마우스 배아의 Motoneurons의 렉틴 기반 격리와 문화

Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. J. Vis. Exp. (55), e3200, doi:10.3791/3200 (2011).

척추 motoneurons 일찍 배아 신경 시스템 개발을 통해 postmitotic 단계 향해 개발하고 이후 dendrites과 axons을 성장. 표현 Nkx6.1가 척추 motoneurons ¹ 고유의 전구체 세포되는 신경 튜브 Neuroepithelial 세포. postmitotic의 motoneurons 그들의 최종 위치를 향해 이동하고 척추 넓이 ^2,3 따라 열로 자신을 정리했지만. 이러한 모든 차별과 위치 motoneurons의 90 % 이상이 전사 요인에게 섬 1 / 2 표현한다. 그들은 사지의 근육뿐만 아니라 신체 내부의 장기들을 신경을 분포시키다. 다른 사람들과 motoneurons 일반적으로 두뇌 파생 neurotrophic 인자 (BDNF) 및 Neurotrophin - 3 (NT - 3), tropomyosin 관련 키나제 B와 C (TrkB, TrkC)의 고친 화성 수용체를 표현한다. 그들은 tropomyosin 관련 키나제 A (TrkA) ^4을 표현하지 않습니다. 두 고친 화성 수용체 게다가, motoneurons은 낮은 친화 neurotrophin 수용체 p75 ^NTR을 표현 않습니다. p75 ^NTR은 성숙 neurotrophins를 바인딩시킬 고친 화성 수용체보다 모든 neurotrophins과 비슷하지만, 낮은 친화력있는 모든 neurotrophins을 바인딩할 수 있습니다. 배아 척수 내에서 p75 ^NTR은 독점적으로 척추 motoneurons ⁵ 표시됩니다. 이것은 주변 세포 ⁶ 대부분의 세포를 정화 motoneuron 절연 기술을 개발하는 데 사용되었습니다. p75 ^NTR의 세포외 도메인에 대한 특정 항체 (패닝)의 도움으로 분리 motoneurons은 하나의 실험에 사용되는 항체의 양이 높은 패닝에 사용되는 접시의 크기로 인해대로 고가의 방법으로 밝혀졌다 있습니다. 훨씬 더 경제적인 대안은 렉틴를 사용하는 것입니다. 렉틴과은 특히뿐만 아니라 ⁷ p75 ^NTR에 바인딩을 보여줘왔다. 다음과 같은 방법 대신 p75 ^{NTR 항체의} preplating 절차 밀 배아 agglutinin을 사용하여 다른 방법을 설명합니다. 렉틴과는 p75 ^{NTR 항체의} 비교 아르 렉틴를 사용하여 p75 ^{NTR 항체} 및 정화 등급으로 매우 저렴한 대안입니다. 배아 척수에서 Motoneurons이 방법에 의해 격리 수 있으며, 생존과 neurites을 성장.

특수 시약의 경우 : 탭을 참조하십시오. 1. 나열된 다른 모든 시약은 시그마 알드리치에서 얻은 세포 배양 등급 품질 있습니다.

1. 요리 / coverslips의 PORN-H/laminin 코팅

1. 150 MM의 borate 버퍼 산도 8.35에서 0.5 MG / ML 폴리 - DL - ornithine 브롬화 수 소산​​ (포르노 H)의 작업 솔루션을 준비합니다.
   1. 50 MG 포르노 / 1 ML의 borate 버퍼의 주식 솔루션은 사전에 준비하고 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다
2. 100 % 에탄올에 불타는하여 유리 coverslips을 소독하고 공기 건조 보자.
3. 4 밤새 충분한 포르노 H 솔루션 표면 ° C. 표지
4. 다음날 소독 물, 공기 건조 coverslips로 세 번 씻어.
5. HBSS 2.5 μg / ML의 laminin의 작업 솔루션을 준비
   1. Aliquots는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 ° C 즉시 사용하기 전에 4 해동.
6. laminin 솔루션 포르노 H - 코팅 coverslips의 표면을 커버하고 사용하기 전까지 실온에서 최소 2 H에 대해 품어 보자.

2. 정화 접시의 렉틴 코팅

1. 멸균 물, 산도 9.5에서 10 mm까지 트리스의 솔루션을 준비합니다.
2. 10 μg / ML의 최종 농도 렉틴을 (HBSS에있는 렉틴 (시그마 L9640) 가루를 해결하는) 추가합니다.
3. 코트 렉틴 솔루션 8 ML과 10cm의 세포 배양 접시의 표면은 실온에서 최소 30 분 품어 보자.
4. 사용까지 HBSS에 HBSS 및 저장과 접시 세 번 씻으십시오.
5. 30mM KCl, 0.8 % (W / V) NaCl의 depolarisation - 솔루션을 준비합니다. 실온 (RT)에 여과하고 저장하여 소독.

3. Motoneuron 문화 매체

1. 해동 목마 혈청 4 박 ° C 55 °에서 inactivate 30 분 C, -20에서 5 ML 및 저장소로 나누어지는 ° C. 해동의 나누어지는 직접 RT에서 사용하기 전에.
2. 보관 -20 ° C. 1 ML aliqouts에서 B27 - 보충 사용하기 전에 바로 RT에서 B27 보충 해동. 동결과 해동 사이클을 피하십시오.
3. 나누어지는의 -20 ° C에서 0.5 ML aliquots 및 저장에 glutamax하고 1:100에서 사용합니다.
4. 10 μg / 0.1 % BSA와 소독을 물에 ML의 CNTF의 재고 솔루션을 준비합니다. -20 ° C.에 저장
5. 2.5 ML 말 혈청, 1 ML - B27 보충 직접 사용하기 전에 0.5 ML glutamax와 46 ML neurobasal 매체를 섞는다.
6. 37 ° C. 10 NG / ML 매체와 사전 따뜻한 매체의 최종 농도 CNTF 추가

4. 척수의 해부

1. E12.5 임신 마우스를 희생하고 조심스럽게 배아를 제거합니다. 완전히 배아를 커버하기에 충분한 RT HBSS를 추가합니다.
2. 머리와 꼬리를 제거하고 straddled 팔다리와 배아 뒤 측면을 놓으십시오.
3. 한 포셉와 배아를 수정하고 다른 포셉과 바깥쪽 피부를 제거합니다.
4. 그 아래 포셉을 천공하여 척수를 제거하고 척수의 양쪽에서 본 같은 움직임으로 들어올려.
5. HBSS로 새로운 접시에 격리 척수를 전송하고 지느러미 측면에있는 척수의 중심 채널을 엽니다.
6. 척수의 둘러싸고 meninges을 제거하여 지느러미 루트 신경을 제거합니다.
7. 최대 얼음 1 ML의 HBSS하고 저장 가득 eppendorf 반응 관의 렉틴 판 당 6 배아에 대한 준비가 완료되기 전까지의 척추 코드의 허리 부분을 수집합니다.

5. 렉틴과 기반의 정화에 의해 motoneurons의 농축

참고 : 다음 단계를 시작하기 전에, 여기에 최신은 (. 3 단계 참조) 매체를 준비하고 prewarm

1. 4 100 ML의 HBSS, -20 ° C에서 저장 및 해동에 1g 트립신를 해결 ° C.하여 트립신 용액을 준비
2. 믹스 1g 98 ML의 HBSS 1 M HEPES pH를 7.4 2 ML과 트립신 - 억제제는, 1 ML의 aliquots 4 ° C.에 보관해야
3. 세포 배양 후드에 척추 코드와 튜브를 전송하고 조심스럽게 HBSS 700 μl를 제거합니다.
4. 7.5 μl 트립신 솔루션과 조심스럽게 반전 튜브로 믹스를 추가합니다.
5. 37 8 분 trypsination을 수행 ° C.
6. 30 μl 트립신 억제제를 추가하여 반응을 중지하고 더 이상 셀 집계 볼 때까지 1000 μl 피펫 팁과 함께 신중하게 10-15 시간을 피펫 아래 (씹다). 20-200 μl 피펫하고 해당 팁을와 분쇄를 반복합니다.
7. HBSS - 가득한 렉틴 판에 셀 솔루션을 피펫 부드럽게 접시를 회전하여 세포를 분산.
8. 진동이없는 표면에 RT 60 분 렉틴 접시 보관하십시오. 오염을 피하기 위해 그것을 커버.
9. 아주 부드럽게 HBSS를 제거하고 접시에게 세포 조각 및 첨부된 / 무소속하지 세포를 제거하는 사전 예열 HBSS와 함께 신중하게 4 번 씻는다.
10. 바로 마지막 세척 단계 후, 접시 500 μl depolarisation 솔루션을 추가하고 1min에 대해 품어 보자.
11. 흔들림으로 렉틴 구속 세포의 분리를 촉진하고번호판을 도청.
12. 2 ML 사전 예열 문화 매체와 15 ML 팔콘 튜브로 전송과 번호판을 입력합니다.
13. neubauer의 카운트 챔버와 휴대폰 번호를 계산합니다.
14. 플레이트 응용 프로그램에 따라 적절한 숫자 laminin 코팅 coverslips 또는 접시에있는 세포.
15. 일 1 오래된 매체의 50 %주의 교체하여 연속적으로 매초마다 하루에 매체 교환을 수행합니다. 항상 미리 예열, 신선한 새로운 문화 매체를 사용합니다.

6. 대표 결과 :

배아 motoneurons는 E12에서 E14로 마우스 배아에서 얻을 수 있습니다. 요추 척수의 전체 세포 인구로부터 2-3 %가 motoneurons로 구성되어 있으며, 지느러미 루트 ganglionic 뉴런은 물론 ^NTR - 긍정적인 p75 있으므로, 그것은 (렉틴 기반 preplating 절차를 시작하기 전에 이러한 세포를 제거하는 것이 중요합니다 개요를 보려면 다음) 그림 1과 그림 2를 참조하십시오. 둘째, meninges들은 제대로 렉틴 기반 preplating 절차 (그림 2, 그림 3)에 의해 제거할 수 없습니다로서뿐만 제외되어야 강력하게 나누어 세포를 포함합니다. 나쁜 경우에는 이들 세포는 문화 번호판을 자라다 수 있습니다. 그림 3B와 3D의 대표적인 사진도 (프로토콜의 단계 5.9 참조) 수행되었습니다 절차를 세척 후 낮은 세포 밀도에 대한 인상을 제공합니다. 배아 마우스 motoneurons의 문화는 일반적으로 다섯 위 이레 동안 유지됩니다. 이 기간 동안 세포가 최대 길이 (그림 4) 자신의 neurites을 설정합니다. Neurite 길이 강력히 접시 ⁸ 기판에 따라 달라집니다. 전형적인 기판 포르노 - H 대상 문화 요리에 코팅되어 laminin입니다. Motoneurons 또한 물 용해에 의해 생성된 ⁸ 세포외 매트릭스와 같은 다른 이하 정의 기판 위에 성장하실 수 있습니다. suboptimal 코팅, neurite 길이와 성장 원뿔 지역의 경우에 감소 및 세포 사망은 일반적으로 증가하고 있습니다. 영양 지원 문화 배아 마우스 motoneurons의 생존에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. 영양 지원 ⁶ 않고 10 % 20 % 7 일째 드롭에 처음 도금 세포의 생존. 두뇌 파생 neurotrophic 인자 (BDNF)와 Ciliary neurotrophic 요소 (CNTF)는 가장 일반적으로 사용되는 요소지만 나머지는 잘 [백혈병 억제 인자 (난생), Cardiotrophin - 1 (CT - 1) 기본적인 fibroblast의 성장 인자는 (bFGF로 생존을 홍보할 수 ), 성장 인자 1 (IGF - 1) ^9] 인슐린과 같은.

배아 마우스 motoneurons의 준비를 위해 그림 1. 흐름 방식. 회로도 그림은 마우스 배아 motoneurons의 격리와 문화에 대한 서로 다른 단계를 보여줍니다. 약어 : SC : 척수, HBSS : 행크스 균형 소금 솔루션, MN : motoneuron.

그림 2 E12.5 마우스에서 척수의 허리 부분의 분리 :.. E12.5 마우스 배아. 다음 단계에 대한, 머리와 꼬리를 제거하고 신체는 지느러미 접속 위치 B에 배치됩니다 지느러미 접속 위치에 배아. 척수의 왼쪽과 오른쪽에 집게는 위치에 배아 몸을 고정하고 있습니다. 포셉 중 하나는 이후에 피부를 잘라하고 다른이 위치에있는 배아를 해결하는 데 사용되는 척수 아래 절단하는 데 사용됩니다 C :. E12.5 마우스 배아에서 분리된 척수가. 척수 (허리, 가슴, 자궁 경부)의 부분이 표시됩니다. 척수는 meninges으로 둘러싸여 있으며, 지느러미 루트 신경의 일부는 여전히 그들에게 부착됩니다 D는 :. 척수는 길이 방향 중앙 운하쪽으로 그것을 열려면 지느러미 측면에 절단 E는 :. 복부 측면에 meninges 지금은 평평 척수 이륙. 참고 : 이륙하는 동안 허리 부분에 작은 상처로 표시됩니다 F는 :. 척수의 허리 부분만이 그 다음 추가 절차를 취합니다.

그림 3 결단력과 E12.5 마우스 배아의 요추 척수의 섬 - 긍정적인 세포의 분리 :.. 섬 - 2분의 1 항체 배아 요추 척수 내에 라벨 motoneuron 열 (빨강, 화살표)와 Hoechst 라벨 모두 섹션 핵. E12.5 lumar 척수의 부분을 교차. E12.5 마우스 배아는 표준 절차에 따라, 6 H 4 %의 paraformaldehyde에 집중 - 고정 염분 인산 버퍼로 3 번 씻어과 자당로 치료했다. 20 μm의의 Cryosections는 그라 이오 스탯과 함께 찍은 사진과 섹션은 표준 절차에 따라 ¹¹ immunhistochemical 얼룩에 대한 처리되었습니다. 섹션 도자기는 이후 세포 핵의 국산화에 대한 Hoechst으로 표시. 참고지느러미 루트 ganglionic 뉴런은 잘하고 Islet-1/2-positive의 준비 절차는 격리 절차에서이 조직 부분을 제외 B :. E12에서 분류 섬 - 1 / 2 (빨강, 화살표) dissociated 요추 척수 세포. 5 배아, 왼쪽 - 전에 오른쪽 - 렉틴 기반 preplating 후. 세포는 모든 세포 핵을 시각화하기 위해 Hoechst와 counterstained되었습니다 C :. 렉틴 기반 preplating 전후 Islet-1/2-positive 세포의 부량 D :. 문화 한 다음날 E12.5 배아에서 Nkx6.1 분류 motoneurons가. 세포는 모든 핵 cisualieze에 Hoechst와 counterstained되었습니다. 모든 세포의 90 %가 긍정적인 Nkx6.1됩니다. 약어 : SC : 척수, MN : motoneuron, DRG : 지느러미 루트 신경절.

그림 4 E12.5 마우스 motoneurons의 Characterisation A와 B :.. 농축은 요추 척추 motoneurons이 체외 0 일 (0div)와 체외 (2div)에서 일 2 p75 ^NTR을 표현 E12.5 마우스를 고립. 전지는 4 % paraformaldehyde로 고정하고 그후 표준 절차에 따라 p75 ^NTR을 위해 얼룩되었습니다. 세포는 모든 핵을 시각화하기 위해 Hoechst를 사용하여 counterstained되었습니다 C는 :. 농축 motoneurons 문화 기판과 같은 포르노 - H 및 laminin에 대한 시험 관내 (5div) 5 일 후 및 β - III - tubulin에 대한 CNTF 자국의 존재 인치 세포가 긴 neurites을 성장주의와 더 이상 하나 (분기) 프로세스와 하나 이상의 짧은 프로세스 (axons과 dendrites)로 전형적인 motoneuron의 형태를 표시합니다. 약어 : MN : motoneuron; 사업부 : 체외에서 일.

표 1. 특히 이런 목적을 위해 3 가지 격리 절차의 단계 E12.5에서 마우스 배아 motoneurons에 대한 대표적인 고립 절차 요약. 결과는 총 숫자 또는 백분율 번호 ± SD로 제공됩니다. 약어 : SC : 척수, SD : 표준 편차.

표 2. 렉틴과 기반 및 p75 기반 ^한 패닝 motoneuron 셀 번호의 비교. 결과는 백분율 숫자 ± SD로 제공됩니다.

이 렉틴과 기반 preplating 기법의 장점은 p75 ^NTR 기반 패닝 절차보다 비싼 것이 있으며, 렉틴는 항체보다 더 안정적입니다. 농축는 그림에 나와있는. 2 탭. 절차는 세포의 유사한 숫자의 정화 수 있으며 이러한 세포의 과반수는 것을 보여주는 하나의 motoneuron 마커 섬 - 1 / 2 표현한다. 가장 중요한 단계는 요추 척수에 대한 격리 절차입니다. meninges과 DRGs (그림 2) 제거하면 렉틴 기반 preplating하여 다음 정화 절차 필수적입니다. 이것이 제대로 관리되고있다면, 거의 모든 세포는 (대표 사진 그림을 참조하십시오. 3a를) p75 ^NTR을 표현. 섬 - 1 / 2의 표현과 p75 ^NTR 가장 분명 차이에 대한 이유는 허리 motoneurons가 differentially 섬 - 1 / 2 ^10보다 높은 낮은 수준을 표현하기 때문에. 우리가 긍정 대 부정적인 세포 (Tab. 1)에 대하여 엄격한 것처럼 섬 - 2분의 1 표현의 낮은 수준의 경우 이것은 immuncytochemical 얼룩과 후속 계산에서 우리의 주목을 탈출 할 수도 있습니다. 또한, 표 1은 분명히 세포가 레스터 손상되었음을 나타냅니다 겨우 몇 trypan 블루 긍정적인 세포가로 분리된 세포가 건강한 상태에있는 절차를 생존 것을 보여줍니다. 이 바꾸는 절차는 또한 배아 생쥐에서 혼합 유전자형의 새끼의 단일 배아 따라서에서 motoneurons의 고립 수 있습니다. 결론적으로, p75 ^{NTR 항체 6} 패닝 절차이 대안이 비슷한가 없다면 동일한 용량을 가능한 응용 프로그램 범위의 관점에서 마우스 배아 motoneurons을위한 저렴하고 효율적인 대안 정화 방법을 제공합니다.

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 우수 기술 지원 산드라 Bargen 감사합니다. 이 작품은 단백질 연구 부서 (PRD, TP A1.2 (RC와 TS), 그리고 문질러 연구 좋아, Rektoratsprogramme에 의해 지원되었다 -. wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) 단클론 항체 39.4D5와 F55A10이 발달 연구 하이 브리 도마에서 얻은되었습니다 은행 (DSHB, 아이오와시, IA).

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