Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten

1. Isolation von Primär-kultivierten humanen Fibroblasten normaler Brustdrüse

Experimentelle Verfahren zur Isolierung von primären kultivierten humanen normalen Mamma Fibroblasten sind in Abb. dargestellt. 1A.

1. Bereiten Sie die Zelle Dissoziationspuffer, wie zuvor beschrieben ^12: Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), Penicillin-Streptomycin (200 Einheiten / ml), Kollagenase Typ I (1 mg / ml) und Hyaluronidase ( 125 Einheiten / ml).
2. Waschen Sie die Brustgewebe eine Reduzierung mammoplasty (~ 0,5 Gramm) mehrmals in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) seziert. Mince das Gewebe in kleine Fragmente (<1,5 mm ³⁾ mit sterilen Rasierklingen.
3. Übertragen Sie die Gewebeteile in einem 15 ml konischen Röhrchen mit einer entsprechenden Menge der obigen Zelle Dissoziation Puffer (10 ml pro 0,5 Gramm Gewebe) und Vortex für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit.
4. Digest die Gewebestücke in der Zelle Dissoziationspuffer foder 12-18 h bei 37 ° C unter langsamem Rühren. ^* Hinweis, dass es noch viele Stücke von unverdauten Gewebeteilen übrigen in die Röhre.
5. Inkubieren Sie die Röhrchen 5 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Übertragen Sie die daraus resultierenden Stromazellen angereicherte Überstand in ein neues konisches Rohr mit einer 5 ml serologische Pipette.
6. Centrifuge der stromalen Fraktion für 5 min bei 250 X g und Zellpellet in PBS. Zentrifuge erneut für 5 min bei 250 X g und Zellpellet in DMEM mit 10% FCS. Kultur der Zellen in DMEM mit 10% FCS in einer 15 cm Petrischale bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid.
7. Propagieren der Zellen bis zur Konfluenz. Es dauert in der Regel 8-10 Tage. Lagern Sie die Zellen bei -80 ° C mit Einfriermedium (10% Dimethylsulfoxid und 20% FCS in DMEM). Bereiten Sie 5 Frozen Fläschchen als Original verfügbar. Tauwetter ein Fläschchen und erweitern Sie die Zellen zu 5 Ampullen für die sekundäre Lager mit Fibroblasten passagiert Vorbereitung innerhalb von 5 BevölkerungVerdopplungen (PDS) für die nachfolgenden Experimente. Diese Verfahren minimieren klonale Selektion und Kultur betont werden, dass bei längeren Gewebekultur auftreten könnten. ^* Beachten Sie, dass P1.1-7 kann auch zur Isolierung von CAF von Mammakarzinomen durch eine Brustamputation ¹² erhalten werden.

2. Generierung von GFP-markierten, Puromycin-resistente, immortalisierten humanen normalen Mamma Fibroblasten

1. Um unsterblich zu den primären humanen normalen Mamma Fibroblasten in P1.7 isoliert), die Einführung einer retroviralen pMIG (MSCV-IRES-GFP) Vektor ^12, Ausdruck sowohl hTERT und GFP. Kultur der Zellen für 4-5 Tage und dann sortieren Sie die GFP-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie.
2. Einführung eines retroviralen pBABE-puro Konstrukt, das eine Puromycin-Resistenz-Gen in die GFP-markierten verewigt Fibroblasten. Kultur der Zellen für 5-7 Tage in Gegenwart von Puromycin (Endkonzentration: 1 pg / ml) zur Isolierung des GFP-positive (GFP +), Puromycin-resistente (puro ^R
3. Als nächstes zu prüfen, ob diese Fibroblasten aktiven Viren, die den horizontalen Transfer von Genen, GFP und Puromycin Resistenz führen, wachsen kann 2.5x10 ⁵ GFP + puro ^R immortalisierten humanen Mamma-Fibroblasten in einer 6 cm Petrischale für 2 Tage. Produzieren
4. Filtermedium durch diese Fibroblasten mit einer Spritze (Porengröße: 0,45 um) konditioniert und fügen Sie ihn auf 10T1 / 2 Maus Fibroblasten-Zellen für 12h in Anwesenheit von Protaminsulfat (5 pg / ml), die Effizienz der Virus-Infektion erhöht. Das Medium wird dann auf 10% FCS-DMEM für weitere 2 Tage gewechselt.
5. Die Zellen werden durch ein Fluoreszenz-Mikroskopie. 10T1 / 2 Zellen durch GFP-Virus infiziert wird GFP-positiv. Gönnen auch Sie die Zellen mit Puromycin (1 pg / ml) für 5-7 Tage und beobachten Sie die Platte, wenn eine puro ^R 10T1 / 2 Zellen vorhanden und bilden Kolonien nach dem Puromycin-Behandlung sind.
6. Beachten Sie, dass die horizontalen Gen-tranSFER von aktiven Viren durch den elterlichen GFP + puro ^R menschlichen Brustdrüse Fibroblasten könnte den umliegenden murine Zellen und / oder Karzinom-Zellen GFP + puro ^R innerhalb Tumorxenotransplantaten. Dies kann zu behindern den Prozess der Isolierung der ursprünglich injizierten GFP + puro ^R menschlichen Brustdrüse Fibroblasten aus dem Tumorxenotransplantaten.

3a. Koinjektion der menschlichen Brustdrüse Fibroblasten mit Mammakarzinom-Zellen in einem immundefizienten Maus

Experimentelle Verfahren zur Erzeugung von exp-CAF sind in Abb. dargestellt. 1Ba.

1. Mix 1x10 ⁶ MCF-7-ras menschlichen Brustkrebszellen und 3x10 ⁶ GFP ⁺ puro ^R, immortalisierten humanen Mamma-Fibroblasten in P2.2 generiert). Bereiten Sie die Zellen in 400 ul Kulturmedium mit 50% (v / v) Matrigel pro Injektion.
2. Spritzen Sie die Zelle Mischung subkutan in eine immundefizienten Nacktmaus. Wenn CAF sind unabhängig von verschiedenen extrahiertTumoren, Implantat jeder Mischung in rechte und linke Flanke von mehreren Mäusen.

3b. Die Injektion von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten in einer immundefizienten Maus

1. So generieren Kontrolle Fibroblasten gegen exp-CAF, bereiten 3x10 ⁶ GFP ⁺ puro ^R immortalisierten humanen Mamma-Fibroblasten in P2.2 in 400 ul Kulturmedium generiert mit 50% (v / v) Matrigel pro Injektion (Abb. 1Bb). Mischen Sie die Fibroblasten mit Karzinomzellen.
2. Implant die Fibroblasten in P3b.1 in subkutanes Websites von Nacktmäusen vorbereitet.

^* Beachten Sie, dass die geimpften Fibroblasten werden die Fibroblasten Gewebe, aber nicht Tumor unter der Haut bilden.

4a. Präparation Tumorxenotransplantates

1. Einschläfern mit der Maus beherbergt eine subkutane menschliche Brustkrebszellen Xenograft 42 Tage nach der Implantation (Abb. 1Ba). ^* Beachten Sie, dass, wenn andere Karzinom-Zellen und / oder Fibroblasten coimplanted sindKann Fibroblasten müssen länger als 42 Tage innerhalb der Tumorxenotransplantates inkubiert werden, um ihre myofibroblastischer Phänotyp initiieren.
2. Ernten Sie die Tumorxenotransplantates von der Flanke der Maus durch stumpfe Präparation mit einer Pinzette und Schere. Tauchen Sie das Tumorgewebe in PBS.

4b. Dissection von Fibroblasten Xenograft

1. Einschläfern mit der Maus beherbergt die Fibroblasten-Xenograft 42 Tage nach der Implantation (Abb. 1Bb).
2. Präparieren Sie die subkutane Fibroblasten Xenograft mit einer Pinzette und Schere. Legen Sie die Fibroblasten Gewebe in PBS. ^* Beachten Sie, dass eine Fibroblasten-Xenograft, die als winzige durchsichtige Gewebe erscheint, kann schwierig sein, unter der Haut zu finden.

5. Herstellung von primären Zellkulturen aus Xenotransplantate

1. Verwenden Sie eine sterile Biosicherheitswerkbank, um den Tumor (~ 0,5 Gramm) oder Fibroblasten Gewebe (~ 0,1 Gramm) zu sezieren. Übertragen Sie die herausgeschnittenen Gewebe auf der Spitze eines 15 cm Kultur dish mit 1 ml PBS. Mince das Gewebe in kleine Gewebestücke (<1,5 mm ³⁾ mit sterilen Rasierklingen. * Beachten Sie, dass, wenn die Fibroblasten-Xenograft wiegt weniger als 0,1 Gramm, sammeln ein paar zusätzliche Fibroblasten Xenotransplantate und mischen sie zusammen, um die Anzahl der Zellen für die Isolierung zu erhöhen.
2. Übertragen Sie die Gewebeteile in einem 15 ml konischen Röhrchen mit der Zelle Dissoziation Puffer (10 ml pro 0,5 Gramm Gewebe) und Vortex für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit.
3. Inkubieren Sie die Zellsuspension für 3 h bei 37 ° C mit kontinuierlichem langsamem Rühren.

6. Isolation von Puromycin-resistente Zellen in Kultur

1. Centrifuge der Zellsuspension dissoziiert entweder aus Tumor-oder Fibroblasten-Xenograft für 5 min bei 250 X g und Zellpellet in PBS. Zentrifuge erneut für 5 min bei 250 x g. Resuspendieren resultierende Zellpellet in 10% FCS-DMEM. Kultur der Zellen in einer 15 cm Petrischale in Gegenwart von Puromycin (1 pg / ml) bei 37 ° Cund 5% Kohlendioxid in Ordnung zu beseitigen jede Verunreinigung Karzinomzellen und / oder murinen Stromazellen. Propagieren der Zellen bis zur Konfluenz (2-4 Wochen). Lagern Sie die Zellen bei -80 ° C mit Einfriermedium. * Beachten Sie, dass die daraus resultierenden puro ^R-Zellen, bezeichnete 42-Tage alten exp-CAF1 (Abb. 1Ba) oder Kontroll-Fibroblasten-1-Zellen (Abb. 1Bb), sind unsterblich und positiv für GFP. Es wird empfohlen zu prüfen, ob diese Zellen aktiv Viren produzieren mit 10T1 / 2 Zellen, wie in P2.3-6 beschrieben.

7a. Isolierung von exp-CaF2-Zellen in Kultur

Zur weiteren Stärkung der aktivierten myofibroblastischer Phänotyp der CAF, mischen Sie die 42-Tage alten exp-CAF1 Zellen mit MCF-7-ras-Zellen und injizieren sie wieder subkutan in einer Nacktmaus für einen weiteren Zeitraum von 200 Tagen. Sezieren und distanzieren die Tumorxenotransplantates in einen Ein-Zell-Suspension und Kultur der Zellen in einer 15 cm Petrischale mit 10% FCS-DMEM in Gegenwart von Puromycin (1 pg / ml), wie in P6 angegeben.1. Propagieren der Zellen bis zur Konfluenz (8-10 Tage). Lagern Sie die Zellen bei -80 ° C mit Einfriermedium. Die daraus resultierende puro ^R-Zellen genannt 242-Tage alten exp-CaF2-Zellen (Abb. 1Ba).

7b. Extraction der Kontrolle Fibroblasten-2-Zellen in Kultur

So generieren Kontrolle Fibroblasten gegen exp-CaF2 Zellen injizieren 42-Tage alten Kontrolle Fibroblasten-1-Zellen allein ohne Karzinom-Zellen subkutan in einer Nacktmaus zusätzlich für 200 Tage. Sezieren und distanzieren die Fibroblasten Gewebe in einer einzigen Zellsuspension und Kultur der Zellen in einer 15 cm Petrischale mit 10% FCS-DMEM in Gegenwart von Puromycin (1 pg / ml) als in P6.1 angezeigt. Propagieren der Zellen bis zur Konfluenz (3-4 Wochen). Lagern Sie die Zellen bei -80 ° C mit Einfriermedium. Die daraus resultierende puro ^R-Zellen genannt Kontrolle Fibroblasten-2-Zellen (Abb. 1Bb).

8. Repräsentative Ergebnisse:

Control-Fibroblasten-2 und exp-CaF2 cells, die von der Brust Tumorxenotransplantaten extrahiert wurden, gebeizt stark positiv für mesenchymale Marker, einschließlich der menschlichen spezifischen Vimentin, Prolyl-4-Hydroxylase, Kollagen 1A, Fibronektin, S100A4 und Fibroblasten Oberflächenprotein (Abb. 2A) ^11, was darauf hinweist menschlichen Herkunft und mesenchymalen Natur dieser Zellen. Im Gegensatz dazu war die Zytokeratin, einem Marker für Epithelzellen, nicht in diese GFP ^{+-Fibroblasten} (Abb. 2B) angefärbt. Diese Ergebnisse schlagen daher vor, dass die extrahierten exp-CaF2 und Kontrolle Fibroblasten-2-Zellen wurden aus dem elterlichen menschlichen Brustdrüse Fibroblasten zunächst in der Maus Xenotransplantate eingeführt hatten.

Wichtig ist, befleckt einen höheren Anteil an exp-CaF2-Zellen für α-SMA und extrazellulären Matrix-Glykoprotein Tenascin-C ^5, die beide Marker für Myofibroblasten im Vergleich zum 42-Tage alten exp-CAF1 und Kontrolle Fibroblasten-2-Zellen (Abb. sind positiv . 2C, D) ^11. Diese Daten zeigen an, dass Resident menschlichen Brustdrüse FIBRoblasts schrittweise in CAF Myofibroblasten in Tumorxenotransplantaten entwickeln.

Abbildung 1 Schematische Darstellung der Isolation der menschlichen Brustdrüse Fibroblasten. A) Die Reduzierung mammoplasty Gewebe wurde zerkleinert mit sterilen Rasierklingen (P1.2) und in ein 15 ml konischen Röhrchen (P1.3). Der kleine Gewebestücke wurden in der Zelle Dissoziationspuffer (P1.4) verdaut und bereit für die Kultur in vitro (P1.5-7). Um unsterblich zu den isolierten primären humanen Mamma-Fibroblasten, eine retrovirale pMIG (MSCV-IRES-GFP)-Vektor, Ausdruck sowohl hTERT und GFP, eingeführt wurde, und die daraus resultierenden GFP-positive Zellen wurden sortiert mittels Durchflusszytometrie (P2.1). Eine retrovirale pBABE-puro Vektor kodierend für eine Puromycin-Resistenz-Gen wurde dann in diese Zellen eingeführt. Nach dem Puromycin-Behandlung, GFP-markierten (GFP ⁺⁾ Puromycin-resistente (Puro ^R), immortalised menschlichen Brustdrüse Fibroblasten isoliert wurden (P2.2).

Ba) zu generieren exp-CAF, verewigt GFP ⁺ puro ^R menschlichen Mamma-Fibroblasten wurden mit MCF-7-ras Brustkrebszellen subkutan in eine immundefizienten Nacktmaus (P3a) coinjected. Der Tumor Xenograft wurde 42 Tage nach der Implantation (P4a) reseziert und dissoziiert in ein Single-Cell-Suspension (P5). Diese Zellen wurden dann in vitro in Gegenwart von Puromycin kultiviert werden, um jede Verunreinigung Karzinomzellen und Maus Stromazellen (P6) zu beseitigen. Die daraus resultierende Puromycin-resistente Zellen wurden experimentell erzeugten CAF1 (exp-CAF1)-Zellen bezeichnet. Diese Zellen, die reseziert 42 Tage nach der Implantation wurden erneut gemischt mit MCF-7-ras-Zellen und subkutan in eine Host-Maus wie zuvor (P7a) implantiert. Die daraus resultierende Tumor wurde für weitere Zeiträume von jeweils 200 Tage wachsen, dann seziert, dissoziiert, und kultiviert in Gegenwart von Puromycin. Die isoliertePuromycin-resistente Zellen wurden exp-CaF2-Zellen (242-Tage alten) bezeichnet.

Bb) Kontroll-Zellen gegen exp-CAF isolieren, GFP ⁺ puro ^R immortalisierten humanen Mamma-Fibroblasten wurden subkutan in eine Nacktmaus als Reinkulturen ohne MCF-7-ras-Zellen (P3b) injiziert. Die Fibroblasten Gewebe, seziert 42 Tage nach der Implantation (P4b), wurde in den Single-Zellsuspensionen (P5) und Puromycin-resistente Zellen, benannt Kontrolle Fibroblasten-1-Zellen dissoziiert, wurden isoliert, wie oben beschrieben (P6). Diese Fibroblasten wurden noch einmal subkutan in einer Nacktmaus ohne MCF-7-ras Zellen zusätzlich für 200 Tage (P7b) implantiert. Die Fibroblasten Gewebe wurde seziert, dissoziiert, und kultiviert in Gegenwart von Puromycin. Die isolierte Puromycin-resistente Zellen wurden Kontroll-Fibroblasten-2-Zellen (242 Tage alten) bezeichnet.

Abbildung 2 (B) Im Gegensatz dazu pan-Zytokeratin, einem Marker für Epithelzellen , ist nicht in exp-CaF2-Zellen, die GFP (grün) nachgewiesen. Zellkerne sind mit 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blau) gefärbt. Scale-bar, 50 um (im Sinne von Kojima et al. ¹¹⁾

(C) Immunfluoreszenz von exp-CaF2-Zellen und Kontrolle Fibroblasten-2-Zellen (Kontrolle f.) mit Antikörpern gegen α-SMA (rot) oder Tenascin-C (TN-C) (rot). Zellkerne sind mit DAPI (blau) gefärbt. Scale-bar, 50 pm. (D) 48% der exp-CaF2-Zellen Färbung für α-SMA positiv, wohingegen 14% der 42-Tage alten exp-CAF1 und 2,5% der Kontrollgruppe Fibroblasten-2 Zellpopulationen sind für α-SMA positiv. (Bezogen von Kojima et al.11)

Das Fehlen von CAF-spezifischen Markern und das Niveau der Heterogenität beobachtet unter CAF die Charakterisierung dieses Zelltyps eine Herausforderung an sich zu machen. Studieren CAF in vitro wurde auch durch die zusätzliche Komplikation verhindert worden, dass diese Zellen und senesce stoppen proliferierenden, wenn über einen längeren Zeitraum kultiviert. Unsere erste Anlauf, direkt verewigen primäre CAF mit einem retroviralen hTERT cDNA-Konstrukt war nicht erfolgreich. Deshalb zur weiteren Untersuchung der Tumor fördernden Eigenschaften dieser Zellen entwickelten wir eine Methode, um unsterblich CAF von der menschlichen Brustdrüse Fibroblasten mit einem coimplantation Tumor Xenograft-Modell zu generieren. Primäre humane Brust-Fibroblasten, aus der Reduktion mammoplasty Gewebe extrahiert wurden, bevor sie mit Mammakarzinom-Zellen in Mäuse injiziert verewigt. Die humane Fibroblasten wurden dann aus der resultierenden Tumorxenotransplantaten (siehe Abb.. 1Ba für weitere Details) isoliert. Wichtig ist, dass das menschliche Mamma Fibroblasten vermehrt evolved in tumorpromovierende myofibroblastischer CAF im Verlauf der Tumorprogression. Wir in der Tat festgestellt, dass 242-Tage-alten exp-CaF2-Zellen eine deutlich größere tumorpromovierende myofibroblastischer Fähigkeit im Vergleich zu 42 zeigen - oder 70-Tage-alten exp-CAF1 Zellen und Kontrolle Fibroblasten-2-Zellen ^11. Solche tumorpromovierende myofibroblastischer Fähigkeit der exp-CaF2-Zellen, die auch in CAF von Brustkrebspatientinnen bereit ist zu beobachten, hängt von der Einrichtung von autokrine Signalisierung Schleifen von TGF-β und SDF-1 Zytokine ¹¹ vermittelt. Weder Gen-Transfer oder Zellfusion zwischen Karzinom-Zellen und Fibroblasten, vermittelt die Phänotypen der CAF in unserem Xenograft-Modell ¹¹ erzeugt. Zusammengenommen deuten diese Beobachtungen, dass die Xenograft-derived exp-CAF als ein nützliches Werkzeug für das Studium CAF Gegenwart in der menschlichen Mammakarzinomen dienen. Die beschriebenen experimentellen Protokoll kann auch zur Isolierung von verschiedenen CAF aus anderen Arten von humanen Karzinomen erweitert werden.