Imágenes de la adhesión de leucocitos al endotelio vascular en la presión intraluminal de alta

Michell, D. L., Andrews, K. L., Woollard, K. J., Chin-Dusting, J. P. Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure. J. Vis. Exp. (54), e3221, doi:10.3791/3221 (2011).

Hipertensión en todo el mundo, se informó que en aproximadamente una cuarta parte de la población y es el principal factor de riesgo biomédicos de mortalidad a nivel mundial. En la hipertensión vascular se asocia con la disfunción endotelial y el aumento de la inflamación que conduce a la aterosclerosis y la enfermedad de varios estados, tales como la enfermedad renal crónica ^{2, 3} accidente cerebrovascular y la insuficiencia cardiaca ^4. Un paso inicial en la inflamación vascular que conduce a la aterogénesis es la cascada de la adhesión, que consiste en el balanceo, la inmovilización, la adhesión y la transmigración de leucocitos posterior a través del endotelio. La contratación y la acumulación de leucocitos con el endotelio está mediada por una regulación al alza de las moléculas de adhesión, tales como moléculas de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1) molécula de adhesión celular intracelular-1 (ICAM-1) y E-selectina, así como el aumento de la liberación de citoquinas y quimioquinas y una regulación al alza de las especies reactivas de oxígeno ^5. Los métodos in vitro tales como ensayos de adherencia estática ayudan a determinar los mecanismos implicados en la célula a célula de adhesión, así como el análisis de moléculas de adhesión celular. Los métodos empleados en anteriores estudios in vitro han demostrado que el aumento agudo de la presión sobre el endotelio puede conducir a la adhesión de los monocitos, una regulación al alza de las moléculas de adhesión y marcadores de inflamación ⁶ Sin embargo, al igual que muchos ensayos in vitro, estos hallazgos no se han realizado en tiempo real bajo condiciones de flujo fisiológico, ni con toda la sangre. Por lo tanto, los ensayos in vivo son cada vez más utilizado en los modelos animales para demostrar la inflamación vascular y desarrollo de la placa. Microscopia intravital es ahora ampliamente utilizado para evaluar la adhesión de los leucocitos, la migración de rodadura, y la transmigración ^7-9. Cuando se combinan los efectos de la presión en los leucocitos de adhesión endotelial los estudios in vivo son menos extensas. Uno de estos estudios examina los efectos en tiempo real del flujo y de corte en el crecimiento arterial y marcadores de remodelado, pero inflamatoria sólo se evaluaron a través de inmunohistoquímica ^10. Aquí se presenta un modelo para el registro de adhesión de los leucocitos en tiempo real en los vasos sanguíneos intactos a presión con la perfusión de sangre entera. La metodología es una modificación de una ex modelo in vivo barco perfusión cámara ^9, que permite en tiempo real, análisis de las interacciones adhesivas de leucocitos del endotelio de los vasos intactos. Nuestra modificación permite la manipulación de la presión intraluminal de hasta 200 mmHg permiten estudiar no sólo bajo condiciones de flujo fisiológico, sino también las condiciones de presión. Mientras que los sistemas de presión miografía han demostrado previamente para observar la pared del vaso y la luz de diámetro ^11, así como la contracción del recipiente esta es la primera vez que demuestra los leucocitos del endotelio interacción en tiempo real. Aquí se demuestra la técnica que utiliza las arterias carótidas cosecha de ratas y se canuló a una cámara de flujo a medida acoplado a un microscopio de fluorescencia. La cámara de buque está equipado con un cubreobjetos fondo grande que permite una lente objetivo de gran diámetro con una distancia corta de trabajo a la imagen de la nave. Por otra parte, el agonista seleccionados y / o antagonistas pueden ser utilizados para investigar más a fondo los mecanismos que controlan la adhesión celular. Las ventajas de este método sobre microscopía intravital no incluyen la participación de la cirugía invasiva y por lo tanto un mayor rendimiento se puede obtener. Este método también permite el uso de tratamiento con inhibidores localizados en la embarcación deseada, mientras que sólo permite intravital tratamiento con inhibidores sistémicos.

1. Aislamiento de las arterias carótidas

1. Euthanase10 semanas de edad ratas Sprague Dawley a través de CO ₂ / O ₂ asfixia.
2. Los impuestos especiales a la izquierda y la derecha arterias carótidas comunes con la aorta y el corazón de garantizar un mínimo de estiramiento de los vasos.
3. En el hielo frío buffer Krebs separar las arterias carótidas de la aorta y el corazón y llevar a cabo la disección de cerca.
4. Mantener los vasos aislados en Krebs en el hielo antes de su montaje.

Aprox. tiempo = 45 minutos

2. Cebado de la cámara de buques

1. En los conectores proximales y distales de la cámara de recipiente tampón Krebs ras mantiene a un pH fisiológico mediante la infusión de gas carbogen (95% O _2, 5% CO ₂₎ a través del buffer a 37 ° C.
2. Asegúrese de que los tubos y cánulas se vacían por completo y están alineados.
3. Ras buffer Krebs a través de la P1 (proximal) y transductores P2 (distal). Cerrar los grifos para asegurar que no burbujas de aire en los transductores.
4. Conecte los transductores a los conectores correspondientes y una vez más al ras más tampón de Krebs asegurando que no haya burbujas de aire. Cerrar los grifos de la cámara.

Aprox. tiempo = 15 minutos

3. Presurización de la cámara de buques

1. A su vez sobre equipos a presión: la presión servo, control de la presión, la bomba peristáltica (Figura 1).
2. Con la bomba peristáltica en la presión y el motor de la presión en automático ejecutar buffer Krebs a través del tubo de 20 mm Hg (dial a 1), asegurando que no haya burbujas de aire.
3. Conecte el tubo del transductor P2 cerrado. La presión será estable.
4. Abra el grifo P2 a la cámara de recipiente para eliminar cualquier burbuja de entonces se cierra.
5. Llene la bañera con buffer Krebs (5-7 ml).

Aprox. tiempo = 10 minutos

4. Montaje de la embarcación

1. Bajo un microscopio de disección lazos lugar poliéster de color negro en cada cánula (Figura 2).
2. Mueva las cánulas y los titulares de la cánula aparte y montar vaso ¼ (aórtica final del arco) en la cánula P1. Asegúrese de no romper el barco.
3. Utilizando una jeringa llena de Krebs buffer lave cuidadosamente el exceso de sangre fuera de los vasos a través de transductor P1. Cerca de P1 a la cámara.
4. Recipiente seguro a la cánula P1 con la corbata de poliéster.
5. Mueva cánulas / los titulares de la cánula más para el montaje en la cánula P2.
6. Montaje final distal del vaso (~ ¼ de la longitud) en la cánula distal. Seguro con corbata de poliéster.

Aprox. tiempo = 20 minutos

5. Presurización de la nave

1. Ajustar los titulares de la cánula para asegurar que no doblarse o estirarse en el vaso.
2. Con P1 y P2 cerrada a la cámara de cambiar el servo de la presión de automático a manual. Compruebe la presión en el servo no hay una disminución continua de la presión dentro de los 10 segundos. Si hay una fuga que está ocurriendo y las conexiones y los transductores deben ser garantizados en su lugar.
3. Ajustar el servo de presión de nuevo a P2 automática a continuación, abra la cámara. Bajo el microscopio observe el buque se dilatan cuando el grifo está abierto a la cámara.
4. Cambiar el servo a la presión manual. Una vez más compruebe continua disminución de la presión dentro de los 10 segundos. Si hay una fuga, entonces el sistema no es a prueba de presión y no es probable que sea un agujero en el barco.
5. Volver a abrir P1 automático de la cámara. En la configuración manual de comprobar que la presión se mantiene estable.
6. Si no hay fuga, en el dial de ajuste manual de aumentar a 2 (40 mmHg).
7. Ajuste automático de la nave y observar bajo el microscopio. Si es necesario, ajustar el titular de la cánula para asegurar que no se doble en el que no haya fugas vessel.Check sobre la configuración manual.
8. Repita los pasos 5,6 a 5,7 el aumento de la línea de 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) y así sucesivamente hasta que la presión deseada.

Aprox. tiempo = 15 - 30 minutos

6. La incubación de la embarcación a presión

1. Conecte el conjunto de control de temperatura a 37 ° C.
2. Con una segunda bomba peristáltica perfusión Krebs buffer (1 ml / min) en el baño de la cámara de los buques.
3. Conecte la cámara de aspiración para asegurar que sólo la capa superior de la bañera se ha eliminado.
4. Incubar recipiente presurizado a 37 ° C durante 1 hora con la presión establecida en automático.
5. Compruebe la presión no tiene fugas (el cambio a manual) de forma periódica.
6. Los efectos de diversas intervenciones farmacológicas se puede observar mediante la simple adición del compuesto al baño durante la incubación.

Aprox. = tiempo de 1 hora

7. Perfusión del recipiente a presión con sangre entera

1. Durante la incubación obtener al menos 7,5 ml de sangre humana / buque recogidos en 40 U de heparina / ml de sangre. Incubar en un falcon de 50 ml a 37 ° C.
2. 10 minutos antes del final de tque la sangre de incubación etiqueta con VybrantDil (1:1000) durante 10 minutos a 37 ° C en la oscuridad.
3. Después de 10 minutos, recoger la sangre en una jeringa claro que las burbujas y colocar en una bomba de jeringa con una chaqueta de calor a 37 ° C.
4. Cierre transductor P1 a la cámara / buque y conectar la jeringa y tubo de drenaje.
5. Purga de sangre a 1000 l / min a través del tubo de drenaje para eliminar las burbujas.
6. Abrir P1 a la cámara. El servo de presión se ajustará automáticamente para mantener la presión deseada.
7. Perfusión de sangre a 100 l / min.
8. Utilizando un microscopio de fluorescencia acoplado a una cámara digital de registro de dos campos de la embarcación perfusión durante 15 segundos a 1, 3, 5, 7,5 y 10 minutos.
9. Integridad después de la perfusión y la función endotelial se puede evaluar a través de técnicas farmacológicas, como miografía y la expresión de moléculas de adhesión se puede determinar mediante técnicas de inmunohistoquímica para validar aún más la respuesta inflamatoria.

Aprox. tiempo = 15 minutos

8. Los resultados representativos:

Un diagrama esquemático de la configuración de la cámara de presión se muestra en la Figura 1. Con una cámara digital acoplada a un microscopio de fluorescencia resultados se pueden visualizar al instante a través de grabaciones de video en vivo. Representante imágenes de vídeo se ven en la figura 3, donde los leucocitos se consideran para ser adherente al endotelio si se mantuvo estacionario durante 10 segundos. Con grabaciones de vídeo en bucle continuo células adheridas se puede contar como un campo de media por habitante. Mientras tanto baja (Figura 3) y alto (Figura 3 B) presión provocará una cierta cantidad de adhesión de un aumento significativo en la adhesión de leucocitos a la mayor presión intraluminal se ve y esto también se demuestra cuantitativamente (Figura 4).

Figura 1. Vivo a presión ex buque de la cámara de esquema. Un buque cánula conectada a una proximal (P1) y un transductor distal (P2) que permite a los transductores de presión de la sangre para ser manipulados dentro del recipiente. La perfusión es a través del transductor de presión P1 y se mantiene a través del transductor P2.

Figura 2. Cannuala con lazos. Negro corbatas de poliéster están conectados unos con cánula.

Figura 3. Representante imágenes de vídeo. Adhesión celular dinámico (flecha roja) en fluorescencia a 80 mmHg (A) y mmHg 120 (B) después de 10 minutos de la perfusión.

Figura 4. Adhesión leucocitaria en las arterias carótidas Sprague Dawley después de 1 hora de incubación a baja (80 mmHg) y alta presión (120 mmHg). *** P <0,001, según el análisis de medidas repetidas de 2 vías ANOVA utilizando el test post hoc de Bonferroni.

Este es un método modificado para estudiar la adhesión de leucocitos con el endotelio de los vasos sanguíneos intactos aislados bajo condiciones de presión en tiempo real. La perfusión de la cámara de recipiente solo permite una rápida validación de pro-inflamatorias cepas de ratones grandes y los vasos de la rata. Permitiendo la manipulación de la presión permite interacciones dinámicas que se observan células de menor a mayor presión intraluminal muy altos, lo que mejor imitan-ción fisiológica y condiciones fisiopatológicas. Diámetro de los vasos también se puede medir con un número suficiente de células de imágenes del programa y por lo tanto, el flujo de corte y la velocidad puede ser determinada y por lo tanto, manipulado.

Con sus capacidades de miografía, las intervenciones farmacológicas colocado en el baño de añadir otra dimensión a las condiciones de posibilidad de experimentación con este modelo para realizar estudios de las vías de mecánica y de señalización. Mientras que la preservación endotelial no se puede confirmar en la manipulación de la presión, las respuestas a ACh y PE puede llevarse a cabo después de la perfusión ^9.

Cabe señalar que esta configuración se muestran los efectos de la presión intraluminal en el no de célula a célula interacciones de los efectos del flujo sanguíneo pulsátil ni sistólica o diastólica. Por otra parte, mientras que los cambios agudos en la presión de adhesión de los leucocitos se observaron, esta configuración puede ser también utilizado para observar los efectos de la presión crónica (es decir, aumentar los tiempos de incubación y el uso de un modelo de presión de los animales crónicos). Sprague Dawley arterias carótidas comunes se muestran en esta configuración, pero otras cepas y especies se pueden utilizar con los ajustes apropiados al tamaño de la cánula. De hecho, es importante tener en cuenta que la edad y el peso de los animales afectan el tamaño del vaso y por lo tanto que la instalación tiene que ser individualizada para cada embarcación. La disección minuciosa y cuidadosa del tejido conectivo pueden mejorar la visualización de los leucocitos inmensamente.

El protocolo del estudio fue aprobado por la Investigación y Educación Médica Alfred Recinto Comité de Ética Animal y el Alfred Hospital del Comité de Ética.

Este estudio fue apoyado en parte por el Programa del Gobierno de Victoria OIS, la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia subvenciones de programas y proyectos (JPF Chin-Quitar el polvo) y becas de postgrado (D Michell).

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