Expansión de la sangre periférica humana de células T γδ con zoledronato

1. Aislamiento de PBMC

1. Extracción de sangre (7,5-8,0 ml) en un tubo BD Vacutainer CPT preparación celular con heparina sódica. El tubo contiene un anticoagulante con heparina sódica y un fluido de densidad de Ficoll-Hypaque, además de una barrera de gel de poliéster, que separa los dos líquidos. Tubo de centrífuga / muestra de sangre a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) en un rotor horizontal (se gira hacia fuera de la cabeza) durante 20 minutos a 1800 x g. Interruptor de centrífuga de los frenos.
2. Después de la centrifugación, la secuencia de capas se produce de la siguiente manera (visto desde arriba a abajo): un plasma) - b) las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y plaquetas - c) la densidad de la solución - d) de gel de poliéster - e) granulocitos - f) glóbulos rojos (Fig. 1).
3. Recoger una fracción de la capa de plasma, dejando 5 a 10 mm de plasma por encima de la interfase sin alterar la capa de células. El plasma puede ser utilizado para el cultivo (sección 2.5).
4. Cosecha de la fracción enriquecida (CMSP) en la interfase con una pipeta y transferir a un tubo cónico de 15 ml.
5. Lave la PBMC con 10 ml de tampón fosfato salino (PBS), invirtiendo el tubo cinco veces, y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g.
6. Repita los pasos de lavado dos veces, y luego volver a suspender el pellet de células en 5 ml de PBS. Determinar el número de células. Por lo general, 1,3 x 10 ⁶ células se recuperan de 1 ml de sangre total.
7. Determinar la frecuencia y el fenotipo de las células T γδ en PBMC por citometría de flujo (sección 3) (Fig. 2).

2. La expansión de las células T γδ

1. Centrifugar las suspensiones de células en 15 ml tubos cónicos durante 5 minutos a 400 x g a temperatura ambiente, y desechar el sobrenadante.
2. Preparar medio de cultivo (CM) mediante la adición de la IL-2 (IL-2) y el zoledronato (Zometa) a concentraciones finales de 1000 UI / ml y M 5, respectivamente. ALyS203 (celular y Ciencia Instituto de Tecnología) o Optmizer (Invitrogen) apoyar la expansión de los medios de comunicación bien de las células T γδ (más información en las referencias 6 y 9). Zometa se suministra en forma líquida (4 mg/5-ml vial). Para preparar una solución de 5 M, se añaden 50 l de Zometa para 30 ml de medio de cultivo.
3. Resuspender el sedimento celular en medio de cultivo y se ajustan a 1x10 ⁶ células / ml.
4. Pipeta de 1 ml de CM contiene 1x10 ⁶ células en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Para las grandes culturas, las células pueden ser sembradas a 0.5 x 10 ⁶ células / cm ^{2, de} acuerdo a las superficies de los pozos de la placa, plato o recipiente.
5. Añadir plasma autólogo (sección 1.3), agrupados suero humano AB, o FCS por lo que es aproximadamente el 10% del volumen de la cultura (100 l por cada pocillo de una placa de 24 pocillos). Coloque las placas en un humidificado 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora durante 24-48 horas.
6. Mantener el cultivo a una densidad celular de 0,5 a 2 x 10 ⁶ células / ml. Añadir un nuevo soporte de la IL-2 (1000 UI / ml) solamente (sin Zometa) cada 2-3 días, y la transferencia de células cultivadas en pozos nuevos o frascos como sea necesario, de acuerdo con el grado de proliferación celular (Fig. 3). Suministro de plasma o suero al medio de manera que la concentración sérica se puede mantener por lo menos 1%.
7. Las células de la cosecha en el día 12-14 y determinar la frecuencia, fenotipo, y las funciones de las células T γδ por citometría de flujo (ver más abajo).

3. El análisis fenotípico por citometría de flujo

1. Transferencia de 200 muestras de l que contiene 2 x 10 ⁵ células de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) tubos.
2. Añadir 2 ml de PBS frío y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. A continuación, volver a suspender las pastillas en 50 l de tampón FACS (PBS + 1% FCS + 0,1% de azida de sodio). Añadir 5 l de cada una de las muestras de anticuerpos (los anticuerpos monoclonales se listan en la Tabla 1).
3. Incubar en hielo en la oscuridad durante 20 min.
4. Añadir 2 ml de tampón FACS para cada muestra, y luego vórtice. Centrifugue las muestras durante 5 minutos a 400 x g a 4 ° C. Decantar cuidadosamente el sobrenadante.
5. Resuspender las células en 300 l de tampón FACS y agitar. Analizar las muestras en un citómetro de flujo (Fig. 2).

4. IFN-γ producción de ensayo de ¹⁰

1. El día antes del ensayo, preparar las células estimulador mediante el cultivo de 3.5 x 10 ⁵ células Daudi / ml en medio RPMI 1640 más el 10% de FCS (RPMI-10) durante la noche con Zometa (5 M) (en adelante designado Z-Daudi).
2. Recoger Z-Daudi y resuspender en medio RPMI-10 en 2x10 ⁶ células / ml. Añadir 100 ml de Z-Daudi (2x10 ⁵⁾ a cada pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos.
3. Prepare las células T γδ en 2x10 ⁶ células / ml en RPMI-10 contiene Brefeldina A a 20 mg / ml. Transferencia de 100 l de suspensión de células T γδ (2x10 ⁵⁾ a cada pocillo que contiene Z-Daudi células o de control de los pozos (100 l de RPMI-10 solamente, o RPMI-10 con 20 ng / ml de forbol 12-miristato 13-acetato[PMA] y 2 mg / ml de ionomicina).
4. Mezclar pipeteando arriba y abajo varias veces. Se incuba durante 4 horas en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora.
5. Centrifugar la placa durante 5 minutos a 400 x g a 4 ° C y volver a suspender las pastillas en 200 l de PBS frío.
6. Transferencia de las muestras a los tubos de FACS. Agregar 4 ml de PBS frío y centrifugar los tubos durante 5 minutos a 400 x g a 4 ° C.
7. Resuspender los pellets en 50 l de tampón FACS con FITC-conjugado anti-TCRVγ9 (5 l) y PE/Cy5-conjugated anti-CD3 (2,5 l). Incubar protegido de la luz durante 15 minutos a temperatura ambiente.
8. Añadir 100 ml de reactivo IntraPrep 1 y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente. Agregar 4 ml de PBS a cada tubo y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g a temperatura ambiente.
9. Eliminar el sobrenadante por aspiración y añadir 100 ml de reactivo 2 IntraPrep. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente sin agitación.
10. Añadir 5 l de PE-conjugadas anti-IFN-γ MAB para el tubo de ensayo. Incubar protegido de la luz durante 15 minutos a temperatura ambiente.
11. Agregar 4 ml de PBS a cada tubo y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender el botón celular en 0,5 ml de tampón FACS.
12. Analizar las células por citometría de flujo. Puerta de CD3 ^{+ +} TCRVγ9 células y examinar la expresión de IFN-γ (Fig. 4).

5. Los resultados representativos:

Es importante determinar el porcentaje de células T γδ en PBMC en el inicio de la cultura. Como se muestra en la figura. 2 A, el porcentaje de linfocitos CD3 ⁺ TCRVγ9 ⁺ células T γδ en PBMC fue del 1,6% en el día 0. Las poblaciones dominantes fueron CD27 ⁺ CD45RA ⁺ CD27 o ingenuo CD45RA ^{+ -} fenotipos memoria central. Cuando las células T γδ fueron estimulados de manera eficiente, se formaron grupos en los días 3-5 (Fig. 3 A y B). Cuando la formación de agrupaciones se demoró, el ​​crecimiento de otros tipos de células, como células CD4 ⁺ y CD8 ⁺ αβ células T o células NK podría dominar el crecimiento de las células T γδ (Fig. 3 C y D). Después de 14 días de cultivo, la frecuencia de las células T γδ aumentó a más del 93,8% de las células cultivadas en el éxito de las culturas de las células T γδ (Fig. 2 E). Los cultivos de células T γδ upregulated NKG2D y expresión de CD69 (Fig. 2 G y H). La exhibición de CD27 ^- CD45RA ^- fenotipo efectoras de memoria (Fig. 2 F). Las funciones de las células T γδ fueron evaluados con respecto a la producción de citocinas y citotoxicidad. El IFN-γ intracelular tinción demostrado que las células T γδ produjo IFN-γ en respuesta a PMA / ionomicina tratamiento o células Daudi que Z-IPP acumulado después de un tratamiento zoledronato (Fig. 4). Estos resultados indican que el zoledronato eficiente puede estimular y expandir las células T γδ funcional.

Tabla 1. Los anticuerpos monoclonales utilizados en la tinción multicolor de las células T γδ. Un ejemplo del análisis fenotípico de las células T γδ realizado en nuestro laboratorio se muestra en la figura. 2.

Figura 1. Separación de PBMC. Sangre (7,5-8,0 ml) se introduce en un tubo BD Vacutainer CPT preparación celular con heparina sódica y directamente se centrifuga durante 20 minutos a 1800 x g. Después de la centrifugación, las capas que resulta como se ve desde arriba a bottom: un Plasma) - b) PBMC y plaquetas - c) Densidad de la solución - d) de gel de poliéster - e) Granulocitos - f) Los glóbulos rojos.

Figura 2. Fenotipo de superficie típico de las células T γδ. PBMC fueron estimulados con zoledronato e IL-2 durante 14 días. Las células se tiñeron con FITC anti-TCR Vγ9 y PE/Cy5-labeled anti-CD3 para controlar la expansión de las células T γδ (A y E). Las células T γδ fueron identificados por su expresión de TCRVγ9, y la expresión de CD27 y CD45RA (B y F), NKG2D (C y G), o CD69 (D y H) se examinó.

Figura 3. Representante γδ cultivos de células T. PBMC fueron estimulados con IL-2 (1000 UI / ml) y el zoledronato (5 M). Campos representativos se muestran (IX71 microscopio invertido [Olympus] x 200). Las agrupaciones y los agregados de células T γδ se puede observar en el día 3 (A) y el día 5 (B), cuando las células T γδ se ampliaron con éxito. Por el contrario, existen grupos o agregados se observaron cuando el crecimiento de células T γδ no era la adecuada (C y D).

Figura 4. IFN-γ producción. γδ células T se incubaron con RPMI-10 sólo (A) o PMA / ionomicina (B) o Z-Daudi (C) durante 4 horas. En primer lugar, la expresión superficial de TCRVγ9 estaba manchada y IFN-γ producción fue examinado por intracelular de IFN-γ tinción.

Figura 5. Cinética de la cultura de las células T γδ. (A) Número absoluto de células en cultivo, (B) el porcentaje de células T γδ, y (C) número absoluto de células T γδ en los puntos de tiempo indicado.

El método aquí presentado permite la expansión eficiente de las células T γδ a partir de PBMC. γδ células T activadas y ampliado por zoledronato y la IL-2 desarrollan completar las funciones efectoras, se refleja en la producción de citocinas y citotoxicidad. Se ha informado de que el sintético phosphoantigens pirofosfato bromhidrina (BrHPP) y 2-metil-3-butenil-1-pirofosfato (2M3B1PP) también ampliar las células T γδ, sin embargo, no están disponibles comercialmente. En contraste, el zoledronato es que ya tienen licencia para aplicaciones clínicas como Zometa. Por lo tanto, un reactivo confiable está fácilmente disponible.

La selección de medios de cultivo y el suero es fundamental. Utilice los medios apropiados, tales como la cultura ALyS203 (celular y Ciencia Instituto de Tecnología) o Optmizer (Invitrogen) para el éxito de la expansión de células T γδ. ¹¹ Compruebe que plasma autólogo, humano agrupado AB suero o FCS puede apoyar la cultura de las células T γδ. También recuerde que PBMC de algunos donantes no responden a la estimulación zoledronato, independientemente de los reactivos otra cultura. Si eso ocurre, la única opción es cambiar el donante.

Como hemos demostrado, el enriquecimiento de las células T γδ se consiguió relativamente pronto, casi el 80% de las células se cultivaron las células T γδ el día 7. Las células T γδ continuaron proliferando hasta 12-14 días (Fig. 5). Aproximadamente 2.2 x 10 ⁸ células T γδ se pueden obtener de 1 x 10 ⁶
PBMC que contiene 1,6 x 10 ⁴ células T γδ. Este método de cultivo se ha utilizado en la fase I de ensayos clínicos que evalúan la seguridad y la viabilidad de zoledronato expandido γδ terapia transferencia de células T en pacientes con mieloma múltiple o cáncer de pulmón ^12,13.