쥐의 척수를 다친 후에 급성 및 만성 촉각 감각 테스트

1. 위 / 아래 발바닥 폰 프라이 테스트

시험의 목적은 많은 힘이 자극의 발자국이 탈퇴를 유도하는 데 필요한 방법을 측정하여 촉각 민감도를 결정하는 것입니다. 4.56과 6.10의 범위 사이의 상용 보정 폰 프라이 헤어 monofilaments는 앞발을 자극하는 데 사용됩니다. 시각적 또는 고유 감각 입력을 바탕으로 답변에 잘못 있도록 자극이나 proprioception의 시각화와 같은 다른 감각 입력은 촉각 임계값 조치를 먹이고 있습니다. 쥐가 시리얼을 먹고있는 동안 피부를 만지고 monofilament의 시각화을 방지하기 위해, 우리는 오직 테스트합니다. 이것은 인지적 distracter는 또한 쥐가 휴식 비슷한 기준선 수준에서 검사하는 보장합니다. 오히려 촉각 입력보다 고유 감각에 의한 반응을 피하기 위해, 우리는 monofilament가 올렸거나 앞발을 이동 시련에 포함되지 않습니다.

UP-DOWN 접근법에 대한 대답 : ACCLIMATION 절차

1. 현재 과일 cerea쥐를 먹이 보상을 인식하고 추구하므로 가정 안의구나. 쥐는 gentling 또는 테스트 프로세스의 어느 시점에서 박탈 음식이 될 필요가 없습니다.
2. 쥐들은 집 안의 과일 시리얼을 먹고 나면 테스트 환경 및 절차에 acclimated받을 준비가되었습니다. Accl​​imation 각지만보다가 필요한 수 10 분 최소 4 세션을 통해 발생합니다. 10 분 세션 쥐가 세션이 끝나기 전에 만족을 했소가되지 않도록하는 데 사용됩니다.
3. 과일 시리얼 3 가지로 테스트 챔버에서 쥐를 놓습니다. 추가 과일 시리얼에게 그들이 먹는대로 한 번에 1-2를 제공합니다. 쥐이 먹는 동안 쥐가 자사의 앞발로 땅을 차다 아래의 움직임에 익숙해집니다 있도록 세 번째 세션에서 철사 바닥 아래에서 손의 움직임을 생산하고 있습니다. 네 번째 세션에서 약 한 손 발바닥 표면 열 프레 젠 테이션의 총 분 단위 5.18 monofilament를 적용합니다. 나이브 쥐이 하위 임계값 자극에 반응해서는 안됩니다.
4. 키가 큰y는 소비 시리얼 조각, 배뇨하고 깨끗하게 함, 냉동 및 정리 동작 주파수. 냉동 동작은 두 가지 방법으로 발생) 쥐가 다시 벽면 근처 보통지면에 낮게 웅크리고있는 짐승 떼거리를 봤어이나 시험관에서 떨어져 직면하고 움직이지 유지되며 B) 쥐가 새장의 중간에 이상 hunched되며 보통은 이빨을 chatters . 냉동 행동은 오랜 기간 동안 계속 사용할 수 있습니다.
5. 테스트가 준비 gentled 쥐 10 분 동안 거의 지속적으로 먹을 것입니다. 그것은 우리 안에 쉽게 이동하고 마지막을 소모 후 매우 빨리 과일 시리얼을 요청합니다. 중요한 것은 쥐 먹는 걸 멈추지 않을 것이다 또는 와이어 바닥이나 웃기고 monofilament 응용 프로그램을 아래의 손 움직임을 신경 쓸 수.

UP-DOWN 이동할 동안 B. 테스트 절차

1. 쥐 우리 인간의 청각 범위는 아래에 있습니다 조난 vocalizations를 생성합니다. 그들이 누군지들을 수 있도록 테스트를 위해 대기 쥐는 별도의 룸에 보관한다alizations.
2. 폰 프라이 헤어 테스트를 위, 아래에 적합한 척수 부상과 쥐는 팔다리와 함께 체중 베어링을 입증해야합니다. monofilaments의 응용 프로그램이 머리에 신경을 쓰실 전에 앞발을 이동하기 때문에 쥐를 지원할 수없는 팔다리가 안정적으로 테스트할 수 없습니다.
3. 과일 시리얼 2 ~ 3 조각으로 테스트 챔버에서 쥐를 놓습니다. 쥐 각 VFH 응용 프로그램 동안 식사를해야합니다.
4. HL 먼저 테스트를 시작하는 결정하는 주사위를 굴려. 비록 숫자는 오른쪽 앞발을 나타내며 홀수 번호는 왼쪽을 나타냅니다.
5. 5.18 monofilament로 테스트 세션을 시작합니다. 탈퇴 응답은 정상 및 SCI 쥐에게 4.56에서 6.10로 발생할 수 있으며 5.18 monofilament는 범위의 중간에 빠져 들었어.
6. 쥐이 crouches를 얼려하거나 먹지 않는 동안 monofilament를 적용하지 마십시오. 테스터가 대기하는 경우, 때로는 이러한 조건이 해결되며, 테스트는 다시 시작할 수 있습니다. 쥐은 응용 프로그램에서 이러한 행동과 총 시간을 표시하는 경우aratus 처음 다음날부터 시험과 재시험을 중단, 20 분 거리에 있습니다. 이것이 그들의 발생을 증가시킬 수로 이러한 동작을 표시하는 동안 쥐를 제거하지 마십시오. 쥐 이러한 행동을 강화 피하기 위해 그것을 취급하기 전에 이러한 패턴를 나서는 때까지 기다리십시오.
7. 그것 잠함병 (그림 1A 참조)까지 도보로 패드 사이에 뒷다리 손 안에 5 번 발바닥 dermatome에 monofilament 만져. 이 부드러운 꾸준한 응용 프로그램은 약 두 번째는 그때 피부에서 제거 소요됩니다. 피부의 민감성이 분야에서 훨씬 낮으로 발 패드의 어떤 부분을 만지는 것을 피하십시오. 이것은 싱글 터치 한 재판을 구성합니다.
8. 쥐 빠르게 monofilament에서 떨어져 앞발을 들어 올렸 때 긍정적인 반응이 발생합니다. 탈퇴는 응답이 monofilament 응용 프로그램과 연결되어 있는지 확인하기 위해서 monofilament가 제거되는 시간에 의해 시작되어야한다.
9. MO 인식의 다른 증거를 위해 동물을 조심같은 발성과 같은 nofilament 터치, 아래로, 뒤로 또는 테스트 한것 땜에 원하는대로 넘어, 지속적인 발자국이 탈퇴를 핥아하거나 귀가 꿈틀. 데이터 시트에 그들을합니다. 이러한 행동은 발자국 탈퇴가 발생했을 때 그것은 자극의 supraspinal 인식의 증거로서의 역할을합니다.
10. 긍정적인 반응이있다면, 다음 낮은 monofilament를 적용합니다. 응답이 (마이너스)가없는 경우, 다음의 높은 monofilament까지 이동합니다. (개작을 방지하기 위하여) retesting하기 전에 기본적인 발사로 돌아와야하는 감각 수용체 각 monofilament 응용 프로그램 사이에 30 초 정도 소요됩니다.
11. 당신은 10 시련을 쌓을 때까지 긍정적이거나 부정적인 응답을 바탕으로 뒷다리 웃기고 높거나 낮은 monofilaments을 적용 계속합니다. 그런 다음 다른 뒷다리 다쳤구나을 반복한다. (예 : 데이터 시트 참조).
12. 고유 감각 입력을 소개하고 앞발을 들기없이 테스트할 수있는 최고의 VFH은 6.10입니다. 앞발로 땅을 차다가 monof 전에 올렸 때문에 6.45VFH 대형은 사용하지 않아야합니다ilament 신경을 쓰실. 6.10에서 아무런 응답이 없다면 그 다음 재판은 다시 6.10을 적용합니다.
13. 응답이 무효화되어야하고 다음 중 하나가 자극 응용 프로그램이나 발자국이 탈퇴하는 동안 발생하는 경우 재판이 다시 테스트해야합니다
    1. 쥐은 지속적으로 섭취하지 않습니다.
    2. 쥐은 불가능 탈퇴 응답을 elicits 적용 력을 알고 만드는 monofilament의 굽힘 전에 멀리 VFH 자극으로부터 이동합니다.
    3. 앞발로 땅을 차다는 촉각 자극 이외에 고유 제공 VFH (이전 또는 VFH가 휘었죠 전이나 후에)에 의해 해제됩니다.
14. 테스트 세션은 일반적으로 두 hindlimbs를위한 15 분 내로 완료할 수 있습니다.

UP-DOWN 이동할 동안 C. 데이터 처리

1. 성공적인 테스트는 각 다쳤구나 10 순차 재판을해야합니다.
2. 촉각 임계값의 값은 & G의 발자국이 탈퇴를 생산하고 가장 낮은 monofilament입니다전자, 프레 젠 테이션 및 monofilament 중 3 개 이상의 프레 젠 테이션의 50 %가 (예를 들어 데이터 시트를 임계값 동그라미되는 참조) 실시했다.
3. 단 2 총 시련과 monofilament는 한 재판은 긍정적이고 부정적인 하나에도 문턱으로 선택되어 있지 않습니다. 자극의 여러 프레 젠 테이션은 강제로 응답 패턴의 더 좋은 지표입니다.
4. 시험 중 50 % 이상에서 긍정적인 반응을 생산하지 monofilament이 없다면, 쥐가 6.45의 점수가 주어집니다. 이것 만한게 임의의 기회를 넘어선 6.10의 높은 testable monofilament를 검색하지 않은 것을 의미합니다. 그것이 monofilaments의 testable 범위보다 높은 다음 값을 나타냅니다 때문에 6.45의 값이 주어집니다.
5. 그램 강제로 오른쪽과 왼쪽 발냄새위한 문턱 값을 변환합니다. 그램 강제 값은 폰 프라이의 머리카락 공급자가 제공한 것입니다. . 양국 외상의 데이터의 경우 두 발냄새에 대한 임계값 g 포스는 양보 함께 평균 수단일 점수.

2. 지느러미 폰 프라이 테스트

이 테스트의 목적은 그들이 전형적인 발바닥 VFH 방법을 사용하여 테스트할 수 없다는 등 가난한 모터 제어와 쥐에 촉각 감성을 결정하는 것입니다. 그것은 터치 힘이 aversive 반응을 생산하는 데 필요한 양을 quantifies. 고유 감각 자극에 반응을 방지하기 위해, 우리는 앞발로 차다가 응용 프로그램을하는 동안 VFH에 의해 이동되는 시련에 포함되지 않습니다. 또한, 우리는 VFH가 잘때 또는 발 등 부분의 표면에 걸쳐 닦았되는 시련에 포함되지 않습니다.

지느러미 폰 프라이 테스트하기 A. ACCLIMATION 절차

1. 기준 테스트 및 척수 손상 이전 십분 각각 네 가지 세션 젠틀 쥐.
2. 엉덩이쪽에가 (그림 1B) 아래 그림과 같이 노출되도록 대충 작은 수건에 쥐를 싸다. 뒷다리 발냄새가 가볍게 표면에 휴식과 함께 테이블 위에 쥐를 둡니다. 동일 사용아늑한하지만 단단히 포장을하여 각 쥐 있는다. 테이블 가장자리에 팔뚝을 긴장시키는 것은 쥐 간의 다양성을 줄일 수 있습니다.
3. 테스트가 준비 gentled 쥐의는 몇 분 동안 연속 타월로 잡혀 저항 없지만 당신은 다시 포장 쥐 1 또는 뒷다리는 발 모두의 테스트 기간 동안 2 회 할 수 있습니다.

지느러미 폰 프라이 테스트 B. 테스트 절차

1. 첫번째 테스트 시작 뒷다리하는 사지 결정하는 주사위를 굴려. 비록 숫자는 오른쪽 앞발을 나타내며 홀수 번호는 왼쪽을 나타냅니다.
2. 대충 노출된 엉덩이쪽에두고 수건에 쥐를 싸다.
3. 촉각 자극이 생쥐 녀석은 최소 10 초 동안 조용하고 조용 후에만 적용됩니다.
4. 4.56 VFH부터 (그림 1C) 관절에 약 1cm 근위 첫 번째와 두 번째 metatarsal 사이에 지느러미 표면에 수직으로 monofilament를 적용합니다. 부드럽고 ste의 monofilament를 적용한 초 간격 이상 ady는 방식으로 그것 숨어 그때 그것을 제거하지 않는 한. 이것은 싱글 터치 한 재판을 구성합니다.
5. 쥐 빠르게 자극에서 떨어져 앞발을 이동할 때 긍정적인 반응이 발생합니다. 운동의 방향은 뒷다리는 근육이 수축되기 전에 자주 후부 또는 외부입니다. 탈퇴는 응답이 monofilament 응용 프로그램과 연결되어 있는지 확인하기 위해서 monofilament가 제거되는 시간에 의해 시작되어야한다.
6. 4.56 monofilament에게 감각 '돈이 팔을 올립니다 "을 방지하고 감각 수용체가 (적응을 방지하기 위하여) retesting 전에 해고 기준으로 돌아올 수 있도록 응용 프로그램 사이에 최소한 30 초 배 이상을 적용합니다.
7. 자극 시험 VFH 전표면 다시 적용하고 부드럽게 솔질을하거나 오히려 뾰족한 연락을 청소의 힘 전달이 더 만들고 피부를 grazes해야합니다.
8. 4.56 monofilament ~ 2 (즉, 1 또는 0) 미만의 긍정적인 답변이있을 경우, 다음 큰 VFH 3을 적용한다같은 방식으로 배.
9. 이러한 방식으로 두 개 이상의 긍정적인 반응이 발생할 때까지 5.88를 통해 4.56부터 점차적으로 더 큰 VFHs이 적용되거나 최대 VFH가 도달할 때까지.
10. 발자국이 인출 한도는 3 시련을 들락 거 렸고 최소 2 긍정적인 반응을 elicits 낮은 VFH입니다.
11. 다른 다쳤구나를 반복합니다.
12. 테스트 세션은 보통 뒷다리는 발 모두 15 분 안에 완료할 수 있습니다.

3. 대표 결과

성공적인 테스트 관절 (그림 1C)에서 중순 발바닥 지역 (그림 1A) 또는 1 ^일 및 2 ^차 metatarsal 1cm 사이 지느러미 표면에 수직으로 적용 VFH에 뒷다리 손 즉각적인, 활발한 철회가 발생합니다 . 이러한 응답은 각 뒷다리 다쳤구나에 대해 촉각 임계값을 도출하기 위해 않게됩니다. 발바닥 VFH 임계값은 파생과 급성 SCI의 지느러미 VFH 시험에서 촉각 임계값 뛰어난 충실도를 보여주만성 번 (그림 2)에서 D. 발바닥이나 지느러미 시험에서 파생된 촉각 임계값 감소는 등급 SCI (그림 3 ^3,5)에 대해 발생합니다. 이러한 과민성은 SCI 후 이르면 칠일 등의 명부와 실험 ^3-4,6 기간 동안 유지됩니다. SCI의 severities의 범위 손 촉각 감각 임계값에 영향을 미치지 않지만, 임계값 감소는 더 심각 SCI (그림 3)에 대해 발생합니다. 중요한 것은, 아래 레벨 allodynia의 개발은 병변 진원지에서 하얀 물질의 60 % 이상의 손실이있을 때 발생하는 모든 또는 없음 응답입니다. (그림 4 ^3).

촉각 임계값은 부패와 낮은 VFH 세력에 인위적인 반응을 생산할 수있다. 적어도 두 가지 조건은 임계값 붕괴를 생산할 수 - 급속하게 자극 응용 프로그램간에 오랫동안 기다리고 파고 또는 jabbing 방식으로 피부에 VFH을 적용하거나 없습니다. 그 자신감을촉각 임계값은 정품이며,주의가 유사한 저속 접근 방법과 interstimulus 간격은 최소 30 초 있어야합니다을 사용하여 각 VFH을 적용하기 위해 이동해야합니다. 우리는 또한 행동을 먹는 것은 임계값 붕괴 ⁵ 감소하는 것으로 나타났습니다.

그림 1. 발바닥과 지느러미 폰 프라이 머리 (VFH) 테스트 VFH 자극의 위치를 그린 약도와 사진. )은 발바닥 VFH 테스트의 경우 폰 프라이 머리가 느린에서 중간 지골 (같은 hindpaw의 발바닥 표면의 다이어그램에 빨간색 상자로 표시)에 약 1cm 후부 중반 발바닥 hindpaw에 수직으로 적용해야 일관된 속도가 숨어까지. 사진과 같이 지느러미 VFH 기법에 대한 B와 C), 쥐 다를수 외과 수건에 싸여있다. VFH는 첫 번째와 두 번째 metatarsa​​l approximatel 사이에 손 등 부분의 표면에 적용됩니다관절의 근위 Y 1cm.

그림 2. 지느러미 폰 프라이 헤어 감각 임계값이 표준 발바닥 VFH 상관 관계. (N-44, 피어슨 계수 = 0.503, P <0.01, R2 = 0.67). 점선 라인 지느러미 VFH이나 발바닥 VFH 기법을 사용하여 allodynic 센세이션을위한 차단 임계값을 보여 주며 지느러미 VFH 테스트를 사용하여 SCI 후 칠일에 allodynic 임계값은 발바닥 VFH 방법에 의해 결정 만성 아래 수준 allodynia를 예측할 수 있음을 나타냅니다.

그림 3. 조기 지느러미 폰 프라이 헤어 감각 임계값은 나중 timepoints에서 부상 severities에 걸쳐 allodynic 및 비 allodynic 촉각 민감도를 예측했다. 비하 감각 임계값 7 일 게시물 SCI의 지느러미의 VFH 및 28일 포스트 SCI 발바닥 VFH 조치 사이에 발생했습니다. 놀라운 유사성은 위해 발생 상당한 allodynia와 SCI의 광범로 중간 심각한 SCI (모든 다른 그룹 대 P <0.05 1.1 밀리미터 변위)에서 지적했다.

그림 4. SCI 후 6주에서 hindpaw allodynia을 보여주는 laminectomy를 (없음 SCI) 수신 쥐 및 SCI 그룹의 비율. Allodynia는 촉각 자극에 대한 중간 또는 심한 SCI (오스 ESCID 장치 0.9, 1.1, 1.25, 1.3 밀리미터 코드 변위) 가벼운 SCI와 쥐 (0.3, 0.5, 0.7 mm 척추 변위)을 전시하는 동안 정상적인 반응과 쥐에서 본되었다. 대표 코로나 척수의 섹션 laminectomy위한 병변 진원 (손상되지 않은 컨트롤)에서 myelin에 대해 묻다, 온화한은 (0.5 밀리미터 변위), 중간 (1.1 밀리미터 변위)과 중증 (1.3 밀리미터 변위) 척수의 타박상은 axonal의 정도를 보여주 포함되어 있습니다 이러한 과민성와 연결되어 살려주는. (스케일 바 = 0.5 밀리).

그림 5. 위, 아래 폰 프라이 머리 테스트를위한 샘플 데이터 시트. 헤어 가치와 결과 (긍정적이거나 부정적인) 각 시범 서비스에 기록됩니다. 테스트 supraspinal 의식의 징후가 설명되어 있습니다. 시험이 끝나면, 각 헤어 가치 응답 않게됩니다. 예제 데이터를 선택한 임계값이 돌고있다.

VFH 테스트 방법은 민감하고 쥐의 SCI 모델에 사용할 유효한 두 테스트 패러다임을 대표 여기서 제시. 중요한 것은, 지느러미 VFH 시험 쥐들은 엉덩이쪽에 서있을 수 없을 때 심하게 중반 흉부 SCI​​를 따라 뒷다리 발냄새 촉각 감각의 회복의 평가를 위해 만들었습니다. 쥐가 자신의 무게를 지탱하고 경추 SCI 후 두 다리를 위해있는 능력을 되찾을 때 테스트 패러다임도 사용할 수 있습니다.

두 패러다임은 여기 각각의 뒷다리 손 촉각 임계값을 결정하도록 조정 VFH을 활용 보여주었다. 다른 방법은 일반적으로 무해한하거나 정상적으로 유해 자극을 둘 수있는 금단의 주파수를 결정한다. 우리는 이전에 촉각 임계값의 작은 개선이 만성 neuropathic 고통과 정상 촉각 감각의 존재의 차이를 나타내는 수도 것으로 나타났습니다. 따라서 통증이 임계값 5 월 FA를 파생 실험적인 테스트 방법을 활용잠재적인 치료적 개입의 병원에 대한 번역을 cilitate.

모든 행동 테스트와 마찬가지로 그것은 행동 테스트 ⁹ 결과에 영향을 미칠 수있는 테스트 환경 내에서 confounders의 수를 최소화하기 위해 필수적입니다. 따라서 각 테스트 세션이 동일한 온도 및 습도 조절 실에서, 하루 중 같은 시간에 발생하는 것이 중요합니다. 쥐나는 초음파 범위에 vocally 의사 소통 때문에 또한, 그것은 그들의 테스트 개시 전까지 테스트를 위해 대기 쥐가 별도의 방에 보관하는 것이 중요합니다. 랭포드 외 ¹⁰ 순진 동물 유해 자극에 노출 cagemate을 목격 후 통증을 경험한다는 극적인 증거를 보여주었다. 더욱 촉각 감각 테스트의 다양성을 제거하기 위해 발바닥 VFH 테스트 중에 인지적 distractor로 설탕 시리얼을 활용. 이렇게, 우리는 동물의 응답을 안정화. 임계값에 걸쳐 가옥 할 가능성이 적습니다distractor 한 ⁵ 않을 경우보다 제공하는 경우 테스트. 이 안정화 가능성이 hypervigilant 및 catastrophizing 행동, 고통의 위협이 두뇌에 공포와 감정 센터 활성화이 예상 주들의 tempering 때문입니다.