Острые и хронические Тактильная сенсорная тестирования после травмы спинного мозга у крыс

1. Вверх / Вниз Подошвенные фон Фрей тестирования

Целью испытаний является определение тактильной чувствительности, измеряя, сколько сил требуется, чтобы выявить лапу выхода из стимулов. Имеющиеся калиброванные фон Фрей волос мононитей между диапазонами 4,56 и 6.10 используются для стимуляции лапы. Другие сенсорный ввод, как визуализация стимул или проприоцепции может посрамить тактильные меры порог, ответы на основе визуальных и проприоцептивных вход, являются недействительными. Для предотвращения визуализации мононити касаясь кожи, мы проверяем только в то время как крысы едят кашу. Этот познавательный отвлекающих раздражителей, а также гарантирует, что все крысы испытывают на том же уровне базового комфорта. Чтобы избежать ответа за счет проприоцептивной чем тактильные вход, мы не включаем испытания, где леска поднимается и движется лапу.

А. АККЛИМАТИЗАЦИИ ПРОЦЕДУРЫ вверх-вниз

1. Настоящий плод CEREAл в доме клетку так, чтобы крыс распознавать и искать пищу вознаграждение. Крысы не должны быть лишены пищи в любой момент в процессе gentling или тестирования.
2. Крысы готовы к приспособиться к окружающей среде тестирования и процедуры, когда они едят фрукты зерновых в доме клетку. Акклиматизации происходит в течение по крайней мере 4 сессии по 10 минут каждый, но еще могут быть необходимы. Десять минут сессий используются так, что крысы не станут сыты до конца сессии.
3. Положите крысу в испытательной камеры с тремя кусочками фруктов кашу. Предоставление дополнительных зерновых фрукты 1:59 в то время, как они едят. На третьей сессии, а крысы едят, производить движения рук под проволоку пол так, чтобы крыса привыкает к движению под его лапой. На четвертой сессии, применяется леска 5,18 на подошвенной поверхности лап примерно раз в минуту в общей сложности десять презентаций. Наивно крыса не должна реагировать на этот раздражитель под порог.
4. Высокийу части зерновых потребляется, частота мочеиспускания и дефекации, замораживание, и уход за поведение. Замораживание происходит двумя способами: а) крысы присел низко над землей обычно у задней стенки или в сторону от экзаменатора и остается неподвижным, б) крыса согнувшись в середине клетки и, как правило болтает зубы . Замораживание поведение может продолжаться в течение длительного периода времени.
5. Gentled крыса, которая готова для тестирования есть почти непрерывно в течение 10 минут. Это будет легко двигаться в клетку и искать плоды зерновых очень быстро после приема последней. Важно отметить, что крысы не остановит еды или отвлекаться на движения рук по полу провода или леска заявление в лапу.

Б. процедур проверки вверх-вниз ПОДХОД

1. Крысы производить бедствия вокализации, что выше нашей человеческой слуховой диапазон. Крысы ожидают испытания должны храниться в отдельном помещении, так что они не могут слышать эти ЛОСalizations.
2. Крысы с повреждениями спинного мозга, которые подходят для вверх-вниз фон тестирование волос Фрей должен продемонстрировать веса подшипника с конечностями. Конечности, которые не в состоянии поддерживать крыса не может быть надежно испытания, потому что применение мононити движется лапы перед волосы поворотах.
3. Положите крысу в тестировании камеры с 2 или 3 части плодов хлебного злака. Крысы должны питаться во время каждого приложения VFH.
4. Раскатать умереть, чтобы определить, какие HL начать тестирование в первую очередь. Даже цифры представляют правую лапу и нечетными номерами представляют слева.
5. Начало тестирования сессии с 5,18 леска. Снятие ответов может произойти от 4,56 до 6.10 в нормальных и SCI крыс и 5,18 леска попадает в середину диапазона.
6. Не применять мононить а крыса замирает, приседает или не есть. Если тестер ждет, иногда эти условия решения и тестирование может возобновить. Если крыса показывает такое поведение и общее время в приложенииАрат 20 минут, остановить тестирование и повторное тестирование с самого начала на следующий день. Не снимайте крысы в ​​то время как он проявляет такое поведение, так как это может увеличить их возникновения. Подождите, пока крыса убегает из этих моделей перед началом работы, чтобы избежать усиления такого поведения.
7. Нажмите, чтобы леска L5 подошвенной дерматома задней лапы между подушечки лап, пока не изгибов (рис. 1А). Это гладкие устойчивые приложение должно занять около одной секунды, то удалить его из кожи. Старайтесь не касаться любой части подушечки лап, как чувствительность кожи значительно ниже, в этих областях. Это одно касание является одним судом.
8. Положительный ответ возникает, когда крысы быстро поднимает лапы вверх от леска. Вывод должен быть начат к тому времени, леска удаляется для того, чтобы подтвердить, что ответ связан с мононити приложения.
9. Посмотрите на животных других доказательств осведомленности моментаnofilament сенсорный, таких как вокализации, глядя вниз, назад или на испытания лапы, облизывая лапу, устойчивого вывода лапу или подергивание ушей. Обратите внимание на их описании. Когда такое поведение происходит с лапой вывода служит доказательством супраспинальных восприятия стимулов.
10. Если есть положительный ответ, применяют следующий низкий мононити. Если нет ответа (отрицательный), подняться на следующую более высокую мононити. Позвольте 30 секунд между каждым мононити заявки на сенсорные рецепторы, чтобы вернуться к исходному стрельбы до повторного тестирования (для предотвращения адаптации).
11. Продолжать применение выше или ниже мононитей в заднюю лапу на основе положительного или отрицательного ответа пока у вас есть 10 попыток. Затем повторите с другой лапы. (См. пример таблицы).
12. Самый высокий VFH которые могут быть проверены без введения проприоцептивной ввод и снятие лапа 6.10. 6.45VFH и больше не должны использоваться, так как лапы поднимает до monofilament поворотах. Если нет ответа на 6,10, то следующее испытание будет применяться 6.10 раз.
13. Ответ должен быть аннулирована, и суд должен быть повторно протестированы, если одно из следующих действий при применении стимулов или лапу вывод:
    1. Крыса не непрерывно едят.
    2. Крыса уходит от VFH стимул до изгиба мононити, что делает невозможным узнать, что сила, приложенная вызывает вывод ответа.
    3. Лапа поднимается VFH (до или после VFH согнута) предоставление проприоцептивной в дополнение к тактильной стимуляции.
14. Тестирование сессии обычно может быть завершен менее чем за 15 минут и задних конечностей.

С. Обработка данных для UP-DOWN ПОДХОД

1. Успешное испытание будет иметь 10 последовательных испытаний для каждой лапе.
2. Значение тактильной порог низкий леска, которая производит вывод на лапу и ге, 50% от презентаций и 3 и более презентаций мононити были быть предоставлена ​​(см. например, данные, пороги кружке).
3. Мононити только 2 всего испытания не выбран в качестве порога, даже если один судебный процесс положительный и один отрицательный. Несколько презентаций стимул лучше показателей картина ответов на эту силу.
4. Если нет мононити, что дает положительные ответы, по крайней мере 50% тестов, крыса получает балл 6.45. Это означает, что крысы не обнаружил высокий проверяемых леска 6.10 за случайность. Значение 6,45 дано, потому что она представляет собой следующее значение выше, чем диапазон проверяемых мононитей.
5. Преобразование пороговое значение для правой и левой лапы на грамм силы. Грамм значения силы будут предоставлены поставщиком фон волоски Фрея. . По данным двусторонние повреждения, сила порог грамм на двух лапах можно усреднить вместе, чтобы датьодин балл.

2. Спинной фон Фрей тестирования

Цель этого теста состоит в определении тактильной чувствительности у крыс с такими негативными управления двигателем, что они не могут быть проверены с помощью обычной подошвенной методы VFH. Это количественно, сколько сенсорный силы, необходимые для производства отвращение ответ. Чтобы избежать ответов на проприоцептивные стимулы, мы не включаем испытания, в которых лапа движется VFH во время нанесения. Кроме того, мы не включаем испытания, в которых проскальзывает VFH или щеткой через спинной поверхности стопы.

А. АККЛИМАТИЗАЦИИ ПРОЦЕДУРЫ спинной VON FREY ТЕСТИРОВАНИЕ

1. Нежный крыс в течение четырех сессий по 10 минут каждый до тестирования базовых и травмы спинного мозга.
2. Свободно оберните крыса в маленькое полотенце, так что задняя часть подвергается, как показано ниже (рис. 1б). Поместите крысу за столом с задние лапы слегка опираясь на поверхность. Используйте те жеуютно, но не туго пленкой и держать для каждой крысы. Крепление предплечье на край стола может уменьшить изменчивость между крысами.
3. Gentled крыса, которая готова для тестирования не будет сопротивляться, проводимых в полотенце на несколько минут подряд, но вам придется повторно обернуть крысы 1 или 2 раза во время тестирования обеих задних лап.

Б. процедур проверки спинной VON FREY ТЕСТИРОВАНИЕ

1. Раскатать умереть, чтобы определить, какие задние конечности, чтобы начать тестирование в первую очередь. Даже цифры представляют правую лапу и нечетными номерами представляют слева.
2. Свободно оберните крысы в ​​полотенце, оставляя заднюю часть подвергается.
3. Тактильный раздражитель применяется только после того, как крысы тихо и спокойно, по крайней мере 10 секунд.
4. Начиная с 4,56 VFH, применяется леска перпендикулярно к спинной поверхности в период между первой и второй плюсневой примерно на 1 см проксимальнее сустава (рис. 1в). Примените мононити в гладкую, стеАди образом за одну секунду интервал до поворотов, то удалите его. Это одно касание является одним судом.
5. Положительный ответ возникает, когда крысы быстро движется лапы подальше от раздражителя. Направление движения часто задним или внешний до задних конечностей согнуты. Вывод должен быть начат к тому времени, леска удаляется для того, чтобы подтвердить, что ответ связан с мононити приложения.
6. Примените 4,56 мононить в два раза больше, по крайней мере 30 секунд между приложениями в целях предотвращения сенсорной "заводной" и позволить сенсорные рецепторы, чтобы вернуться к исходному стрельбы до повторные испытания (для предотвращения адаптации).
7. Стимул тест должен быть повторно, если VFH скользит и мягко задевает кожу, делая силу доставки больше щеткой или развертки, а не заостренный контакт.
8. Если есть меньше, чем за 2 (то есть 1 или 0) положительных ответов на 4,56 мононить, следующий большой VFH применяется 3раз в том же порядке.
9. Таким образом, постепенно больше VFHs от 4,56 по 5,88 применяется до двух или более положительных ответов произойти или до крупнейшего VFH достигнута.
10. Порог лапу вывод является самым низким VFH который вызывает по меньшей мере 2 положительных отзывов из 3 испытаний.
11. Повторите с другой лапой.
12. Тестирование сессии обычно может быть завершен в течение 15 минут для обеих задних лап.

3. Представитель Результаты

Успешное испытание приведет к немедленному, быстрая вывода на заднюю лапу перпендикулярно применяется VFH до середины подошвенной области (рис. 1а) или спинной поверхности между ^1-й и ^2-й плюсневой 1 см от сустава (рис. 1С) . Эти ответы суммируются для получения тактильных порог для каждой задней лапе. Тактильные пороги из спинной VFH испытания в острой ТСМ показал отличную точность с подошвенной VFH пороги получитьг при хронических раза (рис. 2). Снижение порога тактильной, полученные от подошвенной или спинной испытания происходят для градуированных SCI (рис. 3 ^3,5). Эта повышенная чувствительность проявляется уже через 7 дней после ТСМ и поддерживается в течение всего срока эксперимента ^3-4,6. Хотя ряд тяготы SCI не влияют на тактильных сенсорных порогов лапу, снижение порога происходит при более тяжелых SCI (рис. 3). Важно отметить, что развитие ниже уровня аллодиния это все или ни одного ответа, который возникает при потере более 60% белого вещества в эпицентре поражения. (Рис. 4 ^3).

Тактильные пороги могут распадаться и производить искусственное ответов на низких сил VFH. По крайней мере, двух условий может привести к порогу распада - быстрое применение VFH на кожу или тыкать тыкать образом или не ждет достаточно долго, между стимулом приложений. Чтобы быть уверенным, чтотактильные пороги являются подлинными, необходимо позаботиться, чтобы применять каждый VFH с помощью аналогичного подхода низкой скорости и interstimulus интервал должен составлять не менее 30 сек. Мы также показали, что пищевое поведение снижает порог распада ^5.

Рисунок 1. Схема и фотографии изображающие расположение VFH стимуляцию подошвенной и спинной фон Фрей волос (VFH) тестирования. А) Для подошвенных тестирования VFH, волосы фон Фрей должны применяться перпендикулярно к середине подошвенной hindpaw примерно 1 см кзади от средней фаланги (как указано на красный прямоугольник на диаграмме подошвенной поверхности hindpaw) при медленном постоянной скоростью, пока не гнется. В и С) для спины техника VFH, крыса обернуто в хирургическое полотенце, как показано на фотографии. VFH применяется к спинной поверхности лап между первой и второй плюсневой approximatelу 1 см проксимальнее сустава.

Рисунок 2. Спинного фон Фрей волос сенсорные пороги коррелируют с стандартными подошвенной VFH. (П-44, Пирсон коэффициент = 0,503, р <0,01, R2 = 0,67). Пунктирные линии показывают порог отсечки allodynic ощущения либо с помощью спинного VFH или подошвенной методы VFH и указывают, что allodynic пороги в течение 7 дней после ТСМ помощью спинного тест VFH предсказать хроническое ниже уровня аллодиния определяется подошвенной методы VFH.

Рисунок 3. Ранние спинной фон Фрей волос сенсорных порогов предсказать allodynic и не allodynic тактильной чувствительности по всей строгости травмы в более поздние моменты времени. Сопоставимые сенсорных порогов произошло между 7 дней после спинного SCI VFH и 28 дней после ТСМ подошвенной меры VFH. Примечательно сходство произошло за широкий спектр SCI, со значительным аллодиния отмечается в средней и тяжелой степени SCI (р <0,05 1,1 мм смещение против всех других групп).

Рисунок 4. Доля крыс, получавших ламинэктомия (не SCI) и ТСМ групп показывает hindpaw аллодиния через 6 недель после ТСМ. Аллодиния наблюдалось только у крыс с умеренной или тяжелой SCI (ОГУ ESCID устройстве 0,9, 1,1, 1,25, 1,3 мм смещения мозга) в то время как крысы с легкой SCI (0,3, 0,5, 0,7 мм смещение спинного мозга) выставлена ​​нормальная реакция на тактильное раздражение. Представитель корональных спинного разделы шнур для окрашенных миелина на поражение эпицентром ламинэктомия (неповрежденную контроль), легкой (0,5 мм смещения), умеренной (1,1 мм смещения) и тяжелой (1,3 мм смещения) спинного мозга ушибы включены, чтобы показать степень аксонального щадящий, что связано с этой гиперчувствительности. (Масштаб бар = 0,5 мм).

Рисунок 5. Образец таблицы данных для вверх-вниз фон тестирование волос Фрей. Значение волос и результат (положительное или отрицательное) записывается для каждого испытания. Показания супраспинальных осведомленности о тестировании отличаются. В конце теста, ответы на каждый волос стоимости совпадают. Выбранное значение порога для примера данные круг.

VFH методам тестирования, представленные здесь представляют два тестирование парадигм, которые являются чувствительными и может быть использован в модели крысы ТСМ. Важно отметить, что спинной тест VFH была создана для оценки восстановления тактильные ощущения задние лапы остро после середины грудной SCI, когда крысы не могут стоять на задних конечностей. Это тестирование парадигмы также может быть использован, когда крысы восстановить способность поддерживать свой вес и задних конечностей после шейки ТСМ.

Две парадигмы продемонстрировала здесь использовать калиброванный VFH для определения порога тактильной каждой задней лапе. Другие методы определения частоты вывода либо обычно безобидные или нормально болевые раздражители. Ранее мы показали, что небольшое повышение тактильной пороги могут представлять собой разницу между наличием хронической нейропатической боли и нормальные тактильные ощущения. Таким образом, использование экспериментальных методов тестирования, которые происходят болевой порог может фаcilitate перевода потенциальных терапевтических вмешательств в клинике.

Как и все поведенческие тестирование, крайне важно, чтобы свести к минимуму количество вмешивающихся факторов в тестовой среде, которые могут повлиять на исход поведенческих тестов ^9. Таким образом, важно, чтобы каждая сессия тестирования происходит в то же время суток, в той же температуры и влажности контролируемого помещения. Кроме того, поскольку крысы общаться устно в ультразвуковом диапазоне, важно, что крысы ожидают испытания хранятся в отдельной комнате, пока их тестирование начинается. Лэнгфорд и др. ¹⁰ показали драматические доказательства того, что наивные животные испытывают боль после свидетелями cagemate воздействию вредных стимуляции. Для дальнейшего устранения изменчивости тактильной сенсорных тестирование, мы используем сахаром зерновых как познавательный отвлекающих во время тестирования подошвенной VFH. При этом мы стабилизировать реакцию животного. Порог, менее вероятно, к распаду всейтестирование при отвлекающих предоставляется чем тогда, когда человек не ^5. Эта стабилизация, скорее всего, в связи с отпуском сверхбдительность и catastrophizing поведения, два упреждающих государствах, где угроза боли активизирует страх и эмоциональные центры головного мозга.