Acute en chronische Tactile Sensory Testing na ruggenmergletsel bij ratten

1. Up / Down Plantar Von Frey Testen

Het doel van de test is het tactiele gevoeligheid te bepalen door te meten hoeveel kracht nodig is om poot terugtrekking uit de stimulus te lokken. Commercieel beschikbare geijkt Von Frey haar monofilamenten tussen die van 4,56 en 6,10 worden gebruikt om de poot te stimuleren. Andere sensorische input, zoals visualisatie van de stimulus of proprioceptie kan verwarren tactiele drempel maatregelen, zodat de antwoorden op basis van visuele of proprioceptieve input zijn ongeldig. Om visualisatie van de monofilament het aanraken van de huid te voorkomen, testen we alleen als de rat is het eten van granen. Deze cognitieve distracter, zorgt er ook voor dat alle ratten worden getest op een vergelijkbaar baseline niveaus van comfort. Om reacties te wijten aan proprioceptieve in plaats van tactiele input te vermijden, hebben we geen onderzoeken waarbij de monofilament tilt of verplaatst de poot.

A. acclimatisatie PROCEDURES VOOR DE UP-DOWN AANPAK

1. Present fruit Cereal in de kooi, zodat ratten te herkennen en zoeken het voedsel beloning. Ratten hoeven niet te eten beroofd op elk punt in de gentling of testen proces.
2. Ratten zijn klaar om te worden aangepast heeft aan de testomgeving en de procedures als ze eten fruit granen in de kooi. Acclimatisering komt over ten minste 4 sessies van 10 minuten, maar meer kan nodig zijn. Tien minuten durende sessies worden gebruikt, zodat de ratten niet worden verzadigd voor het einde van de sessie.
3. Plaats de rat in de test kamer met drie stukjes fruit granen. Zorg voor extra fruit granen een tot twee per keer als ze worden gegeten. Op de derde sessie, terwijl de rat aan het eten is, produceren handbewegingen onder de draad vloer zodat de rat wordt gewend om beweging onder zijn poot. Op de vierde sessie, gelden de 5.18 monofilament op de plantaire oppervlak van de poot ongeveer een keer per minuut voor een totaal van tien presentaties. Een naïeve rat mag niet reageren op deze sub drempel stimulus.
4. Hoogy de stukken van graan verbruikt, de frequentie van het plassen en ontlasting, bevriezing, en het verzorgen gedrag. Invriezen probleem doet zich voor op twee manieren: a) de rat wordt gehurkt laag bij de grond meestal in de buurt van de achterwand of worden geconfronteerd met uit de buurt van de examinator en blijft onbeweeglijk, b) de rat wordt gebogen over in het midden van de kooi en meestal chatters zijn tanden . Invriezen gedrag kunnen blijven voor langere tijd.
5. Een zachtere rat die klaar is voor het testen zal bijna continu eten voor 10 minuten. Het zal gemakkelijk bewegen in de kooi en proberen fruit granen zeer snel na het nuttigen van de laatste. Belangrijk is dat de rat niet stoppen met eten of worden afgeleid door bewegingen van de hand onder de draad vloer of monofilament verzoek aan de poot.

B. TESTPROCEDURES voor het up-DOWN AANPAK

1. Ratten nood geluiden die boven onze menselijke auditieve bereik. Ratten wachten om te worden getest moet worden bewaard in een aparte ruimte, zodat ze niet kunnen horen deze vocalizations.
2. Ratten met een dwarslaesie die geschikt zijn voor het up-down von Frey haar het testen moeten aantonen gewicht dragen met de ledematen. Ledematen die niet in staat zijn om de rat te ondersteunen niet betrouwbaar kan worden getest omdat de toepassing van monofilamenten beweegt de poot voor het haar bochten.
3. Plaats een rat in de test kamer met 2 of 3 stuks fruit granen. Ratten worden elke eten tijdens VFH toepassing.
4. Rol een dobbelsteen om te bepalen welke HL om te beginnen met het testen van eerste. Even getallen staan ​​voor de rechter voorpoot en oneven nummers vertegenwoordigen de linkerkant.
5. Begin de testsessie met de 5.18 monofilament. Intrekking reacties kunnen optreden 4,56 tot 6,10 in normale en SCI ratten en de 5.18 monofilament valt in het midden van het bereik.
6. Niet aanbrengen een monofilament, terwijl een rat bevriest, knielt of niet eet niet. Als de tester wacht, soms zijn deze voorwaarden op te lossen en het testen kan worden hervat. Als de rat toont dit gedrag en de totale tijd in de appAratus ligt op 20 minuten, stop het testen en opnieuw testen vanaf het begin de volgende dag. Verwijder nooit de rat tijdens het weergeven van dit gedrag, omdat dit kan het optreden daarvan te verhogen. Wacht tot de rat breekt uit deze patronen voordat u deze vastpakt om te voorkomen dat het versterken van deze gedragingen.
7. Raak het monofilament op de L5 plantaire dermatoom van de achterpoot tussen de voetzolen tot aan de bocht (zie figuur 1A). Dit gladde consistente toepassing moet ongeveer een seconde dan is het verwijderen van de huid. Vermijd het aanraken van een deel van de voet elektroden zoals de gevoeligheid van de huid is veel lager in deze gebieden. Deze enkele aanraking vormt een proefperiode.
8. Een positief antwoord doet zich voor wanneer de rat snel tilt de poot omhoog uit de buurt van het monofilament. De intrekking moet worden gestart tegen de tijd dat de monofilament wordt verwijderd om te bevestigen dat de reactie wordt geassocieerd met de monofilament toepassing.
9. Bekijk de dieren voor ander bewijs van het bewustzijn van de monofilament aanraking, zoals stemgebruik, op zoek naar beneden, naar achteren of in de geteste poot, het likken van de poot, aanhoudende poot intrekking of trillen de oren. Let op ze op de data sheet. Wanneer deze gedragingen voorkomen bij poot terugtrekking dient het als bewijs van supraspinale waarneming van de stimulus.
10. Als er een positieve reactie, gelden de volgende laagste monofilament. Als er geen respons (negatief), doorstromen naar de volgende hogere monofilament. Laat 30 seconden tussen elke monofilament aanvraag voor de sensorische receptoren om terug te komen met de uitgangswaarde vuren voordat de grondstof opnieuw (aanpassing te voorkomen).
11. Ga door het toepassen van hogere of lagere monofilamenten aan de achterpoot op basis van positieve of negatieve reacties tot je 10 studies. Herhaal aan de andere achterpoot. (Zie voorbeeld datasheet).
12. De hoogste VFH die getest kunnen worden zonder de invoering van proprioceptieve input en het optillen van de poot is 6.10. De 6.45VFH en grotere mag niet worden gebruikt, omdat de poot optilt voor de monofilament bochten. Als er geen reactie op 6,10 dan is de volgende proef zal gelden de 6,10 weer.
13. Een respons dient te worden vernietigd en het onderzoek moet opnieuw worden getest of een van de volgende situaties zich voordoet tijdens de prikkel aanvraag of poot terugtrekken:
    1. De rat is niet continu eten.
    2. De rat zich van de VFH stimulus voor het buigen van de monofilament, waardoor het onmogelijk de toegepaste kracht die de terugtrekking reactie opwekt kennen.
    3. De poot wordt opgetild door de VFH (hetzij vóór of na de VFH is gebogen) die proprioceptieve naast tactiele stimulatie.
14. Een testsessie kan meestal worden afgerond in minder dan 15 minuten voor beide achterpoten.

C. gegevensverwerking in de UP-DOWN AANPAK

1. Een geslaagde test zal hebben 10 opeenvolgende proeven voor elke poot.
2. De waarde van de drempel tactiele de laagste monofilament die poot de opgenomen & g produceerte, 50% van de presentaties en 3 of meer presentaties van het monofilament hebben worden gegeven (zie voorbeeld gegevensblad, drempels zijn omcirkeld).
3. Een monofilament met slechts 2 totaal proeven is niet geselecteerd als de drempel, zelfs wanneer een proef positief is en een negatief. Meerdere presentaties van de stimulus zijn betere indicatoren van het patroon van de antwoorden op die kracht.
4. Als er geen monofilament dat de positieve reacties veroorzaakt ten minste 50% van de proeven wordt de rat een score van 6,45. Dit betekent dat de rat niet detecteren van de hoogste toetsbaar monofilamenten van 6,10 voorbij willekeurig toeval. Een waarde van 6,45 wordt gegeven omdat het de volgende waarde hoger is dan de toetsbare bereik van monofilamenten.
5. Zet de drempelwaarde voor de rechter en linker poten in gram van kracht. De gram van kracht waarden zal worden verstrekt door de leverancier van de von Frey haren. . Voor de gegevens van bilaterale verwondingen, kan de drempel gram kracht voor de twee poten worden gemiddeld elkaar toe te geveneen enkele score.

2. Dorsale Von Frey Testen

Het doel van deze test is het bepalen vingergevoeligheid bij ratten met een dergelijk slechte motorische controle die zij niet kunnen worden getest met behulp van de typische plantaire VFH methoden. Het kwantificeert hoeveel contact kracht nodig is om een ​​aversieve respons te produceren. Om reacties op proprioceptieve stimuli te vermijden, hebben we geen studies, waarbij de poot wordt door de VFH bewogen tijdens het aanbrengen. Bovendien hebben we geen proeven waarbij het VFH glijdt of geborsteld over het dorsale oppervlak van de voet.

A. acclimatisatie PROCEDURES VOOR DORSAL VON FREY TESTEN

1. Gentle ratten gedurende vier sessies van 10 minuten voorafgaand aan de baseline testen en dwarslaesie.
2. Losjes wikkel de rat in een kleine handdoek, zodat de achterhand worden blootgesteld, zoals hieronder weergegeven (Figuur 1B). Plaats de rat op een tafel met de achterpoten licht rusten op het oppervlak. Gebruik dezelfdestrak zitten, maar niet strak wrap en houdt voor elke rat. Bracing je onderarm op de tafel rand kan verminderen variabiliteit tussen de ratten.
3. Een zachtere rat die klaar is voor het testen zal niet nalaten wordt gehouden in de handdoek een paar minuten achter elkaar, maar je kan hebben om opnieuw te wikkelen de rat 1 of 2 keer tijdens het testen van de beide achterpoten.

B. TESTPROCEDURES VOOR DORSAL VON FREY TESTEN

1. Rol een dobbelsteen om te bepalen welke achterste ledematen om te beginnen met het testen van eerste. Even getallen staan ​​voor de rechter voorpoot en oneven nummers vertegenwoordigen de linkerkant.
2. Losjes wikkel de rat handdoek in de ring verlaten blootgesteld de achterhand.
3. Tactiele stimulus is slechts plaats nadat de rat is kalm en rustig gedurende minstens 10 seconden.
4. Vanaf de 4,56 VFH loodrecht toepassen monofilament de dorsale zijde tussen de eerste en tweede middenvoetsbeentje ongeveer 1 cm tot aan het gewricht (figuur 1c). Breng de monofilament in een gladde, steady manier meer dan een seconde interval tot de bocht en verwijder het. Deze enkele aanraking vormt een proefperiode.
5. Een positief antwoord doet zich voor wanneer de rat snel beweegt de poot uit de buurt van de stimulus. De richting van de beweging is vaak achterste of externe voordat de achterste ledematen wordt gebogen. De intrekking moet worden gestart tegen de tijd dat de monofilament wordt verwijderd om te bevestigen dat de reactie wordt geassocieerd met de monofilament toepassing.
6. Breng de 4,56 monofilament nog twee keer met ten minste 30 seconden tussen toepassingen om zintuiglijke "windup" te voorkomen en om de sensorische receptoren om terug te komen met de uitgangswaarde vuren voordat de grondstof opnieuw (aanpassing te voorkomen).
7. Een stimulans test moet opnieuw worden aangebracht als de VFH slips en voorzichtig graast de huid, waardoor de kracht leverbaar meer van een te borstelen of een sweep in plaats van een puntige contact.
8. Als er minder dan 2 (dwz 1 of 0) positieve reacties op de 4,56 monofilament, wordt de volgende grotere VFH toegepast 3keer op dezelfde wijze.
9. Op deze wijze worden steeds hogere VFHs van 4,56 tot 5,88 toegepast tot twee of meer positieve reacties optreden of totdat de grootste VFH bereikt.
10. De poot onttrekkingsdrempel is de laagste VFH die minstens 2 positieve reacties ontlokt uit 3 proeven.
11. Herhaal aan de andere poot.
12. Een testsessie meestal kan worden voltooid in 15 minuten voor beide achterpoten.

3. Representatieve resultaten

Een succesvolle test hiervan leidt tot directe, levendige intrekking van de achterpoot van een loodrecht toegepast VFH op het midden van de plantaire regio (figuur 1A) of het dorsale oppervlak tussen de 1 ^e en 2 ^e middenvoetsbeentje 1 cm van het gewricht (1C figuur) . Deze antwoorden worden geteld voor het afleiden van tactiele drempel voor elke achterpoot. Tactiele drempels van dorsale VFH testen in acute SCI toonde uitstekende trouw met plantaire VFH drempels halend met een chronisch tijden (figuur 2). Dalingen in de tactiele drempels afgeleid uit plantaire of dorsale testen optreden voor graded SCI (figuur 3 ^3,5). Dit manifesteert overgevoeligheid reeds na 7 dagen SCI en gedurende de duur van het experiment ^3-4,6. Terwijl een aantal van SCI ernst hebben geen invloed op tactiele zintuiglijke drempels van de poot, daling van de drempels optreden voor meer ernstige SCI (figuur 3). Belangrijk is dat de ontwikkeling van onder-niveau allodynie is een alles-of niets reactie die optreedt wanneer er een verlies van meer dan 60% van de witte stof in de laesie epicentrum. (Figuur 4 ^3).

Tactiele drempels kan vervallen en produceren kunstmatige reacties op lage VFH krachten. Ten minste twee voorwaarden kan produceren drempel verval - snel de toepassing van de VFH op de huid in een steken of prikken manier of niet lang genoeg wachten tussen stimulus applicaties. Om er zeker van zijn datde tactiele drempels echt zijn, moet erop worden gelet dat elke VFH met behulp van een vergelijkbare lage snelheid aanpak en de interstimulus interval moet minimaal 30 sec toe te passen. We hebben ook aangetoond dat het eten van het gedrag drempel verval ⁵ vermindert.

Figuur 1. Schema en foto's die de locatie van VFH stimulatie voor de plantaire en dorsale von Frey haar (VFH) testen. A) Voor plantaire VFH onderzoek moeten de von Frey haar loodrecht toegepast midden plantaire achterpoot ongeveer 1 cm achterste het midden falanx (zoals aangegeven door de rode vak in het schema van de voetzool van de achterpoot) op een langzame constante snelheid totdat het bochten. B en C) voor de dorsale VFH techniek wordt de rat losjes verpakt in een chirurgische handdoek afgebeeld. De VFH wordt toegepast op de dorsale zijde van de poot tussen de eerste en tweede middenvoetsbeentje approximately 1 cm proximaal van het gewricht.

Figuur 2. Dorsale von Frey Hair sensorische drempels te correleren met standaard plantaire VFH. (N-44; Pearson coëfficiënt = 0,503, p <0,01, r2 = 0,67). Stippellijnen geven de cutoff drempel voor allodynic sensatie met behulp van de Dorsale VFH of de plantaire VFH technieken en geven aan dat allodynic drempels op 7 dagen na SCI met behulp van de Dorsale VFH-test chronische onder-level allodynie bepaald door plantaire VFH methoden te voorspellen.

Figuur 3. Vroege dorsale von Frey Hair sensorische drempels te voorspellen allodynic en niet-allodynic vingergevoeligheid over letsel ernst op latere tijdstippen. Vergelijkbare sensorische drempels vond plaats tussen 7 dagen na de SCI Dorsale VFH en 28 dagen na de SCI plantaire VFH maatregelen. Opmerkelijke overeenkomst opgetreden voor een brede waaier van SCI, met aanzienlijke allodynie vermeld in matige tot ernstige SCI (p <0,05 1,1 mm verplaatsing ten opzichte van alle andere groepen).

Figuur 4. Percentage van de ratten die laminectomie (geen SCI) en SCI groepen laten zien achterpoot allodynie op 6 weken na de SCI. Allodynie werd alleen gezien bij ratten met matige of ernstige SCI (OSU ESCID apparaat 0,9, 1,1, 1,25, 1,3 mm kabel verplaatsingen), terwijl de ratten met een lichte SCI (0,3, 0,5, 0,7 mm ruggenmerg verplaatsingen) vertoonden een normale reactie op tactiele stimulatie. Vertegenwoordiger coronale ruggenmerg secties gekleurd voor myeline in de laesie epicentrum voor laminectomie (onbeschadigd controle), milde (0,5 mm verplaatsing), zijn matig (1,1 mm verplaatsing) en ernstige (1,3 mm verplaatsing) ruggenmerg kneuzingen opgenomen om de mate van axonale tonen sparen die is gekoppeld aan deze overgevoeligheid. (Schaal bar = 0,5 mm).

Figuur 5. Een voorbeeld van een fiche voor de up-down von Frey haar het testen. Het haar en het resultaat (positief of negatief) zijn opgenomen voor elke proef. Indicaties van supraspinale bewustzijn van de testen worden genoteerd. Aan het einde van de test worden de reacties bij elke haar waarde opgeteld. De geselecteerde drempelwaarde voor het voorbeeld data wordt omcirkeld.

De VFH testmethoden hier gepresenteerde vertegenwoordigen twee testen paradigma's die gevoelig zijn en geldig voor gebruik in de rat SCI modellen. Belangrijk is dat de rug-VFH-test gemaakt voor de beoordeling van het herstel van de tactiele sensatie van de achterpoten acuut na midden van de thoracale SCI als ratten niet in staat zijn om op te staan ​​hun achterhand. Deze testen paradigma kan ook worden gebruikt als ratten weer de mogelijkheid om hun gewicht te dragen en voor de achterste ledematen na cervicale dwarslaesie.

De twee paradigma gedemonstreerd gebruik gekalibreerd VFH de voelbare drempel van elke achterpoot bepalen. Andere methoden bepalen de frequentie van de terugtrekking naar een normaal onschuldig of normaal schadelijke stimulus niet. We hebben eerder aangetoond dat kleine verbeteringen in aanraking drempels het verschil tussen de aanwezigheid van chronische neuropathische pijn en normale tastzin vertegenwoordigen. Vandaar gebruik te maken van experimentele testmethoden die pijn drempels kan fa ontlenencilitate vertaling van potentiële therapeutische interventies om de kliniek.

Zoals met alle gedrags-testen, is het noodzakelijk om het aantal confounders binnen de testomgeving dat de uitkomst van de gedrags-test ⁹ van invloed kunnen zijn te minimaliseren. Aldus is het belangrijk dat elke testsessie opnieuw op dezelfde tijd op dezelfde temperatuur en vochtigheid ruimte. Bovendien, omdat ratten vocaal communiceren ultrasone bereik, is het belangrijk dat ratten wachten getest worden in een aparte kamer tot de test begint. Langford et al. ¹⁰ toonden dramatische bewijs dat naïeve dieren pijn ervaren na getuige van een cagemate blootgesteld aan schadelijke stimulatie. Om verder te elimineren variabiliteit in de tactiele sensorische testen maken we gebruik van gesuikerde ontbijtgranen als een cognitief afleider tijdens plantaire VFH testen. Daarbij we stabiliseren de reacties van het dier. De drempelwaarde is minder verval intesten als een afleider wordt dan wanneer een niet ^5. Deze stabilisatie is waarschijnlijk te wijten aan het temperen van waakzaam en catastroferen gedrag, twee anticiperende staten waar de dreiging van pijn activeert angst en emotionele centra in de hersenen.