Изготовление образцов, Imaging, и анализ протоколов для ножа сканирующей микроскопии

Important: There has been an erratum issued for this article. Read more…

Choe, Y., Mayerich, D., Kwon, J., Miller, D. E., Sung, C., Chung, J. R., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (58), e3248, doi:10.3791/3248 (2011).

Крупные достижения в области высокой пропускной способностью, с высоким разрешением, 3D микроскопии позволили приобретения больших объемов данных на нейроанатомической субмикронных разрешения. Одним из первых таких инструментов производству целого мозга масштаба данные ножа сканирующего микроскопа (KESM) ^{7, 5, 9,} разработанный и размещенный в лаборатории авторов. KESM был использован для раздела и образ целого мозга мыши на субмикронных разрешение, раскрывая сложные детали нейронных сетей (АГ) ^{1, 4, 8,} сосудистой сети (тушь) ^{1, 4} и тела клетки распределения (Нисслю) ³ . Использование KESM не ограничивается мыши, ни мозг. Мы успешно отображаемого осьминога мозг ^6, мыши легких и головного мозга крыс. В настоящее время мы работаем над целой рыбы эмбрионов зебры. Данные, как они могут внести значительный вклад в исследование connectomics ^10; на микроциркуляцию и гемодинамических исследований; и стереологии исследования полодинь точного наземного истины.

В этой статье мы опишем трубопроводов, в том числе подготовки образцов (фиксация, окрашивание и вложение), KESM конфигурации и настройки, секционирования и обработки изображений с KESM, обработки изображений, подготовки данных и визуализации данных и анализа. Акцент будет сделан на подготовку образца и визуализации / анализ полученных данных KESM. Мы ожидаем, что подробный протокол, представленные в этой статье, чтобы помочь расширить доступ к KESM и увеличения его использования.

1. Подготовка образца: Гольджи-Кокса

1. Этот протокол внимательно следит протокол Mayerich и соавт. ^7.
2. Мышь C57BL/6J глубоко под наркозом использованием ингаляционных изофлуран анестезии, а затем обезглавили.
3. Мозг демонтирован и помещен в Гольджи-Кокса фиксации раствором (1% хромата калия, 1% бихромата калия и 1% хлорида ртути в деионизованной воде).
4. Мозг остается в Гольджи-Кокса решение в темноте, при комнатной температуре от 10 до 16 недель.
5. Мозги промывают в деионизированной воде на ночь в темноте.
6. Промывать мозг погружается в 5% раствор гидроксида аммония в деионизованной воде в течение 7 до 10 дней в темном месте при комнатной температуре. Это длительное время на подготовку было обеспечить проникновение весь мозг, так что черный осадок имел возможность полностью форме в ткани.
7. Мозг снова промыть в деионизированной воде при комнатной температуре в течение 4 часов и ткурица обезвоженной через градуированные ряду спиртов этилового 50% и 70% в холодильнике (4 ° С), и 85%, 95% (3 изменения), и 100% (от 4 до 5 смен) при комнатной температуре. Мозг остается в каждом решении в течение 24 часов.
8. Обезвоженный мозг затем положить в ацетоне (от 3 до 4 изменений, каждое в течение одного дня), далее следуют аралдит-ацетон с аралдит до ацетона соотношении 1:2, 1:1, 2:1, и, наконец, 100% аралдит (3 изменений, каждый раз на ночь) в холодильнике (4 ° С).
9. Наконец, рассматриваются мозг встроен в 100% аралдит и нагревают до 60 ° С в течение 3 дней (см. вложение протокола в Abbott и Сотело ^2).
   Если пробы встроенные в LR Белый затем образцы передаются из последних 100% раствор этанола через три изменения решение LR Белый, каждый из которых хранится в холодильнике в течение ночи, которая является стандартной процедурой до полимеризации. Три изменения вносятся в целях обеспечения полного проникновения. Образец ткурица переданы на свежий LR Белый, который полимеризуется в закрытой таре при температуре 60 ° С в течение 24 часов, что необходимое количество времени и температуры для правильной полимеризации.
10. Рис. 1 показана Гольджи-Кокса окрашенных мозга встроены в Araldite.
11. Вылечить образца блок затем монтируется на металлическое кольцо образец использования эпоксидной смолы, и по бокам блока обрезается по мере необходимости (см. рис. 2).

2. Подготовка образца: Нисслю

1. Мышь глубоко наркозом использованием кетамина и ксилазина (1,7 мг кетамина / 0,26 мг ксилазина на 20 грамм массы тела) вводят внутрибрюшинно, а затем перфузию transcardially, используя 50 мл комнатной температуре фосфатном буферном растворе (рН 7,4), затем 250 мл комнате Температура 10% нейтральном буферном растворе формалина (рН 7,4). и, наконец, с 3,0 мл неразбавленной тушью.
2. Всего перфузии тело с физиологическим раствором и фиксатор необходимо очистить кровь от сердечно-сосудистой системы и зафиксировать ти ОПРОСЫ. Перфузии тушью необходимо полностью заполнить сосудистой сердечно-сосудистой системы.
3. В результате мозг то обезвоженной через серию градуированных спирты этиловый (25% -100%), а затем встроенные в пластиковые аралдит следующий протокол в 1.8-1.9 выше. Если LR белый вложение средой, то протокол в 1,10 выше следования.

4. Подготовка образца: Общий вид, общие органы

1. Для общего случая, фиксация может быть сделано либо с 10% нейтральном буферном растворе формалина или 4% параформальдегида.
2. Для небольших объемов тканей, диффузия, а не перфузии рекомендуется для фиксации и окрашивания. В случае мелких организмов или органов, окрашивание также может быть сделано во время обезвоживания процесса.
3. Вложение протокол же, как и выше, хотя время для решения инфильтрация может быть уменьшена для органов или организмов, которые намного меньше, чем весь мозг мыши.

1. Выключите насос, свою очередь, на сцене, включите камеру, включите осветитель.
2. Поднимите нож и объективным.
3. Установить образец кольцо.
4. Мера измерения образца и создать файл конфигурации для KESM этап Controller2 приложения.
5. Начало KESM этап Controller2 и инициализировать стадии.
6. Нижний нож / цель, включить насос.
7. Фокус объективных и камера, поворотом ручки фокусировки на оптические поезд и настроечного поля зрения камеры относительно ножа.
8. Нажмите на [Go], чтобы начать съемки.
9. См. рис. 3-8. Смотрите ^{9, 7} для технических деталей.

6. Обработка изображений и подготовки данных

1. Скопируйте Процессор KESM стека исполняемой в папку данных в конфигурационной папке файл (00000, 00001 и др.).
2. Запуск процессора KESM стека для удаления артефактов освещения и нормализовать интенсивность фона во всехизображений. Повторите эти действия для всех данных, вложенные папки.
3. Подготовка многомасштабных плитки из набора данных и загрузить и установить файлы в мозг KESM веб-сервер Atlas.
4. См. рис. 9.

7. Визуализация данных и анализа

1. Визуализация использованием Атлас KESM мозга. К http://kesm.cs.tamu.edu и выберите соответствующий атлас.
   1. Перейдите, как в Google Maps.
   2. Увеличение и уменьшение масштаба, как в Google Maps.
   3. Для перехода на разной глубине, выбрать, как глубоко, чтобы пойти на каждом шаге из выпадающего меню, а затем нажмите на кнопки [+] или [-] для увеличения или уменьшения г глубины.
   4. Настраивает номер с помощью выпадающего меню.
   5. Настраивает интервал с помощью выпадающего меню.
   6. См. рис. 11.
2. Визуализация использованием MeVisLab.
   1. Запуск MeVisLab.
   2. Создать новый проект.
   3. В следующем, новые модули могут быть по созданию типинг в имени модуля в окне команд.
   4. Создать модуль [Compose3Dfrom2DFiles], и перейти к нужной папке. Введите строку файла и щелкните на [GetFileList]. Убедитесь, что выбранные изображения может поместиться в памяти. Нажмите кнопку [Create3D] для создания объема.
   5. Создать модуль [SetWorldMatrix], и установить "Масштаб" в разделе "Элементарные преобразования" х, у, г до соответствующего размера воксела (0,6, 0,7, 1,0 для 10X 0.45NA цель). Ссылка [Compose3Dfrom2DFiles] до [SetWorldMatrix].
   6. Установить матрицы и преобразования в "Матрице Состав" на "Игнорировать", "Игнорировать", "Вперед".
   7. Создать модуль [Arithmetic1] и установите "Функция", чтобы "Обратить (Max-IMG)".
      Ссылка [SetWorldMatrix] до [Arithmetic1].
   8. Создать модуль [View3D] и подключить [Arithmetic1].
   9. В View3D, в то время как правая кнопка мыши нажата, перемещать мышь вокруг настроить порог. Можно обрезать регионов, изменить ориентацию (перемещение мыши, левая кнопка мыши нажата), изменение освещенности (объем renderinг или ПМС), включить / выключить фон и др.
   10. См. рис. 10.

8. Представитель Результаты:

Здесь, мы представляем весь мозг данных и деталей. Рис. 12-15 показать весь мозг тушь, Гольджи, и Нисслю наборов данных ^{1, 4, 3.}

Рисунок 1. Фиксированная, с пятнами, и встроенных мозга мыши

Рисунок 2. Embedded образцов мозга мыши установлен на образце кольцо.

Рисунок 3. Сканирование Knife Edge микроскоп (KESM). Фотография KESM выдается его основных компонентов отмечены: (1) высокоскоростной линии сканирования камера, (2) объектива микроскопа, (3) алмаз сборку ножа и легкой коллиматор, (4) спеcimen резервуар (для воды изображений погружение), (5) трехосный точность воздушного подшипника этапе (6) белого света осветителя микроскопа, (7) Водяной насос (сзади) для удаления секционного ткани, (8) PC сервер для контроля стадии и получения изображений, (9) гранитным основанием, и (10) гранита моста.

Рисунок 4. Изображений принципы KESM. Основные работы KESM иллюстрируется. Объективные и нож удерживается на месте, в то время образцу, наносимой на стадии позиционирования ходов (стрелки с сплошная линия) с разрешением 20 нм, а скорость движения 1-5, и получает соскабливают ножом против алмаза (5 мм в ширину для 10х цель), генерируя шлифе перетекание нож (стрелка с сплошная линия). Линия сканирования изображений производится у самого кончика ножа.

Рисунок 5. Камеру KESM и объективного контроля фокусировки.

Рисунок 6. KESM сборку ножа и элементы управления.

Рисунок 7. Первоначальная фокусировки с наблюдением порт.

Рисунок 8. KESM этап контроллер 2 приложений (скриншот).

Рисунок 9. KESM стек процессор приложений (скриншот).

Рисунок 10. MeVisLab приложение (скриншот).

Рисунок 11 KESM мозга Атлас:. Web-интерфейс (скриншот).

Рисунок 12. KESM целого мозга данных тушь. Том визуализации данных KESM стеки показана сосудистого набора данных. (А) Крупный план сосудистой данных. Ширина ~ 100 мкм. (BD) Три стандартных видом на весь мозг мыши сосудистую (subsampled из данных высокого разрешения). Ширина ~ 10 мм.

Рисунок 13. KESM весь мозг мыши Гольджи данных.

Рисунок 14. KESM Гольджи данных деталей.

Рисунок 15. KESM целого мозга Нисслю данных. (А) крупным планом Nissl данных. ~ 300 мкм ^3. (BD) Три стандартных видом на весь мозг мыши данных Нисслю (subsampled из данных высокого разрешения). Сечение показано четкое представление о внутренней структуре.

KESM позволяет субмикронного уровня обследования больших объемов биологических образцов (~ 1 см ^3). Такой объем достаточно, чтобы держать весь органов малого животных, таких как мозг, легкие, сердце, почки и др. Отсканированные изображения из таких органов могут обеспечить беспрецедентный количественную информацию о структурной организации этих органов, а также включить вычислительного моделирования различных функциональных аспекты этих органов, в том числе схемы и сетевые динамики, электрические свойства, динамика жидкостей и воздушных потоков, и мышечная динамика.

Протокол подготовки образцов и после анализа протоколов, описанных в этой статье, как ожидается, поможет за пределами исследовательских групп, чтобы иметь более легкий доступ к KESM и полученных данных. Протокол KESM операция поможет этим внешним исследователям оценить преимущества и ограничения этого уникального метода визуализации.

Тодд Хаффман С 3Scan, коммерческие компании, которая производит и продает KESM технологии (патент США # 6744572).

Этот проект был профинансирован NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0905041, # 0079874), Технология Техаса Расширенные программы (# АТФ-000512-0146-2001, # АТФ-000512-0261-2001), штат Техас М & Research Foundation, факультете компьютерных наук и инженерии в Техасе & M University и 3Scan. Мы хотели бы поблагодарить Бернара Mesa (Micro Star Technologies) для технических консультаций и поддержки KESM приборов. Основные части разработки и реализации KESM делал Брюс Х. Маккормик, который умер в 2007 году.

1. Abbott, L.C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. In Neuroscience Meeting Planner, Washington, DC: Society for Neuroscience Program No. 504.2 (2008).
2. Abbott, L.C. & Sotelo, C. Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices. Journal of Comparative Neurology, 426, 316-329, (2000).
3. Choe, Y., Abbott, L.C., Miller, D.E., Han, D., Yang, H.-F., Chung, J.R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., & Smith, S.J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. In Neuroscience Meeting Planner, San Diego, CA: Society for Neuroscience. Program No. 516.3. Online (2010).
4. Choe, Y., Han, D., Huang, P.-S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., & Abbott, L.C. Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures. In Neuroscience Meeting Planner, Chicago, IL: Society for Neuroscience Program No. 389.10. Online (2009).
5. Choe, Y., Abbott, L.C., Han, D., Huang, P.S., Keyser, J. Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., & McCormick, B.H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. In A. Ravi Rao and Guillermo Cecchi, editors, High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications, Artech House, Boston, MA, 11-37 (2008).
6. Choe, Y., Abbott, L.C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A.M., Fiorito, F., Edelman, D.B., & McKinstry, J.L. Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope. Nineteenth Annual Computational Neuroscience Meeting: CNS*2010, BMC Neuroscience., 11 (Suppl 1), 136, (2010).
7. Mayerich, D., Abbott, L.C., & McCormick, B.H. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. Journal of Microscopy, 231, 134-143, (2008).
8. Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L.C., Keyser, J., & Choe, Y. Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM. Biomedical Optics Express, 2, 2888-2896, (2008).
9. McCormick, B.H. Development of the Brain Tissue Scanner, Technical Report, Department of Computer Science, Texas A & M University, College Station, TX, March 18, 2002 [http://research.cs.tamu.edu/bnl/static/pubs/McC02.pdf], (2002).
10. Sporns, O., Tononi, G., & Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology., 1, e42 (2005).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.