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Choe, Y., Mayerich, D., Kwon, J., Miller, D. E., Sung, C., Chung, J. R., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (58), e3248, doi:10.3791/3248 (2011).
उच्च throughput, उच्च संकल्प, 3 डी तकनीक माइक्रोस्कोपी में मेजर अग्रिम submicrometer संकल्प पर neuroanatomical डेटा की बड़ी मात्रा के अधिग्रहण सक्षम है. पहली ऐसी पूरे मस्तिष्क पैमाने पर डेटा के उत्पादन उपकरणों की एक चाकू - एज स्कैन (KESM) माइक्रोस्कोप 7, 5, 9, 'लेखक की प्रयोगशाला में विकसित और होस्ट है. KESM अनुभाग और छवि submicrometer संकल्प पर पूरे माउस दिमाग के लिए इस्तेमाल किया गया है, neuronal नेटवर्क के जटिल विवरण (Golgi) 1, 4, 8, संवहनी नेटवर्क (भारत स्याही) 1, 4, और सेल शरीर (Nissl) वितरण 3 खुलासा . KESM का उपयोग माउस और न ही मस्तिष्क के लिए सीमित नहीं है. हम सफलतापूर्वक ऑक्टोपस 6 मस्तिष्क, माउस फेफड़ों, और चूहे के मस्तिष्क imaged है . वर्तमान में हम पूरी ज़ेबरा मछली भ्रूण पर काम कर रहे हैं. इन जैसे डेटा connectomics अनुसंधान 10 के लिए बहुत योगदान कर सकते हैं, microcirculation और hemodynamic अनुसंधान, और प्रावधानों द्वारा stereology अनुसंधानडिंग एक सटीक जमीनी सच्चाई.
इस अनुच्छेद में, हम नमूना तैयारी (फिक्सिंग, धुंधला, और एम्बेडिंग) सहित पाइप लाइन, KESM विन्यास और सेटअप, सेक्शनिंग और KESM साथ इमेजिंग, इमेज प्रोसेसिंग, डेटा तैयारी, और डेटा दृश्य और विश्लेषण का वर्णन करेंगे. नमूना तैयार करने और दृश्य / प्राप्त KESM डेटा के विश्लेषण पर जोर दिया जाएगा. हम KESM और इसके उपयोग को बढ़ाने के लिए उपयोग को व्यापक मदद करने के लिए इस लेख में प्रस्तुत विस्तृत प्रोटोकॉल की उम्मीद है.
इस प्रोटोकॉल के निकट Mayerich एट अल के प्रोटोकॉल 7 निम्नानुसार है .
C57BL/6J माउस गहरा anesthetized है isoflurane inhalant संज्ञाहरण का उपयोग कर और फिर decapitated.
मस्तिष्क और हटा निर्धारण Golgi कॉक्स समाधान (1% पोटेशियम chromate, 1% पोटेशियम dichromate, और 1% विआयनीकृत जल में Mercuric क्लोराइड) में रखा गया है.
मस्तिष्क अंधेरे में Golgi - कॉक्स समाधान में छोड़ दिया है, कमरे के तापमान पर 10 से 16 सप्ताह के लिए.
दिमाग विआयनीकृत अंधेरे में रात भर पानी में rinsed हैं.
rinsed मस्तिष्क अंधेरे में कमरे के तापमान पर 7 से 10 दिनों के लिए विआयनीकृत जल में 5% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान में डूब जाता है. यह लंबी तैयारी के समय पूरे मस्तिष्क की घुसपैठ को सुनिश्चित करना था, ताकि काले वेग पूरी तरह से ऊतकों में फार्म का मौका था.
मस्तिष्क फिर विआयनीकृत जल में rinsed है 4 घंटे और टी के लिए कमरे के तापमान पर50% और 70% रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में, और 85%, 95% (3 परिवर्तन), और कमरे के तापमान में 100% (4 से 5 परिवर्तन): एथिल एल्कोहल की एक वर्गीकृत श्रृंखला के माध्यम से निर्जलित मुर्गी. मस्तिष्क के 24 घंटे के लिए प्रत्येक समाधान में छोड़ दिया है.
निर्जलित मस्तिष्क तो एसीटोन में डाल दिया है (3 से 4 परिवर्तन, एक दिन के लिए प्रत्येक), द्वारा 01:02 के अनुपात araldite को एसीटोन, 01:01, 02:01, और अंत में के साथ एक मिश्रण araldite - एसीटोन बाद 100% (3 परिवर्तन, प्रत्येक रातोंरात समय) रेफ्रिजरेटर में araldite (4 डिग्री सेल्सियस).
अंत में, मस्तिष्क इलाज 100% araldite में एम्बेडेड है और 60 से गरम डिग्री सेल्सियस 3 दिन (cf. Abbott और 2 Sotelo में एम्बेडिंग प्रोटोकॉल) के लिए. यदि नमूनों LR व्हाइट में एम्बेडेड रहे हैं तो नमूनों पिछले 100% इथेनॉल समाधान से LR व्हाइट समाधान के तीन परिवर्तन, कि प्रत्येक फ्रिज में रात भर रखा है जो polymerization के लिए पहले एक मानक प्रक्रिया है के माध्यम से स्थानांतरित कर रहे हैं. तीन परिवर्तन करने के लिए पूरा घुसपैठ सुनिश्चित कर रहे हैं. नमूना टी हैताजा LR व्हाइट के लिए हस्तांतरित मुर्गी है कि 60 में एक बंद कंटेनर में polymerized है ° 24 घंटे के लिए सी, जो उचित polymerization के लिए समय और तापमान के लिए आवश्यक राशि है.
चित्र 1 Golgi - कॉक्स दाग Araldite में एम्बेडेड मस्तिष्क से पता चलता है.
ठीक नमूना ब्लॉक तो धातु नमूना epoxy का उपयोग की अंगूठी पर मुहिम शुरू की है, और ब्लॉक के पक्ष आवश्यक के रूप में छंटनी की है (चित्र देखें 2.).
2. नमूने की तैयारी: Nissl
माउस गहरा anaesthetized ketamine और xylazine (1.7 मिलीग्राम ketamine / प्रति 20 ग्राम शरीर के वजन 0.26 मिलीग्राम xylazine) इंजेक्शन intraperitoneally का उपयोग और फिर transcardially कमरे के तापमान के 50 एमएल का उपयोग perfused फॉस्फेट बफर खारा (7.4 पीएच), कमरे के 250 एमएल के द्वारा पीछा किया तापमान 10 तटस्थ% formalin buffered (7.4 पीएच). और अंत में undiluted भारत स्याही के 3.0 सीसी के साथ.
खारा और लगानेवाला के साथ पूरे शरीर छिड़काव हृदय प्रणाली से खून साफ करने के लिए आवश्यक है और ती ठीक ssues. भारत स्याही के साथ छिड़काव के लिए पूरी तरह से हृदय प्रणाली की vasculature को भरने के लिए आवश्यक है.
परिणामस्वरूप मस्तिष्क तो वर्गीकृत एथिल एल्कोहल (25% -100%) की एक श्रृंखला के माध्यम से निर्जलित है और फिर प्रोटोकॉल में 1.8-1.9 ऊपर के बाद araldite प्लास्टिक में एम्बेडेड. यदि LR सफेद एम्बेडिंग मध्यम है तो प्रोटोकॉल में 1.10 ऊपर का पालन है.
4. नमूने की तैयारी: सामान्य प्रजातियों, सामान्य अंगों
सामान्य मामले के लिए, या तो 10% तटस्थ बफर formalin या 4% paraformaldehyde निर्धारण के साथ किया जा सकता है.
छोटे ऊतक संस्करणों के लिए, छिड़काव के बजाय प्रसार निर्धारण और धुंधला के लिए सिफारिश की है. छोटे जीवों या अंगों के मामले में भी धुंधला निर्जलीकरण की प्रक्रिया के दौरान किया जा सकता है है.
एम्बेडिंग प्रोटोकॉल इसके बाद के संस्करण के रूप में ही है, हालांकि समाधान के लिए बार घुसपैठ अंगों या जीवों कि पूरे माउस मस्तिष्क की तुलना में बहुत छोटे होते हैं के लिए कम किया जा सकता है है.
jove_title "> 5. KESM सेटअप और इमेजिंग
मुड़ें बंद पंप, मंच पर बारी, कैमरे पर बारी, प्रकाशक पर बारी.
चाकू और उद्देश्य उठाएँ.
नमूना अंगूठी स्थापित करें.
उपाय नमूना आयाम और KESM स्टेज Controller2 आवेदन के लिए एक विन्यास फाइल बनाने.
KESM स्टेज Controller2 प्रारंभ और मंच इनिशियलाइज़.
लोअर चाकू / उद्देश्य, पंप पर बारी.
उद्देश्य और कैमरा ऑप्टिकल ट्रेन पर ध्यान केंद्रित घुंडी मोड़ और देखने के कैमरे के क्षेत्र धार के सापेक्ष समायोजित करके, ध्यान दें.
[जाओ] प्रेस इमेजिंग आरंभ.
देखें अंजीर. 3-8. 9, 7 तकनीकी जानकारी के लिए देखें.
6. छवि प्रसंस्करण और डेटा तैयारी
KESM ढेर प्रोसेसर निष्पादन योग्य विन्यास फाइल फ़ोल्डर (00,000, 00001, आदि) के तहत डेटा फ़ोल्डर में कॉपी करें.
प्रकाश विरूपण साक्ष्य को हटाने और सभी पृष्ठभूमि में तीव्रता सामान्य KESM ढेर प्रोसेसर भागोछवियाँ. सभी डेटा सबफ़ोल्डर के लिए दोहराएँ.
डेटा से multiscale टाइल तैयार सेट और अपलोड करें और KESM ब्रेन एटलस वेब सर्वर में फ़ाइलों को स्थापित.
चित्र देखें. 9.
7. डेटा दृश्य और विश्लेषण
विज़ुअलाइज़ेशन KESM ब्रेन एटलस का उपयोग. Http://kesm.cs.tamu.edu करने के लिए जाओ और उपयुक्त एटलस का चयन करें.
गूगल के नक्शे के रूप में नेविगेट.
गूगल के नक्शे के रूप में और बाहर ज़ूम.
एक अलग गहराई तक जाने का चयन करें, पुल - डाउन मेनू से हर कदम पर जाने के लिए कितना गहरा है, और तब या तो [+] पर क्लिक करें [-] को बढ़ाने या z गहराई की कमी है.
पुल - डाउन मेनू का उपयोग करके उपरिशायी संख्या को समायोजित करें.
पुल - डाउन मेनू का उपयोग करके उपरिशायी अंतराल समायोजित करें.
चित्र देखें. 11.
MeVisLab का उपयोग विज़ुअलाइज़ेशन.
MeVisLab लॉन्च.
एक नई परियोजना बनाएँ.
बाद में, नए मॉड्यूल ty द्वारा पैदा किया जा सकता हैआदेश बॉक्स में मॉड्यूल नाम में पिंग.
बनाएँ मॉड्यूल [Compose3Dfrom2DFiles], और इच्छित फ़ोल्डर में जाओ. फ़ाइल स्ट्रिंग दर्ज करें और [GetFileList] में क्लिक करें. सुनिश्चित करें कि चयनित छवियाँ स्मृति में फिट कर सकते हैं. क्लिक करें [Create3D] आयतन बनाने के लिए.
बनाएँ मॉड्यूल [SetWorldMatrix], और "स्केल" के तहत सेट उपयुक्त voxel आकार (0.6, 0.7, 1.0 10X 0.45NA उद्देश्य के लिए) x, y, z "प्राथमिक बदल". लिंक [Compose3Dfrom2DFiles] के लिए [SetWorldMatrix]
मैट्रिक्स सेट और "उपेक्षा", "ध्यान न दें", "आगे" "मैट्रिक्स" संरचना के अंतर्गत बदल.
बनाएँ मॉड्यूल [Arithmetic1] और "फंक्शन" सेट करने के लिए "(मैक्स Img) उलटें". लिंक [SetWorldMatrix] के लिए [Arithmetic1].
मॉड्यूल बनाएँ [View3D] और [Arithmetic1] कनेक्ट.
View3D में है, जबकि सही माउस बटन दबाया जाता है, माउस के आसपास को स्थानांतरित करने के लिए दहलीज समायोजित. आप क्षेत्रों, परिवर्तन अभिविन्यास (चाल माउस जबकि बाईं माउस बटन दबाया जाता है), परिवर्तन रोशनी (मात्रा renderin फसल कर सकते हैंजी या एमआईपी) पर / बंद पृष्ठभूमि बारी, आदि
चित्र देखें. 10.
8. प्रतिनिधि परिणाम:
यहाँ, हम पूरे मस्तिष्क डेटा और विवरण प्रस्तुत करते हैं. अंजीर. 12-15 शो पूरे मस्तिष्क भारत स्याही, Golgi, और Nissl डेटा 1, 4, 3 सेट.
चित्रा 1 निश्चित, दाग, और एम्बेडेड माउस मस्तिष्क.
चित्रा 2. एंबेडेड माउस मस्तिष्क नमूना नमूना अंगूठी पर घुड़सवार.
चित्रा 3 चाकू एज स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (KESM). KESM की एक तस्वीर के साथ अपने प्रमुख घटकों को चिह्नित दिखाया गया है: (1) उच्च गति लाइन - स्कैन कैमरा, (2) खुर्दबीन उद्देश्य (3) हीरे की चाकू विधानसभा और प्रकाश समरेखक, विशेष (4)cimen टैंक पानी विसर्जन इमेजिंग के लिए (), (5) सटीक तीन अक्ष हवा असर मंच, (6) सफेद प्रकाश माइक्रोस्कोप प्रकाशक, (7) sectioned ऊतक को हटाने के लिए पानी पंप (पीठ में), (8) मंच नियंत्रण और छवि के अधिग्रहण, (9) ग्रेनाइट आधार, और ग्रेनाइट (10) पुल के लिए पीसी सर्वर.
चित्रा 4 इमेजिंग KESM के सिद्धांतों. KESM के आपरेशन के प्रिंसिपल सचित्र है. उद्देश्य और चाकू जगह में आयोजित किया जाता है, जबकि नमूना 20 एनएम और 1-5 की यात्रा गति के संकल्प पर स्थिति चरण चालें (ठोस लाइन के साथ तीर) पर चिपका हो जाता है और हीरे की चाकू के खिलाफ scraped (5 मिमी चौड़े 10X उद्देश्य के लिए), एक पतली चाकू (ठोस लाइन के साथ तीर) पर बह अनुभाग पैदा. रेखा - स्कैन इमेजिंग चाकू की बहुत टिप के पास किया जाता है.
चित्रा 5KESM कैमरा और उद्देश्य ध्यान केंद्रित नियंत्रण.
चित्रा 6 KESM चाकू विधानसभा और नियंत्रण.
7 चित्रा प्रारंभिक अवलोकन पोर्ट के माध्यम से ध्यान केंद्रित है.
12 चित्रा KESM पूरे मस्तिष्क भारत स्याही डेटा. KESM डेटा के ढेर के वॉल्यूम visualizations के संवहनी डेटा सेट के लिए दिखाए जाते हैं. (क) संवहनी डेटा के बंद करें. ~ चौड़ाई 100 उम. (बी) पूरे माउस मस्तिष्क vasculature की तीन मानक दृश्य (उच्च संकल्प डेटा से subsampled). चौड़ाई 10mm ~.
13 चित्रा KESM पूरे मस्तिष्क माउस Golgi डेटा.
14 चित्रा KESM Golgi डेटा विवरण.
15 चित्रा KESM पूरे मस्तिष्क Nissl डेटा.(क) ऊपर बंद एन केissl डेटा. ~ 300 3 उम. (बी) पूरे माउस मस्तिष्क Nissl डेटा के तीन मानक दृश्य (उच्च संकल्प डेटा से subsampled). क्रॉस अनुभाग आंतरिक संरचना का एक स्पष्ट देखने के लिए दिखाया गया है.
KESM जैविक नमूने (~ 1 3 सेमी) की बड़ी मात्रा के एक सर्वेक्षण submicrometer स्तर के लिए अनुमति देता है . मात्रा के इस तरह पूरे दिमाग, फेफड़े, हृदय, गुर्दे जैसे छोटे पशु अंगों, पकड़ के लिए पर्याप्त है, आदि ऐसे अंगों से छवियों को स्कैन इन अंगों के संरचनात्मक संगठन के बारे में अभूतपूर्व मात्रात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं और विभिन्न कार्यात्मक के कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग को सक्षम सर्किट और नेटवर्क गतिशीलता, बिजली के गुण, द्रव और हवा प्रवाह की गतिशीलता, और मांसपेशियों में गतिशीलता सहित इन अंगों के पहलुओं.
नमूना तैयारी प्रोटोकॉल और प्रोटोकॉल विश्लेषण के बाद इस लेख में विस्तृत बाहर अनुसंधान समूहों को मदद करने के लिए KESM करने के लिए आसान पहुँच और परिणामी डेटा की उम्मीद कर रहे हैं. KESM आपरेशन प्रोटोकॉल इन बाह्य शोधकर्ताओं मदद करने के लिए इस अनूठी इमेजिंग साधन के लाभ और सीमाओं की सराहना करेंगे.
इस परियोजना के NIH / NINDS द्वारा वित्त पोषित किया गया था (# 1R01-NS54252), NSF (0,905,041 #, # 0,079,874), टेक्सास उन्नत प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (एटीपी # ०,००,५१२-+०,१४६-2001, एटीपी # ०००५१२-+०,२६१-2001), टेक्सास एक एंड एम रिसर्च फाउंडेशन, कंप्यूटर और टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय, और 3Scan में विज्ञान और इंजीनियरिंग विभाग. हम बर्नार्ड मेसा (माइक्रो सितारा प्रौद्योगिकी) के लिए तकनीकी परामर्श और KESM उपकरण के लिए समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. KESM के डिजाइन और कार्यान्वयन के प्रमुख भागों ब्रूस एच. McCormick है, जो 2007 में मृत्यु हो गई के द्वारा किया गया था.
Abbott, L.C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. In Neuroscience Meeting Planner, Washington, DC: Society for Neuroscience Program No. 504.2 (2008).
Abbott, L.C. & Sotelo, C. Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices. Journal of Comparative Neurology, 426, 316-329, (2000).
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Choe, Y., Han, D., Huang, P.-S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., & Abbott, L.C. Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures. In Neuroscience Meeting Planner, Chicago, IL: Society for Neuroscience Program No. 389.10. Online (2009).
Choe, Y., Abbott, L.C., Han, D., Huang, P.S., Keyser, J. Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., & McCormick, B.H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. In A. Ravi Rao and Guillermo Cecchi, editors, High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications, Artech House, Boston, MA, 11-37 (2008).
Choe, Y., Abbott, L.C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A.M., Fiorito, F., Edelman, D.B., & McKinstry, J.L. Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope. Nineteenth Annual Computational Neuroscience Meeting: CNS*2010, BMC Neuroscience., 11 (Suppl 1), 136, (2010).
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Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L.C., Keyser, J., & Choe, Y. Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM. Biomedical Optics Express, 2, 2888-2896, (2008).
McCormick, B.H. Development of the Brain Tissue Scanner, Technical Report, Department of Computer Science, Texas A & M University, College Station, TX, March 18, 2002 [http://research.cs.tamu.edu/bnl/static/pubs/McC02.pdf], (2002).
Sporns, O., Tononi, G., & Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology., 1, e42 (2005).
The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
to:
2. Specimen preparation: Nissl
This protocol closely follows the protocol of Mayerich et al.7
The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of cold 4% phosphate-buffered paraformaldehyde (pH 7.4).
The mouse is then perfused with 100 mL of a solution of 0.1% thionin dye in deionized water, and the body placed in the refrigerator (4 °C) for 24 hours.
After 24 hours, the brain is removed from the calvaria and placed in a fresh solution of 0.1% thionin and left at 4 °C for 7 days. The lengthy duration of this procedure was to ensure full infiltration of thionin into the en bloc preparation.
The brain is then destained and dehydrated through a graded series of ethanols starting with 50% ethanol and water and increasing to 100% ethanol over a time period of 6 weeks. The ethanol changes from 50% to 70% are stored in the refrigerator (4 °C) and all changes of ethanol above 70% are stored at room temperature.
After three changes of acetone (2-4 days in each solution at room temperature), the brain is then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
