Protocoles de préparation des échantillons, d'imagerie et d'analyse pour la microscopie à balayage en lame de couteau

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Choe, Y., Mayerich, D., Kwon, J., Miller, D. E., Sung, C., Chung, J. R., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (58), e3248, doi:10.3791/3248 (2011).

Des avancées majeures dans le haut débit, haute résolution, des techniques de microscopie en 3D ont permis l'acquisition de gros volumes de données neuroanatomiques à la résolution submicroniques. Un des premiers instruments tels la production entière-cerveau-données à grande échelle est le microscope à effet couteau (KESM) ^{7, 5, 9,} développé et hébergé dans le laboratoire des auteurs. KESM a été utilisé pour la section et le cerveau de souris l'image entière à la résolution submicroniques, révélant les détails complexes des réseaux neuronaux (Golgi) ^{1, 4, 8,} les réseaux vasculaires (encre de Chine) ^{1, 4,} et la distribution du corps cellulaire (Nissl) ³ . L'utilisation de KESM n'est pas limitée à la souris ni le cerveau. Nous avons réussi à imager le cerveau ⁶ poulpes, des poumons de souris, et le cerveau du rat. Nous travaillons actuellement sur l'ensemble des embryons de poisson zèbre. Des données comme celles-ci peuvent grandement contribuer à la recherche connectomics ^10; à la microcirculation et de la recherche hémodynamique et à la recherche par les dispositions stéréologieDing an. exacte réalité de terrain

Dans cet article, nous allons décrire le pipeline, y compris la préparation des échantillons (fixation, coloration, and Embedding), la configuration et l'installation KESM, de sectionnement et d'imagerie avec le KESM, traitement d'image, la préparation des données et la visualisation de données et d'analyse. L'accent sera mis sur la préparation des échantillons et la visualisation / l'analyse des données obtenues KESM. Nous prévoyons que le protocole détaillé présenté dans cet article pour aider à élargir l'accès à KESM et augmenter son utilisation.

1. Préparation des éprouvettes: Golgi-Cox

1. Ce protocole suit de près le protocole de Mayerich et al. ^7.
2. La souris C57BL/6J est profondément anesthésié à l'aide d'anesthésie par inhalation d'isoflurane et ensuite décapité.
3. Le cerveau est enlevé et placé dans une solution de fixation de Golgi-Cox (1% chromate de potassium, 1% de bichromate de potassium, et 1% de chlorure mercurique dans de l'eau déminéralisée).
4. Le cerveau est laissé dans la solution de Golgi-Cox dans l'obscurité, à température ambiante, pendant 10 à 16 semaines.
5. Les cerveaux sont rincés à l'eau déminéralisée nuit dans l'obscurité.
6. Le cerveau rincé est immergé dans une solution d'hydroxyde d'ammonium à 5% dans de l'eau déminéralisée pour les 7 à 10 jours dans l'obscurité à température ambiante. Cette fois-ci une longue préparation était d'assurer l'infiltration de l'ensemble du cerveau, de sorte que le précipité noir avait une chance pour complètement se forment dans le tissu.
7. Le cerveau est à nouveau rincées à l'eau déminéralisée à température ambiante pendant 4 heures et tpoule déshydraté par une série graduée d'alcools éthylique: 50% et 70% dans le réfrigérateur (4 ° C), et 85%, 95% (3 changements), et 100% (4 à 5 changements) à température ambiante. Le cerveau est laissé dans chaque solution pendant 24 heures.
8. Le cerveau déshydraté est ensuite mis dans de l'acétone (3 à 4 changements, chacun pour un jour), suivi par un mélange araldite-acétone à l'araldite à l'acétone ratio de 1:2, 1:1, 2:1, et enfin en 100 araldite% (3 changements, chaque fois pendant la nuit), dans le réfrigérateur (4 ° C).
9. Enfin, le cerveau traitée est intégré dans l'araldite 100% et chauffée à 60 ° C pendant 3 jours (protocole intégrant cf. Abbott et Sotelo ^2).
   Si les échantillons sont intégrés dans LR blanc, puis les échantillons sont transférés de la solution d'éthanol à 100% par le biais dernière trois changements de LR Blanc solution qui sont chacun conservés dans le réfrigérateur pendant la nuit, qui est une procédure standard avant la polymérisation. Trois changements sont faits pour assurer l'infiltration complète. Le spécimen est tpoule frais LR transféré à blanc qui est polymérisé dans un récipient fermé à 60 ° C pendant 24 heures, ce qui est le montant requis de temps et la température de polymérisation approprié.
10. Fig. 1 montre un cerveau de Golgi-Cox teinté intégré dans l'Araldite.
11. Le bloc de spécimen de guérir est ensuite montée sur le ring échantillon métallique à l'aide d'époxy, et les côtés du bloc coupé au besoin (voir fig. 2).

2. Préparation des éprouvettes: Nissl

1. La souris est profondément anesthésié à l'aide de kétamine et de xylazine (1,7 mg de kétamine / xylazine 0,26 mg par 20 grammes de poids corporel) par voie intrapéritonéale injecté puis perfusé transcardiaque utilisant 50 mL de la température ambiante du tampon phosphate salin (pH 7,4), suivi par 250 ml de chambre Température de 10% du formol tamponné neutre (pH 7,4). et enfin avec 3,0 cc d'encre de Chine pur.
2. Perfusion du corps entier avec une solution saline et de fixateur est nécessaire pour effacer le sang du système cardio-vasculaire et de fixer le ti es questions. Perfusion avec l'encre de Chine est nécessaire pour remplir complètement la vascularisation du système cardio-vasculaire.
3. Le cerveau qui en résulte est ensuite déshydraté par une série d'alcools éthyliques classés (25% -100%), puis intégrées dans le plastique araldite suivant le protocole de 1.8 à 1.9 ci-dessus. Si le blanc est la LR milieu d'inclusion, puis le protocole en 1.10 ci-dessus est suivie.

4. La préparation de l'échantillon: les espèces génériques, les organes générique

1. Pour le cas générique, la fixation peut se faire soit avec 10% de paraformaldéhyde neutres% du formol tamponné ou 4.
2. Pour les volumes du tissu de petites, la diffusion, au lieu de la perfusion est recommandé pour la fixation et coloration. Dans le cas des petits organismes ou d'organes, la coloration peut également être fait durant le processus de déshydratation.
3. Le protocole intégrant est le même que ci-dessus, bien que les temps d'infiltration solution peut être réduite pour les organes ou organismes qui sont beaucoup plus petits que le cerveau de souris ensemble.

1. Arrêter la pompe, tourner sur scène, tourner la caméra, allumez l'illuminateur.
2. Soulever un couteau et objective.
3. Installez anneau de spécimen.
4. Mesurer la dimension éprouvette et de créer un fichier de configuration pour l'application scène KESM Controller2.
5. Départ de l'étape KESM Controller2 et initialiser la scène.
6. Basse couteau / objectif, tournez sur la pompe.
7. Point de vue objectif et la caméra, en tournant le bouton de mise sur le train optique et en ajustant champ de la caméra de vue par rapport à l'arête du couteau.
8. Appuyez sur [Go] pour lancer l'imagerie.
9. Voir fig. 3-8. Voir ^{9, 7} pour les détails techniques.

6. Traitement d'image et de préparation des données

1. Copiez le fichier exécutable du processeur KESM pile dans le dossier de données dans le dossier du fichier de configuration (00000, 00001, etc.)
2. Exécutez le processeur Stack KESM pour enlever des artefacts d'éclairage et de normaliser l'intensité de fond dans tous lesimages. Répétez l'opération pour tous les sous-dossiers de données.
3. Préparer les tuiles multi-échelle de l'ensemble des données et de télécharger et mettre en place les fichiers dans le serveur Web de l'Atlas du cerveau KESM.
4. Voir Fig. 9.

7. La visualisation des données et l'analyse

1. Visualisation à l'aide de l'atlas du cerveau KESM. Aller à la http://kesm.cs.tamu.edu et sélectionnez l'atlas approprié.
   1. Naviguer comme dans Google Maps.
   2. Zoom avant et arrière comme dans Google Maps.
   3. Pour aller à une profondeur différente, sélectionnez la profondeur pour aller à chaque étape à partir du menu déroulant, puis cliquez soit sur [+] ou [-] pour augmenter ou diminuer la profondeur z.
   4. Ajustez le nombre de superposition en utilisant le menu déroulant.
   5. Réglez l'intervalle de superposition en utilisant le menu déroulant.
   6. Voir Fig. 11.
2. Visualisation à l'aide MeVisLab.
   1. Lancement MeVisLab.
   2. Créez un nouveau projet.
   3. Dans la suite, de nouveaux modules peuvent être créer par Typing dans le nom du module dans la boîte de commande.
   4. Créer le module [Compose3Dfrom2DFiles], et aller vers le dossier souhaité. Entrez la chaîne de fichier et cliquez sur [GetFileList]. Assurez-vous que les images sélectionnées peuvent tenir en mémoire. Cliquez sur [Create3D] pour créer du volume.
   5. Créer le module [SetWorldMatrix], et réglez le "Scale" sous "élémentaire Transforme" x, y, z pour la taille de voxel appropriée (0,6, 0,7, 1,0 pour un objectif 10X 0.45NA). Lien [Compose3Dfrom2DFiles] à [SetWorldMatrix].
   6. Set Matrix et se transforme sous "composition de la matrice" à "Ignorer", "Ignorer", "Forward".
   7. Créer le module [Arithmetic1] et réglez la "Fonction" pour "Inverser (Max-Img)".
      Lien [SetWorldMatrix] à [Arithmetic1].
   8. Créer le module [View3D] et connectez [Arithmetic1].
   9. En View3D, alors que le bouton droit de la souris est enfoncé, déplacez la souris pour ajuster le seuil. Vous pouvez rogner les régions, l'orientation du changement (déplacez la souris alors que le bouton gauche de la souris est pressé), l'éclairage du changement (renderin volumesg ou PIM), activer / désactiver de fond, etc
   10. Voir Fig. 10.

8. Les résultats représentatifs:

Ici, nous présentons l'ensemble du cerveau de données et d'informations. Figues. 12-15 montrent toute-encéphalique encre de chine, de Golgi et de Nissl ensembles de données ^{1, 4, 3.}

Figure 1. Cerveau de souris fixés, colorés, et embarquées

Figure 2. Embarqué échantillon de cerveau de souris monté sur la bague spécimen.

Figure 3. Le microscope à balayage Knife Edge (KESM). Une photo de l'KESM est montré avec ses principaux composants marqués: (1) l'assemblage ligne à grande vitesse de balayage la caméra, l'objectif de microscope (2), (3) un couteau de diamant et collimateur de lumière, (4) SPERéservoir Cimen (pour l'imagerie immersion dans l'eau), (5) à trois axes de précision à coussin d'air étape, (6) illuminateur de microscope à lumière blanche, pompe à eau (7) (dans le dos) pour le prélèvement de tissus sectionnés, (8) PC serveur pour le contrôle de la scène et d'acquisition d'image, base de granit (9), et le pont de granit (10).

Figure 4. Principes de l'imagerie KESM. Le principe de fonctionnement de KESM est illustré. L'objectif et le couteau est maintenu en place, tandis que le spécimen apposé sur le stade de positionnement se déplace (flèche avec une ligne solide) à la résolution de 20 nm et la vitesse de déplacement de 1-5, et obtient raclait le couteau de diamant (5 mm de large pour objectif 10X), générant une section mince s'écoulant sur le couteau (flèche avec une ligne solide). Ligne-scan imagerie se fait à proximité de la pointe du couteau.

Figure 5. KESM appareil et l'objectif de contrôle mise au point.

Figure 6. Assemblée couteau KESM et les contrôles.

Figure 7. Initiale se concentrant sur ​​le port d'observation.

Figure 8. Controller Stade KESM 2 application (capture d'écran).

Figure 9. Demande KESM processeur pile (screenshot).

Figure 10. Demande MeVisLab (screenshot).

Figure 11 KESM Atlas du cerveau:. Interface web (screenshot).

Figure 12. KESM ensemble du cerveau des données encre de Chine. Volume de visualisations de données KESM piles sont présentés pour l'ensemble des données vasculaires. (A) Gros plan sur les données vasculaire. Largeur ~ 100 um. (Bd) Trois vues standard de l'ensemble de la vascularisation du cerveau de souris (sous-échantillonné à partir des données haute résolution). Largeur ~ 10mm.

Figure 13. KESM ensemble du cerveau de souris de données de Golgi.

Figure 14. KESM Golgi détail des données.

Figure 15. KESM ensemble du cerveau des données de Nissl. (A) Gros plan sur la Ndes données ISSL. ~ 300 um ^3. (Bd) Trois vues standard de l'ensemble des données de la souris Nissl cerveau (sous-échantillonné à partir des données haute résolution). Coupe transversale indiquée pour une vision claire des structures internes.

Le KESM permet pour une enquête submicroniques niveau de grands volumes d'échantillons biologiques (~ 1 cm ^3). Ce type de volume est suffisant pour contenir l'ensemble des organes des petits animaux, tels que le cerveau, les poumons, cœur, rein, etc images numérisées à partir d'organes peuvent fournir sans précédent, des informations quantitatives sur l'organisation structurale de ces organes, et de permettre la modélisation computationnelle des fonctionnelles diverses aspects de ces organes, y compris la dynamique du circuit et le réseau, propriétés électriques, fluide et dynamique de l'écoulement de l'air, et la dynamique musculaire.

Le protocole de préparation des échantillons et de post-analyse de protocole détaillé dans cet article sont attendus pour aider les groupes de recherche en dehors d'avoir plus facilement accès à l'KESM et les données résultantes. Le protocole de coopération KESM aidera ces chercheurs externes à apprécier les avantages et les limites de cette modalité d'imagerie unique.

Todd Huffman est avec 3Scan, une société commerciale qui fabrique et commercialise la technologie KESM (brevet américain 6,744,572 #).

Ce projet a été financé par le NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), la NSF (# 0905041, # 0079874), le Programme du Texas Advanced Technology (# ATP-000512-0146-2001, # ATP-000512-0261-2001), Texas A & M Research Foundation, Department of Computer Science et génie à la Texas A & M University, et 3Scan. Nous tenons à remercier Bernard Mesa (Micro Star Technologies) pour la consultation technique et de soutien pour l'instrumentation KESM. De grandes parties de la conception et la mise en œuvre du KESM a été réalisé par Bruce H. McCormick, qui mourut en 2007.

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