A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA

1. Impressão de microarrays miRNA personalizado

1. Imprimir o microarray slides usando o microarray serviços instalação do núcleo de uma universidade ou uma empresa. A qualidade de microarray de fabricação é um dos fatores mais críticos para o sucesso de um experimento de microarray. Tente alguns serviços, se possível. Idealmente, seria imprimir 5-10 slides de cada vez, e todos os slides parecem idênticos, com bem separados, os pontos individuais.
2. Para suporte microarray, usamos as lâminas GAPS II revestido.
3. Para sondas de miRNA, usamos o nCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2.
4. Dissolver todos os oligonucleotídeos em 3 x SSC, 10 mM e quadruply imprimi-los nos slides. Corrigir os slides por irradiação ultravioleta acordo com as instruções para os slides GAAP II. Deslize o rótulo com uma caneta de diamante para marcar a área e laterais com as pontas de prova impressa. Loja em 22 ° C.

2. Preparação de amostras

1. Qualquer métodoou reagente pode ser usado para isolar RNA, enquanto preserva pequenos RNAs. Geralmente usamos Trizol (Invitrogen) para extrair RNA total, com quantidade satisfatória e qualidade das preparações de RNA, medido por A _260nm e A _280nm leituras.
2. RNA para rotulagem, mix ~ 25 mg de RNA total com 0,5 mg de 5'-PCU-DY547-3 ^'6 em 1 x tampão (50 mM HEPES, pH 7.8, 20 mM MgCl _2, 10 mg / ml BSA, 10% DMSO), contendo ~ 20 unidades T4 RNA Ligase 1, suplementado com 10 mM DTT ~ e volume ~ 0,02-0,03 final do T4 10 x RNA Ligase um buffer para ATP.
3. Permitir a rotulagem para prosseguir no gelo dentro de uma geladeira por 2-24 horas. RNA precipitado com acetato de sódio 0,3 M e 3 volumes de etanol. Para ligação eficiente e precipitação, dissolver RNA total em mais de 2 mg / ml, e manter o volume total de ligadura em ~ 20 mL.
   1. Se RNA menos está disponível, a quantidade de entrada de RNA e 5'-PCU-DY547-3 'pode ser reduzida. </ Li>
   2. Se o RNA é muito diluída, adicione portador tal como o tRNA de levedura para ajudar na precipitação.
4. Combinar e rótulo em mg um total de oligonucleotídeos de referência DNA correspondente a um subconjunto de miRNAs em mamíferos usando o Ulysis Alexa Fluor 647 Kit Rotulagem de Ácido Nucleico ⁶ como um controle para o processo de hibridização. Purificar o DNA rotulados com uma coluna CentriSep e salvar no escuro a -20 ° C.

3. Hibridação de microarrays

1. Para utilizar os slides, pela primeira vez, pré-hibridizar os slides em uma solução filtrada de 3 x SSC, 0,1% SDS, BSA 0,2% por 30-60 min a 37 ° C. Submergir em água algumas vezes, então, em isopropanol. Secar as lâminas usando uma centrífuga com um adaptador de slide de 100 g por 5 min a 22 ° C.

Nota: Nós usamos câmaras Corning hibridização microarray e mSeries Erie Científico de Lifterslips para realizar a hibridação microarray.

2. Lavar o lifterslips em água, em seguida, em etanol, antes da secagem ao ar. Coloque um slide dentro de uma base da câmara de hibridização de microarrays, e um lifterslip em cima do slide. O lifterslip vai cobrir a área da sonda, com o seu contato com a tiras brancas slide.
3. No escuro, girar o precipitado, RNA marcados. Lavá-lo uma vez com etanol 70%, eo ar seco do sedimento. O pellet deve ser avermelhada.
4. Prepare uma solução de hibridização contendo 400 mM Na ₂ HPO ₄ pH 7,0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% formamida ⁶ com 1/15-1/100 mL do purificado, rotulados de referência DNA (2,4) por amostra de RNA. A quantidade de DNA de referência adicionada depende de quantos diferentes oligonucleotídeos são rotulados (2.4). Se houver mais de 100, em seguida, menos de diluição é necessária.
5. Dissolver o sedimento RNA bem com ~ 60 mL da solução de hibridização.
6. Adicionar 20 l de água para cada um dos poços de umidificação na base da câmara Corning microarray de hibridização.
7. Adicionar tele mistura de RNA e DNA rotulados de referência para o slide. Use a ponta da pipeta fina, suave toque na borda da lifterslip, e permitir que a solução para entrar no espaço entre o lifterslip e deslize através de sucção.
8. Coloque a câmara de hibridação tampa sobre a base, em seguida, selar a câmara com clipes de metal.
9. Coloque toda a câmara dentro do saco plástico que vem com a cassete da câmara de Corning.
10. Coloque a cassete da câmara (s) dentro de um recipiente com papel toalha molhada; cobrir o recipiente com filme plástico e coloque-o dentro de um 37 ° C úmido, cultura de células incubadora para ~ 24 horas. Estas precauções (3.6, 3.9, 3.10) garantir que a solução de hibridização não seca durante a incubação.

4. Pós-processamento de hibridização

1. Desmonte a câmara de cassetes, um por um. Slides submergir e na sua lifterslip em 2 x SSC a 22 ° C. O lifterslip caberá naturalmente fora do slide. Coloque-o em 0,8 x SSC. Lavaros slides em 0,8 x SSC duas, três vezes em 0,4 x SSC, 1-2 min no total. Secar as lâminas usando uma centrífuga com um adaptador de slide. Lave o lifterslips com água e guarde para reutilização posterior.
2. Digitalizar os slides com qualquer scanner apropriado, por exemplo, a Perkin Elmer 5000 ou ScanArray Molecular Devices Axon GenePix 4000B scanner microarray. Varredura em comprimentos de onda próximo a 547 nm e 647 nm para obter os arquivos de imagem correspondente.
3. Use programas como o BlueFuse para quantificar intensidade dos pixels na entrada, arquivos de imagem de 4.2). Inspecionar os pontos individuais com o programa para excluir manchas anormais na microarrays de análise mais aprofundada. Essas manchas anormais geralmente surgem a partir de impressão de slides pobres ou deslize após a manipulação de hibridização.
4. Utilizar programas como Excel e GeneSpring para análise de dados e apresentação. Considerações gerais para normalização de dados microarray aplicar, o que está além do escopo deste artigo.
5. Uma vez que os sinais satisfatórios são obtidos after 4.3), tira as lâminas de microarrays para reutilização ^7. Enxágüe as lâminas em água, em seguida, mergulhar na pré-aquecido, 1 mM NaOH e 0,1 x SSC em um prato de coloração a 62 ° C por 10-20 minutos. Repita a incubação uma vez. Lave o C. slides algumas vezes em água por até 60 minutos com agitação suave a 22 ° Secar as lâminas usando uma centrífuga, e armazenar a 22 ° C.
6. Para utilizar os slides regenerados, não é necessário pré-hibridizar-los novamente. Basta lavá-los em água seguido de isopropanol, seco e as lâminas direita antes de hibridização.

5. Resultados representativos:

Temos em grande parte seguido os procedimentos descritos para perfil de expressão de miRNA mundial em milhares de amostras, ou seja, RNAs isolados de zebrafish a espécime humana sob diversas condições. A Figura 1 mostra uma imagem digitalizada de um microarray de demonstrar sinais de hibridação muito precisa e forte na slide. O Relacionados Pearsonsobre os coeficientes técnicos entre réplicas de hibridização de microarrays são ~ 0.99 ^7, indicando excelente reprodutibilidade.

Figura 1 Imagem composta de uma lâmina de microarray miRNA digitalizados após hibridização. Manchas vermelhas resultou de hibridizações pelo DNA de referência, pontos verdes a partir da amostra de RNA DY547-rotulados, enquanto as manchas amarelas eram de hibridizações por ambos DNA e RNA para as mesmas sondas.

Apesar dos avanços recentes nas tecnologias de seqüenciamento de profundidade, microarray continua a ser uma opção viável para high-throughput análise de DNA e RNA. Comparado ao seqüenciamento de profundidade, as experiências microarray são mais baratos, e um laboratório de biologia molecular típico pode executar a maioria dos experimentos e análise de dados in-house, o que permite flexibilidade e economiza tempo. No futuro, é provável microarrays adequado para interrogar intensamente conjuntos de genes, por exemplo, todos ou um subconjunto dos fatores de transcrição em um genoma ou miRNAs, e os mesmos princípios e procedimentos aqui apresentados podem ser usados ​​em experimentos de microarray personalizado para estudo famílias de genes além miRNAs. É claro, uma grande desvantagem sobre microarrays é que a informação deve estar disponível seqüência a priori. Este não é um problema para a maioria das famílias de proteínas gene em organismos-modelo, embora o número de genes miRNA há permanecem obscuros. O conjunto de sonda que temos vindo a utilizar foi projetado com base em miRBase ⁸ 9, 10, é evidente que o miRNAs mais abundante e mais biologicamente relevantes mamíferos estão abrangidos por este conjunto de sonda.

Não há grandes desafios técnicos para realizar experimentos de microarray personalizado. Com base em nossa experiência, as chaves para o sucesso de um experimento de microarray são: 1) para obter bem-impresso slides, 2) para preparar RNA de boa qualidade e em quantidade suficiente, e 3) adequadamente lavar os slides após a hibridização. Reagente Trizol normalmente produz quantidades suficientes de RNA intacto para estudos posteriores. No entanto, a expressão de miRNA varia entre os diferentes tecidos e linhas celulares. Na maioria das condições, 20-25 mg de RNA total deve dar sinais de microarray suficientemente forte quando rotulados pelo método de ligadura. Menos RNA é necessário para amostras de miRNA-ricos, como regiões do cérebro e neurônios. Se apenas 1-5 mg de RNA total ou menos disponível, o método de rotulagem outross pode ser usado, por exemplo, kits de RNA a partir de rotulagem Invitrogen, e eles são compatíveis com a plataforma de microarray personalizados descritos aqui. Para obter os melhores comparações, deve-se sempre pelo menos um rótulo de replicar todo o controle e experimental amostras simultaneamente e hibridizar-los para o lote mesma impressão de slides em um único experimento. Este projeto de pesquisa irá minimizar a contribuição para sinais diferenciais microarray resultantes das variações na rotulagem de amostras e processamento e na qualidade de slides. O DNA de referência (em vermelho canal) serve como um controle para a qualidade de slide, hibridação e lavagem. A hibridação bem sucedida dará sinais limpos e fortes em vermelho. Se os sinais de DNA são bons, mas não são sinais de RNA, então deve-se problemas para disparar os passos de RNA isolamento e rotulagem. Por exemplo, o RNA tem a relação de A _260nm / A _280nm entre 1,9 e 2,1? Avermelhada é o pellet em 3,3?

Maior parte dos investimentosde microarrays pode ser para a impressão e digitalização de slides. Uma impressora e um scanner microarray são freqüentemente equipados pela instalação do núcleo em muitas universidades e escolas médicas. Microarrays de impressão em slides granel e reutilização e lifterslips irá reduzir significativamente o custo. Slides reutilização tem a vantagem adicional de melhorar a consistência das experiências microarray ^7. Temos reutilizado slides mais de seis vezes e encontrou a qualidade dos dados ainda satisfatório. Para garantir a melhor sensibilidade para as amostras mais precioso ou amostras com RNAs de entrada mínima, no entanto, ainda é prudente utilizar slides fresco ^7.