Расширение периферической крови человека γδ T клеток с использованием Zoledronate

1. Выделение МКПК

1. Нарисуйте крови (7,5-8,0 мл) в BD Vacutainer КПП сотовый Подготовка труб с гепарином натрия. Трубка содержит антикоагулянт гепарин натрия и Ficoll-Hypaque плотность жидкости, а также барьер полиэстер гель, который отделяет двух жидкостей. Одноразовая пробирка / крови при комнатной температуре (18 ° C до 25 ° С) в горизонтальный ротор (поворотно-откидной головкой) в течение 20 мин при 1800 х г. Коммутатор центрифуги тормоза прочь.
2. После центрифугирования последовательность слоев происходит следующим образом (если смотреть сверху вниз):) плазмы - Ъ) мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) и тромбоцитов - с) плотность раствора - г) полиэстер гель - е) гранулоциты - е) красные кровяные клетки (рис. 1).
3. Сбор фракция плазменного слоя, делая 5 до 10 мм плазмы выше интерфазе, не нарушая слой клеток. Плазма может быть использована для культуры (раздел 2.5).
4. Урожай фракции, обогащенной (МКПК) на межфазной с пипеткой и трансфер в 15 мл коническую трубку.
5. Вымойте РВМС с 10 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), обращая трубки 5 раз, а затем центрифуги в течение 5 мин при 400 х г.
6. Повторите промывание шаги в два раза, а затем ресуспендируют осадок клеток в 5 мл PBS. Определить число клеток. Обычно 1,3 x10 ^{6 клеток} выделяют из 1 мл цельной крови.
7. Определить частоту и фенотип γδ Т-клеток в РВМС методом проточной цитометрии (раздел 3) (рис. 2).

2. Расширение γδ Т-клеток

1. Центрифуга клеточные суспензии в 15 мл конические пробирки в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре, и отбросить супернатанты.
2. Подготовка питательной среды (СМ), добавив человеческого ИЛ-2 (IL-2) и золедронат (Зомета) до конечной концентрации 1000 МЕ / мл и 5 мкМ, соответственно. ALyS203 (Cell науки и технологический институт) или OpTmizer (Invitrogen) средства массовой информации поддерживать хорошие расширения γδ Т-клеток (более подробная информация в ссылках 6 и 9). Зомета содержится в жидком виде (4 мг/5мл флакон). Для подготовки 5 мкМ раствор, добавьте 50 мкл Zometa до 30 мл питательной среды.
3. Ресуспендируют осадок клеток в культуральной среде и приспосабливаться к 1х10 ^{6 кл} / мл.
4. Внесите 1 мл CM содержащей 1x10 ⁶ клеток в каждую лунку 24-луночного планшета. Для крупных культурах, клетки могут быть посеяны на уровне 0,5 х 10 ^{6 клеток} / см ² в зависимости от площади поверхности пластины скважин, блюдо, или колбу.
5. Добавить аутологичной плазмы (раздел 1.3), объединенных человека АВ сывороток, или ФТС, так что это примерно 10% от объема культура (100 мкл на каждую лунку 24-луночного планшета). Место пластин в увлажненных 37 ° С, 5% СО ₂ инкубатора в течение 24-48 часов.
6. Поддержание культуры на плотность клеток 0.5-2 х 10 ⁶ клеток / мл. Добавьте свежую среду, содержащую человеческий IL-2 (1000 МЕ / мл) только (без Зомета) каждые 2-3 дня, и передача культивируемых клеток в новые скважины или колбы в случае необходимости, в зависимости от степени пролиферации клеток (рис. 3). Поставка плазме или сыворотке в среду, так что концентрация сывороточного может поддерживаться не менее 1%.
7. Урожай клеток на 12-14 день и определить частоту, фенотип, и функции γδ Т-клеток с помощью проточной цитометрии (см. ниже).

3. Фенотипическая анализ с помощью проточной цитометрии

1. Передача 200 мкл образцов, содержащих 2 х 10 ^{5 клеток} к флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) труб.
2. Добавьте 2 мл холодного PBS и центрифуги в течение 5 мин при 400 х г. Затем, ресуспендируют гранул в 50 мкл буфера FACS (PBS + 1% ФТС + 0,1% азид натрия). Добавьте 5 мкл каждого антитела к образцов (моноклональные антитела, приведены в таблице 1).
3. Инкубировать на льду в темноте в течение 20 мин.
4. Добавить 2 мл FACS буфера для каждого образца, а затем вихрь. Центрифуга образцы в течение 5 мин при 400 х г при 4 ° C. Тщательно слейте супернатант.
5. Ресуспендируют клеток в 300 мкл буфера FACS и вихря. Анализ образцов на проточный цитометр (рис. 2).

4. IFN-γ производства анализа ¹⁰

1. За день до теста, подготовить стимулятор клетки при культивировании 3-5 x10 ^{5 клеток} Дауди / мл в RPMI 1640, плюс 10% FCS (RPMI-10) в течение ночи с Зомета (5 мкМ) (далее назначенный Z-Дауди).
2. Сбор Z-Дауди и ресуспендируют в RPMI-10 на 2x10 ^{6 клеток} / мл. Добавить 100 мкл Z-Дауди (2х10 ⁵⁾ в каждую лунку с круглым дном 96-луночный планшет.
3. Подготовка γδ Т-клеток на 2х10 ^{6 клеток} / мл в RPMI-10 содержащие Brefeldin при 20 мкг / мл. Передача 100 мкл γδ Т-клеточной суспензии (2x10 ⁵⁾ в каждую лунку содержащих Z-Дауди клетки или для контроля скважин (100 мкл RPMI-10 только, или RPMI-10 с 20 нг / мл форбол 12-миристат-13-ацетат[PMA] плюс 2 мкг / мл иономицина).
4. Смешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Инкубируйте в течение 4 часов при 37 ° C, 5% СО ₂ инкубатора.
5. Центрифуга пластине в течение 5 мин при 400 х г при 4 ° С и ресуспендируйте гранул в 200 мкл холодного PBS.
6. Передача образцов FACS труб. Добавьте 4 мл холодного PBS и центрифуги трубы в течение 5 мин при 400 х г при 4 ° C.
7. Ресуспендируют гранул в 50 мкл FACS буфера с FITC-сопряженных анти-TCRVγ9 (5 мкл) и PE/Cy5-conjugated анти-CD3 мАт (2,5 мкл). Инкубируйте защищенном от света месте в течение 15 мин при комнатной температуре.
8. Добавить 100 мкл IntraPrep реагента 1 и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре. Добавить 4 мл PBS в каждую пробирку и центрифуги в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре.
9. Удалить супернатант аспирацией и добавьте 100 мкл реагента 2 IntraPrep. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре без встряхивания.
10. Добавьте 5 мкл PE-сопряженных анти-IFN-γ МКА к пробирке. Инкубируйте защищенном от света месте в течение 15 мин при комнатной температуре.
11. Добавить 4 мл PBS в каждую пробирку и центрифуги в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре. Удалить супернатант аспирацией и ресуспендируют осадок клеток в 0,5 мл буфера FACS.
12. Анализ клеток потока цитометр. Ворота на CD3 ⁺ TCRVγ9 ^{+ клеток} и изучение экспрессии IFN-γ (рис. 4).

5. Представитель Результаты:

Важно, чтобы определить процент γδ Т-клеток в РВМС на начало культуры. Как показано на рис. 2, процент CD3 ^{+ +} TCRVγ9 γδ Т-клеток в РВМС составил 1,6% в день 0. Доминирующей популяции CD27 ⁺ CD45RA ⁺ наивным или CD27 ⁺ CD45RA ^- центральный фенотипы памяти. Когда γδ Т-клеток были эффективно стимулировали, они образовали кластеры в дни 3-5 (рис. 3, Б). Когда формирования кластера было отложено, рост других типов клеток, такие как CD4 ⁺ или CD8 ⁺ Т-клеток αβ или NK клетки могут доминировать рост γδ Т-клеток (рис. 3 C и D). После 14 дней культивирования частота γδ Т-клеток увеличилось до более чем 93,8% из культивируемых клеток успешно γδ Т клеточных культурах (рис. 2 E). Культурный γδ Т-клетки upregulated NKG2D и CD69 выражении (рис. 2 G и Н). Они проявили CD27 ^- CD45RA ^- эффектор фенотип памяти (рис. 2 F). Функции γδ Т-клеток были оценены в отношении продукции цитокинов и цитотоксичность. Внутриклеточного IFN-γ окрашивание показало, что γδ Т-клеток производится IFN-γ в ответ на PMA / иономицина лечения или Z-Дауди клетки, которые накопились после лечения ИПП золедронат (рис. 4). Эти результаты показывают, что золедронат может эффективно стимулировать и расширения функциональных γδ Т-клеток.

Таблица 1. Моноклональные антитела, используемые в многоцветном окрашивании γδ Т-клеток. Примером фенотипического анализа γδ Т-клеток производится в нашей лаборатории показано на рис. 2.

Рисунок 1. Разделение РВМС. Кровь (7,5-8,0 мл) втягивается в BD Vacutainer КПП сотовый Подготовка труб с гепарином натрия и непосредственно центрифугировали в течение 20 мин при 1800 х г. После центрифугирования в результате слои, как показано сверху боttom:) Плазма - б) РВМС и тромбоцитов - с) Плотность раствора - г) полиэстер гель - е) гранулоцитов - е) красных кровяных телец.

Рисунок 2. Типичный фенотип поверхности γδ Т-клеток. РВМС стимулировали золедронат и ИЛ-2 в течение 14 дней. Клетки окрашивали FITC-меченого анти-TCR Vγ9 и PE/Cy5-labeled анти-CD3 контролировать расширение γδ Т-клеток (и Е). γδ Т-клетки были идентифицированы по их выражению TCRVγ9, и их выражение CD27 и CD45RA (B и F), NKG2D (С и G), или CD69 (D и H) был рассмотрен.

Рисунок 3. Представителю γδ культур Т-клеток. РВМС стимулировали ИЛ-2 (1000 МЕ / мл) и золедронат (5 мкМ). Представитель поля показано на рисунке (IX71 инвертированного микроскопа [Olympus] х 200). Кластеры и агрегатов γδ Т-клеток может наблюдаться на 3 день (А) и 5-й день (B), когда γδ Т-клетки были успешно расширены. В отличие от этого, нет кластеров или агрегатов наблюдались при γδ Т-клеток рост не был адекватным (С и D).

Рисунок 4. IFN-γ производства. γδ Т-клетки инкубировали с RPMI-10 только () или PMA / иономицина (В) или Z-Дауди (C) в течение 4 часов. Во-первых, поверхность выражение TCRVγ9 окрашивали и IFN-γ производства был рассмотрен внутриклеточного IFN-γ окрашивание.

Рисунок 5. Кинетика γδ культуре Т-клеток. (А) Абсолютное число культивируемых клеток, (B) процент γδ Т-клеток, и (C) абсолютное число Т-клеток γδ в указанных точках времени.

Метод, представленный здесь обеспечивает эффективное расширение γδ Т-клетки из РВМС. γδ Т-клетки активируются и расширена золедронат и ИЛ-2 разработки полного эффекторные функции, отражается производство цитокинов и цитотоксичность. Было сообщено, что синтетические bromohydrin phosphoantigens пирофосфат (BrHPP) и 2-метил-3-бутенил-1-пирофосфат (2M3B1PP) также расширить γδ Т-клеток, однако они не являются коммерчески доступными. В противоположность этому, золедронат уже лицензирована для клинического применения в качестве Зомета. Таким образом, надежный реагент легко доступен.

Выбор питательных сред и сыворотки имеет решающее значение. Используйте соответствующие средства массовой информации, таких как культура ALyS203 (Cell науки и технологический институт) или OpTmizer (Invitrogen) для успешного расширения γδ Т клетки. ¹¹ Убедитесь, что аутологичной плазмы, объединенных человека АВ сыворотки или FCS может поддерживать γδ Т клеточной культуры. Также помните, что РВМС от некоторых доноров не реагируют на стимуляцию золедронат независимо от других реагентов культуры. Если это произойдет, то единственным вариантом является изменение донора.

Как мы уже показали, обогащение γδ Т-клеток был достигнут сравнительно рано, почти 80% культивируемых клеток были γδ Т-клеток, днем ​​7. γδ Т-клетки продолжали размножаться до 12-14 дней (рис. 5). Примерно 2,2 х 10 ⁸ γδ Т-клетки могут быть получены из 1 х 10 ⁶
РВМС содержащего 1,6 х 10 ⁴ γδ Т-клеток. Эта культура метод был использован в первой фазы клинических испытаний и оценки безопасности и целесообразности Zoledronate расширенной γδ Т терапии передачи клетка у пациентов с множественной миеломой или рак легких. ^12,13