Lectina a base di isolamento e la coltura del mouse motoneuroni embrionali

Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. J. Vis. Exp. (55), e3200, doi:10.3791/3200 (2011).

Motoneuroni spinali sviluppare verso postmitotic ai primi stadi dello sviluppo embrionale del sistema nervoso e, successivamente, crescono dendriti e degli assoni. Neuroepiteliale cellule del tubo neurale che esprimono Nkx6.1 sono le cellule precursore unico per motoneuroni spinali ^1. Anche se motoneuroni postmitotic verso la loro posizione finale e si organizzano in colonne lungo il tratto della colonna vertebrale ^2,3. Più del 90% di tutti questi motoneuroni differenziata e posizionata esprimere i fattori di trascrizione Islet 1 / 2. Essi innervano i muscoli degli arti così come quelli del corpo e gli organi interni. Tra gli altri, i motoneuroni tipicamente esprimono il recettore ad alta affinità per il fattore neurotrofico cervello derivato (BDNF) e neurotrofina-3 (NT-3), la tropomiosina legate chinasi B e C (TrkB, TRKC). Essi non esprimono la tropomiosina legati chinasi A (TrkA) ^4. Accanto ai due recettori ad alta affinità, motoneuroni non esprimono il recettore a bassa affinità neurotrofina p75 ^NTR. La p75 ^NTR può legare tutte le neurotrofine con simile affinità, ma inferiore a tutte le neurotrofine che i recettori ad alta affinità che legano le neurotrofine maturo. All'interno del midollo spinale embrionale, la p75 ^NTR è esclusivamente espressa dal motoneuroni spinali ^5. Questo è stato utilizzato per sviluppare tecniche di isolamento dei motoneuroni per purificare le cellule dalla stragrande maggioranza delle cellule circostanti ^6. Motoneuroni isolando con l'ausilio di anticorpi specifici (panning) contro il dominio extracellulare di p75 ^NTR si è rivelato essere un metodo costoso come la quantità di anticorpi utilizzati per un singolo esperimento è alta a causa delle dimensioni del piatto usato per il panning. Un'alternativa molto più economica è l'uso di lectina. Lectina è stato dimostrato che si legano specificamente a p75 ^NTR pure ^7. Il metodo che segue descrive una tecnica alternativa utilizzando agglutinina germe di grano per una procedura preplating invece che l'anticorpo p75 ^NTR. La lectina è un'alternativa estremamente economico per l'anticorpo p75 ^NTR ed i gradi di purificazione con lectina è paragonabile a quella degli anticorpi p75 ^NTR. Motoneuroni del midollo spinale embrionale può essere isolata da questo metodo, sopravvivere e crescere i neuriti.

Per i reagenti speciali: vedi tab. 1. Tutti gli altri reagenti elencati sono in grado di qualità di colture cellulari ottenute da Sigma Aldrich.

1. Rivestimento PORN-H/laminin di piatti / coprioggetto

1. Preparare la soluzione di lavoro di 0,5 mg / ml Poly-DL-ornitina bromidrato (PORN-H) in 150 mM pH tampone borato 8,35.
   1. Una soluzione madre di 50 mg PORN / 1 ml di tampone borato possono essere preparati in anticipo e conservati a -20 ° C.
2. Sterilizzare coprioggetto di vetro mediante esposizione alla fiamma in 100% di etanolo e lasciarli asciugare all'aria.
3. Coprire la superficie con sufficiente PORN-H notte a 4 ° C.
4. Il giorno dopo lavare tre volte con acqua sterile e asciugare coprioggetto.
5. Preparare la soluzione di lavoro di 2,5 mg / ml in laminina HBSS
   1. Aliquote possono essere conservati a -20 ° C. Scongelare a 4 ° C immediatamente prima dell'uso.
6. Coprire la superficie del PORN-H rivestite copri con la soluzione di laminina e lasciarli incubare per almeno 2 ore a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.

2. Lectina rivestimento della piastra di depurazione

1. Preparare una soluzione di 10 mM Tris in acqua sterilizzata, pH 9.5.
2. Aggiungi lectina (risolvere la lectina (Sigma L9640) in polvere in HBSS) ad una concentrazione finale di 10 mg / ml.
3. Ricoprire la superficie di un piatto di 10 centimetri coltura cellulare con 8 ml di soluzione di lectina e lasciarlo incubare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
4. Lavare la piastra tre volte con HBSS e conservare in HBSS fino al momento dell'uso.
5. Preparare un 30mm KCl, 0,8% (w / v) di NaCl depolarizzazione-soluzione. Sterilizzare per filtrazione e conservare a temperatura ambiente (RT).

3. Motoneuroni terreno di coltura

1. Scongelare cavallo siero notte a 4 ° C e inattivare a 55 ° C per 30 minuti, aliquote in 5 ml e conservare a -20 ° C. Aliquota Scongelare prima dell'uso direttamente a temperatura ambiente.
2. Conservare B27-supplemento aliqouts in 1 ml a -20 ° C. Scongelare B27 supplemento a RT immediatamente prima dell'uso. Evitare cicli di gelo e disgelo.
3. Glutamax aliquotare in aliquote da 0,5 ml e conservare a -20 ° C e usarlo a 1:100.
4. Preparare una soluzione stock di 10 mg / ml CNTF in acqua sterilizzata con 0,1% di BSA. Conservare a -20 ° C.
5. Mix 46 di media neurobasal ml con 2,5 ml di siero di cavallo, 1 ml B27-integrazione e di 0,5 ml glutamax direttamente prima dell'uso.
6. Aggiungi CNTF a una concentrazione finale di 10 ng / ml media e pre-riscaldare medio a 37 ° C.

4. Dissezione del midollo spinale

1. Sacrifica un E12.5 il mouse in gravidanza e rimuovere gli embrioni con attenzione. Aggiungi sufficiente RT HBSS per coprire completamente gli embrioni.
2. Togliere la testa e la coda e posto nella parte posteriore dell'embrione con le membra divaricate.
3. Fissare l'embrione con una pinza e togliere la pelle esterna con le pinze altri.
4. Togliere il midollo spinale forando la pinza sotto di essa e sollevarlo con sega movimenti simili su entrambi i lati del midollo spinale.
5. Trasferire il midollo spinale isolato di un nuovo piatto con HBSS e aprire il canale centrale del midollo spinale sul lato dorsale.
6. Rimuovere i gangli spinali, rimuovendo le meningi allegando del midollo spinale.
7. Raccogliere le parti lombare del midollo spinale di un massimo di 6 embrioni per piastra lectina in una provetta eppendorf riempito con 1 ml HBSS e memorizzare su ghiaccio fino a quando la preparazione è fatto.

5. Arricchimento dei motoneuroni da lectina-based di purificazione

Nota: Prima di avviare le fasi successive, l'ultima qui preparare e preriscaldare il supporto (si veda il punto 3.)

1. Preparare una soluzione di tripsina, risolvendo 1 g tripsina in 100 ml di HBSS, conservare a -20 ° C e scongelare a 4 ° C.
2. Mix 1g tripsina inibitore HBSS con 98 ml e 2 ml di 1 M HEPES pH 7.4, 1 ml aliquote deve essere conservato a 4 ° C.
3. Trasferire la provetta con il midollo spinale di un cappuccio di coltura cellulare e rimuovere con attenzione 700 microlitri della HBSS.
4. Aggiungere 7,5 ul di soluzione tripsina e mescolare con cura capovolgendo la provetta.
5. Eseguire trypsination per 8 minuti a 37 ° C.
6. Arrestare la reazione aggiungendo 30 microlitri inibitore della tripsina e pipettare su e giù (triturare) attentamente 10-15 volte con la punta della pipetta 1000 microlitri fino aggregati di cellule non più visibili. Ripetere la triturazione con una pipetta 2-20 microlitri e la punta corrispondente.
7. Pipettare la soluzione della cella in HBSS pieno piastra lectina e disperdere le cellule ruotare delicatamente il piatto.
8. Mantenere la piastra lectina per 60 min a RT su un senza vibrazioni. Coprirla per evitare contaminazioni.
9. Rimuovere il HBSS molto delicatamente e lavare accuratamente la piastra 4 volte con la pre-riscaldato HBSS per rimuovere frammenti di cellule e le cellule non collegato / separati.
10. Subito dopo il lavaggio scorso, aggiungere 500 ul di soluzione depolarizzazione alla piastra e lasciarlo incubare per 1 min.
11. Facilitare il distacco delle cellule lectina legato agitando etoccando la piastra.
12. Riempire il piatto con 2 ml preriscaldata terreno di coltura e trasferimento in un tubo da 15 ml falco.
13. Contare il numero di cellule con una camera di conteggio Neubauer.
14. Piastra la cella i coprioggetti laminina rivestiti o piastre in un numero adeguato a seconda dell'applicazione.
15. Effettuare uno scambio di media al giorno 1 e successivamente ogni due giorni per la sostituzione attento del 50% del mezzo vecchio. Usare sempre pre-riscaldato, media preparate nuova cultura.

6. Rappresentante dei risultati:

Motoneuroni embrionali possono essere ottenute da embrioni di topo a E12 a E14. 2-3% della popolazione totale di cellule del midollo spinale lombare consiste in motoneuroni e come i neuroni spinali gangliari sono p75 ^NTR-positivi e, è importante per sbarazzarsi di queste cellule prima di iniziare la lectina procedura basata preplating ( per una panoramica si veda la Figura 1 e Figura 2). In secondo luogo, le meningi includono cellule fortemente dividendo che dovrebbe essere escluso come pure, in quanto non possono essere adeguatamente rimossi dal lectina procedura basata preplating (Figura 2 e Figura 3). Nel peggiore dei casi, queste cellule possono proliferare le piastre di coltura. Le immagini rappresentative della Figura 3B e 3D anche dare un'idea circa la bassa densità cellulare dopo aver lavato le procedure sono state eseguite (vedere il punto 5,9 del protocollo). Culture dei motoneuroni embrionali di topo sono di solito mantenuti per un massimo di cinque o sette giorni. Durante questo periodo le cellule stabilire la loro neuriti fino ad una lunghezza massima (Figura 4). Lunghezza dei neuriti fortemente dipende dal substrato sui piatti ^8. Il substrato tipico è la laminina, che è rivestito su PORN-H piatti cultura coperto. Motoneuroni possono crescere anche su altri substrati o meno definite, come matrice extracellulare generato da lisi acqua ^8. In caso di sub-ottimale rivestimento, lunghezza dei neuriti e cono area di crescita sono diminuiti e la morte delle cellule di solito aumenta. Supporto trofico gioca un ruolo cruciale per la sopravvivenza dei motoneuroni embrionali di topo in coltura. Sopravvivenza delle cellule inizialmente placcato in calo di sette giorni al 10% al 20% senza il supporto trofico ^6. Fattore neurotrofico cervello derivato (BDNF) e di fattore neurotrofico ciliare (CNTF) sono i fattori più comunemente usati, ma altri possono favorire la sopravvivenza e [fattore inibente la leucemia (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF ), Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) ^9].

Figura 1. Schema di flusso per la preparazione dei motoneuroni embrionali di topo. Il disegno schematico illustra le diverse fasi per l'isolamento e la coltura dei motoneuroni embrionali di topo. Abbreviazioni: SC: midollo spinale; HBSS: soluzione salina Hanks equilibrato; MN: motoneuroni.

Figura 2 isolamento della parte lombare del midollo spinale da E12.5 il mouse A:.. E12.5 embrione di topo. Per il prossimo passo, la testa e la coda sono stati rimossi e il corpo è posto in una dorsale-up posizione B: embrione in una dorsale-up di posizione. Pinze a sinistra ea destra del midollo spinale sono di fissaggio del corpo dell'embrione nella sua posizione. Una delle pinze viene successivamente utilizzato per tagliare la pelle e tagliare sotto il midollo spinale viene usato l'altro per fissare l'embrione nella sua posizione C:. Isolata del midollo spinale da E12.5 embrione di topo. Le parti del midollo spinale (cervicale, dorsale, lombare) sono indicati. Il midollo spinale è circondato dalle meningi e parte dei gangli spinali ancora allegare ad essi. D: Il midollo spinale è tagliato longitudinalmente sul lato dorsale per aprirla verso il canale centrale E:. Le meningi sul lato ventrale sono ora decollato dal midollo spinale appiattito. Nota: Anche se tolto, la parte lombare è segnato da un piccolo taglio F:. Solo la parte lombare della colonna vertebrale viene poi data per ulteriori procedure.

Figura 3 Determinazione e l'isolamento di isole pancreatiche positive le cellule dal midollo spinale lombare E12.5 di embrioni di topo A:.. Il Islet-1 / 2 anticorpo marca le colonne dei motoneuroni nel midollo spinale lombare embrionale (rosso, freccia) e le etichette Hoechst tutti nuclei all'interno della sezione. Sezione di un cavo di E12.5 Lumar spinale. E12.5 embrioni di topo sono state immersione fissate in 4% paraformaldeide per 6 ore, lavate 3 volte con PBS e trattati con saccarosio secondo le procedure standard. Criosezioni di 20 micron sono state scattate con un criostato e le sezioni sono state gestite per la colorazione immunhistochemical secondo le procedure standard ^11. Il software sezioni successivamente etichettati con Hoechst per la localizzazione dei nuclei delle cellule. Si noti chei neuroni spinali gangliari sono Islet-1/2-positive come bene e che la procedura di preparazione esclude questo parti di tessuto dalla procedura di isolamento B:. Islet-1 / 2 etichettati (rosso, freccia) dissociate le cellule del midollo spinale lombare da E12. 5 embrioni, a sinistra - prima e destra - dopo lectina-based preplating. Le cellule sono state di contrasto con Hoechst per visualizzare tutti i nuclei delle cellule C:. Quantificazione di cellule Islet-1/2-positive prima e dopo la lectina basato preplating D:. Nkx6.1 motoneuroni etichettati da E12.5 embrioni dopo una giornata di cultura. Le cellule sono state di contrasto con Hoechst cisualieze a tutti i nuclei. Si noti che il 90% di tutte le cellule sono Nkx6.1 positivi. Abbreviazioni: SC: midollo spinale; MN: motoneurone; DRG: gangli delle radici dorsali.

Figura 4 Caratterizzazione delle E12.5 motoneuroni del mouse A e B:.. Arricchito isolato E12.5 il mouse lombare motoneuroni spinali esprimere p75 ^NTR a 0 giorni in vitro (0div) e il giorno 2 in vitro (2div). Le cellule sono state fissate con paraformaldeide 4% e successivamente colorati per p75 ^NTR secondo le procedure standard. Le cellule sono state di contrasto con Hoechst per visualizzare tutti i nuclei C:. Motoneuroni Arricchito dopo 5 giorni in vitro (5div) su PORN-H e la laminina come substrati cultura e alla presenza di macchie CNTF per β-III-tubulina. Si noti che le cellule sono cresciute le neuriti lungo e visualizzare la morfologia tipica dei motoneuroni con uno più lungo (ramificata) di processo e uno o più processi più brevi (assoni e dendriti). Abbreviazioni: MN: motoneurone; div: giorni in vitro.

Tabella 1. Sintesi delle procedure di isolamento rappresentante per motoneuroni embrionali di topo da stadio E12.5. Risultati da 3 diverse procedure di isolamento appositamente per questo scopo sono dati come il numero totale o numeri percentuale ± SD. Abbreviazione: SC: midollo spinale; SD: deviazione standard.

Tabella 2. Risultati Confronto di lectina-based e p75-based ^{1 I} numeri dei motoneuroni panning cellulare. Sono dati come numeri percentuali ± SD.

Il vantaggio di questa tecnica basata lectina preplating è che è meno costoso del ^NTR a base di p75 procedura di panning, e la lectina è più stabile di anticorpi. L'arricchimento elencati nella fig. 2 e tab. 1 mostra che la procedura consente alla purificazione di un numero simile di cellule e che la maggior parte di queste cellule esprimono il marcatore motoneuroni Islet-1 / 2. La fase più critica è la procedura di isolamento per il midollo spinale lombare. Rimuovendo le meningi e il DRG (Fig. 2) è essenziale per la procedura di purificazione seguenti lectina-based preplating. Se questa è stata gestita correttamente, quasi tutte le cellule esprimono la p75 ^NTR (per quadro rappresentativo vedi fig. 3a). Il motivo della differenza tra l'espressione di Islet-1 / 2 e p75 ^NTR è più probabilmente perché motoneuroni lombari differenziale esprimere livelli superiori e inferiori di Islet-1 / 2 ^10. In caso di bassi livelli di Islet-1 / 2 questa espressione potrebbe essere sfuggito la nostra attenzione nella colorazione immuncytochemical e contando successive come siamo stati rigorosi rispetto a cellule positive rispetto al negativo (Tab. 1). Inoltre, la tabella 1 mostra chiaramente che le cellule isolate sopravvivere alla procedura in una condizione di buona salute, in quanto vi sono solo poche cellule positive trypan-blu che indicano che le cellule sono irreversibilmente danneggiate. Questa procedura consente anche alterative isolamento dei motoneuroni da embrioni singolo e quindi di cucciolate genotipo misti dai topi embrionale. In conclusione, questa alternativa alla procedura panning con l'anticorpo p75 ^{NTR 6} ha capacità simili se non identici, in termini di campi di possibile applicazione e fornisce un metodo economico ed efficiente alternativa per la purificazione motoneuroni embrionali di topo.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamo Sandra Bargen per un eccellente supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal reparto di ricerca Protein (PRD, TP A1.2 (RC e TS), e la ricerca RUB Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) Gli anticorpi monoclonali 39.4D5 e F55A10 sono stati ottenuti da studi sullo sviluppo Ibridoma Bank (DSHB, Iowa City, IA).

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