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 JoVE Neuroscience

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

1,2, 1, 1,3

1SISSA, International School for Advanced Studies, 2Istituto di Biofisica, Consiglio Nazionale delle Ricerche, 3SISSA Unit, Italian Institute of Technology

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Cite this Article: Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (55), e3195, doi:10.3791/3195 (2011).

Abstract: Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Fotólise de compostos enjaulado permite a produção de aumentos rápidos e localizados na concentração de vários compostos fisiologicamente ativos 1. Caged compostos são moléculas feitas fisiologicamente inativo por uma gaiola química que pode ser quebrado por um flash de luz ultravioleta. Aqui, nós mostramos como obter patch-clamp gravações combinado com fotólise de compostos enjaulado para o estudo da transdução olfativos em dissociada do mouse neurônios sensoriais olfativos. O processo de transdução olfativos (Figura 1) ocorre nos cílios dos neurônios sensoriais olfativos, onde odorant ligação aos receptores leva ao aumento de cAMP que abre nucleotídeo cíclico-gated (CNG) canais 2. Ca entrada através de canais CNG ativa os canais de Ca-activated Cl. Mostramos como dissociar os neurônios do epitélio olfativo do mouse 3 e como ativar canais CNG ou canais de Ca-Cl ativado por fotólise de cAMP enjaulado enjaulados Ca 4 ou 5 </ Sup>. Nós usamos uma lâmpada de flash 6,7 aplicar flashes ultravioleta à região ciliar para libertar da gaiola ou cAMP Ca enquanto patch-clamp gravações são tomadas para medir a corrente em toda a configuração de tensão de células-clamp 11/08.

Discussion: Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Flash fotólise de compostos enjaulado combinado com patch-clamp gravações é uma técnica útil para obter saltos rápidos e local da concentração de moléculas ativas fisiologicamente dentro e fora das células. Vários tipos de compounds1 enjaulado foram sintetizados, e esta técnica pode ser aplicada a vários tipos de células, incluindo células cultivadas expressar canais iônicos que podem ser ativadas ou moduladas por fotólise de alguns dos compostos disponíveis enjaulado 11.

Fotólise de compostos enjaulado requer pulsos de alta intensidade de luz UV perto de soltar da jaula uma quantidade suficiente de moléculas em um curto espaço de tempo. Várias fontes de luz podem ser usados: uma lâmpada de arco continuamente operada de mercúrio ou xenônio controlado por um obturador e acoplado à porta do microscópio de epifluorescência, uma lâmpada de flash Xenon, um laser UV, e os recentemente desenvolvidos alta potência UV de diodos emissores de luz (LED ). Cada tipo de fonte de luz tem vantagens e desvantagenstagens de acordo com a aplicação específica e para o custo do aparelho. Em comparação com uma lâmpada de flash, as lâmpadas continuamente operado têm uma menor intensidade de luz e, portanto, a duração de pulsos de luz controlada por um disparo precisa ser aumentada até várias centenas de ms para obter uma quantidade suficiente de moléculas uncaged. Lasers UV são muito caros. LEDs de alta potência UV 14 para fotólise flash são recentemente disponível comercialmente e pode fornecer uma boa alternativa a outros métodos. No entanto, uma vantagem das lâmpadas de flash é que eles têm um espectro mais amplo de emissão de UV LEDs, permitindo o uso de vários tipos de compostos enjaulado com diferentes características espectrais As principais vantagens de usar uma lâmpada de Xenon flash para uncaging em nossa aplicação são: um bom resolução de tempo, de fato a duração do pulso de luz é de cerca de 1 ms, um amplo espectro UV que é adequado para fotólise de moléculas com diferentes propriedades fotoquímicas, a possibilidade de escolher a moeda de dez centavosnsion do foco de luz para iluminar a região ciliar; a possibilidade de seleccionar facilmente várias intensidades de luz 6. Além disso, o Xenon flash-lâmpada tem um custo razoável, é facilmente implementado em um eletrofisiológicas set-up, e não requer uma manutenção especial.

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Disclosures: Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Não há conflitos de interesse declarados.

Materials: Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Name Company Catalog Number Comments
Adapter module flash lamp to microscope Rapp OptoElectronic FlashCube 70
Air table TMC MICRO-g 63-534
Digitizer Axon Instruments Digidata 1322A
Data Acquisition Software Axon Instruments pClamp 8
Data Analysis Software WaveMetrics Igor
Mirror for adapter module Rapp OptoElectronic M70/100
Electrode holder Axon Instruments 1-HL-U
Faraday’s cage Custom Made
Filter cube Olympus Corporation U-MWU Excitation filter removed
Flash lamp Rapp OptoElectronic JML-C2
Forceps Dumont #55 World Precision Instruments, Inc. 14099
Glass capillaries World Precision Instruments, Inc. PG10165-4
Glass bottom dish World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Illuminator Olympus Corporation Highlight 3100
Inverted microscope Olympus Corporation IX70
Micromanipulators Luigs & Neumann SM I
Micropipette Puller Narishige International PP-830
Monitor HesaVision MTB-01
Neutral density filters Omega Optical varies
Objective 100X Carl Zeiss, Inc. Fluar 440285 Either Zeiss or Olympus
Objective 100X Olympus Corporation UPLFLN 100XOI2 Either Zeiss or Olympus
Optical UV shortpass filter Rapp OptoElectronic SP400
Patch-clamp amplifier Axon Instruments Axopatch 200B
Photo Diode Assembly Rapp OptoElectronic PDA
Quartz light guide Rapp OptoElectronic varies We use 600 μm diameter
Silver wire World Precision Instruments, Inc. AGT1025
Silver ground pellet Warner Instruments 64-1309
Xenon arc lamp Rapp OptoElectronic XBL-JML
Reagent Company Catalogue number
BCMCM-caged cAMP BioLog B016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A8806
CaCl2 standard solution 0.1 M Fluka 21059
Caged Ca: DMNP-EDTA Invitrogen D6814
Cysteine Sigma-Aldrich C9768
Concanavalin A type V (ConA) Sigma-Aldrich C7275
CsCl Sigma-Aldrich C4036
DMSO Sigma-Aldrich D8418
DNAse I Sigma-Aldrich D4527
EDTA Sigma-Aldrich E9884
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H3375
KCl Sigma-Aldrich P3911
KOH Sigma-Aldrich P1767
Leupeptin Sigma-Aldrich L0649
MgCl2 Fluka 63020
Papain Sigma-Aldrich P3125
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1274
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Sigma-Aldrich S5881
NaPyruvate Sigma-Aldrich P2256

References: Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

  1. Ellis-Davies, G.C.R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-28 (2007).
  2. Pifferi, S., Boccaccio, A. & Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-9 (2006).
  3. Bozza, T.C. & Kauer, J.S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-9 (1998).
  4. Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. et al. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
  5. Kaplan, J.H. & Ellis-Davies, G.C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-5 (1988).
  6. Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-22 (1998).
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  8. Lagostena, L. & Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-16 (2003).
  9. Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., & Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-84 (2006).
  10. Boccaccio, A. & Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-60 (2007).
  11. Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., & Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-204 (2010).
  12. Balana, B., Taylor, N., & Slesinger, P.A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189, DOI: 10.3791/2189 (2010).
  13. Cygnar, K.D., Stephan, A.B., & Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850, DOI: 10.3791/1850 (2010).
  14. Bernardinelli, Y., Haeberli, C., & Chatton, J.Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-72 (2005).

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