galletas en una placa de 65 ° C, inmediatamente rampa encima de la temperatura a 95 ° C durante 4-5 minutos, y luego la rampa de bajada a 65 ° C.
6. Desarrollar las obleas en acetato de PM y el isopropanol.
7. Silanizar las obleas durante 30 minutos utilizando hexametildisiloxano (Shin-Etsu MicroSi), o (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-triclorosilano (t2492-KG, Especialidades UCT, Bristol, PA), para evitar que a partir de PDMS la adhesión a la oblea de Si señor.

Chips de moldeo

1. Mezcla de PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) en una proporción de 10:1, se vierte sobre la oblea maestro Si (~ 15 g por oblea), y se deja secar toda la noche a temperatura ambiente.
2. Pelar el curado PDMS de la oblea de silicio y corte cada chip con una cuchilla de afeitar.
3. Vínculo cada chip a un portaobjetos de microscopio 1x1 cm de corte para un fácil manejo.

Preparación de la BFC para el uso

1. Remoje la noche a la mañana BFC en PBS con el fin de prevenir la absorción de los medios de comunicación en el PDMS durante el experimento.
2. Seque los chips con un Kimwipe (KIMTECH Science).
3. Ponga una gota de 7,5% albúmina de suero bovino (BSA) (~ 200 ml) en la superficie de estampado de la BFC, y luego raspar con una punta de pipeta para dispersar a la BSA y eliminar las burbujas de los pozos.
4. Salir de la BSA sobre la superficie del BFC, por lo menos 0,5 horas. Lo ideal sería que agitan la BSA cada 15 minutos para evitar la formación de costras.
5. Para adaptarse a la BFC dentro de un plato de 35x10 mm TCPS (Falcon, 35-3.001), corte los bordes de una manera medio plato TCPS abajo para que el ¾ "clips de la carpeta (Office Depot) caben sobre el borde plato para sujetar el chip y plato juntos.
6. Cortar una junta de separador (en forma de marco con el borde exterior de 20'20 mm, borde interno 15'15 mm y 250-500 mm de espesor) de una hoja de PDMS (Productos Especiales de silicona) o cualquier otra de silicona, y aplicarlo a la antena con unas pinzas.

Células con un patrón de BFC

1. Esterilizar el plato, la junta, chip recubierto de BSA, y dos clips de la carpeta a la luz ultravioleta durante 1 minuto.
2. Aspirar a la BSA y enjuague el BFC dos veces con 200 ml de PBS.
3. Añadir la gelatina al plato TCPS corte si es necesario para su línea celular. De lo contrario, humedecer la superficie TCPS con algunos medios de comunicación antes de aplicarlo en el chip (ver más abajo). Esto evita que se formen burbujas en la cámara.
4. Después de aspirar el PBS, una pipeta 200 ml de solución de células (~ 1 × 10 ⁶ células / ml) sobre la superficie del BFC. Vamos a colocar las células durante 5-10 minutos.
5. La inclinación de la BFC a una esquina en un ángulo de ~ 15 ° y lentamente la pipeta la solución de células con una pipeta de 200 ml. Luego, coloque el piso BFC y añadir 100 ml de PBS o medio vacío en la esquina opuesta BFC. Enjuague el BFC de esta manera un adicional de 2.4 veces, según sea necesario, para eliminar todas las células de las regiones entre bien.
6. Pipeta 200 ml de los medios de comunicación en la superficie del chip. Aspirar la gelatina / media de los TCPS. Luego invierta el plato previamente mojado y empuje lentamente hasta la BFC, en el plato.
7. Aplicar una carpeta de clip de cada uno, a dos lados de la cámara para sellarlo. Quitar las púas de metal de los clips de carpeta para que el plato se mantiene el nivel cuando se volcó.
8. Por último, rápidamente la vuelta al la instalación a través, evitando cualquier movimiento innecesario, y lo coloca en la incubadora.

Aunque el protocolo y el video se muestra aquí se describe el uso de la BFC ^un patrón de células madre embrionarias de ratón (mESCs), BFC se puede utilizar para patrón de prácticamente cualquier tipo de célula de interés. El único cambio que uno puede necesitar hacer es cambiar el tamaño de las cúpulas. En nuestra experiencia, para utilizar el BFC a las células de un patrón único de otro tipo de células, un diámetro de micropocillos y altura igual a 10 micrones mayor que el diámetro de la celda libre que funciona mejor.

BFC también se puede utilizar a las células de patrón en otros sustratos, incluyendo otras células, sin cambios significativos en el protocolo. Patrones en una capa de células existentes es una de las ventajas del enfoque de BFC sobre los enfoques tradicionales de la célula patrón desde celltypes ciertas, incluyendo mESCs y humanos CES, requieren de las células de soporte o de alimentación para mantener su fenotipo propio de la cultura.

Una aplicación de la BFC que estamos llevando a cabo es el uso de la BFC para investigar la señalización entre las células madre embrionarias de ratón. Por la siembra de células individuales en redes cuadradas con distancia modular diferentes, modulan la velocidad a la que las moléculas de señalización que se intercambian por las células. Al hacer los pozos más grandes (con un diámetro de 40 micras), también puede recoger un mayor número (~ 2.10), las células en un determinado lugar, a nivel local alterando la densidad celular. Además, podemos colocar una serie de pequeños pozos en las proximidades de uno al otro, lo que resulta en un patrón de sustrato donde la densidad celular local es alto por las células no están en contacto. De esta manera, se puede modular de forma independiente de señalización difusibles y juxtacrine entre las células. Tener células en una cuadrícula también hace que sea mucho más fácil de rastrear las células durante varios días. Creemos que la facilidad de los patrones de células con el BFC animará a otros investigadores para usarla en sus estudios.