Het uitvoeren van op maat MicroRNA microarray experimenten

1. Afdrukken van aangepaste miRNA microarrays

1. Druk de microarray dia's met behulp van de microarray kern van facilitaire diensten aan een universiteit of een bedrijf. De kwaliteit van de microarray fabricage is een van de meest kritische factoren voor het succes van een microarray experiment. Probeer een paar diensten, indien mogelijk. Idealiter zou een afdruk 50-100 dia's in een tijd, en alle dia's eruit zal zien identiek, met goed gescheiden, individuele plekken.
2. Voor microarray-ondersteuning, gebruiken we de GAPS II gecoate dia's.
3. Voor miRNA probes, gebruiken we de nCode multi-species miRNA Microarray Probe V2 Set.
4. Los van alle oligonucleotiden in 3 x SSC bij 10 uM en quadruply printen ze uit op de dia's. Bevestig de dia's door de ultraviolette straling volgens de instructies voor de GAAPS II dia's. Label de dia met een diamant pen naar het gebied en aan de zijkant met de bedrukte sondes te markeren. Bewaren bij 22 ° C.

2. Monstervoorbereiding

1. Elke methodeof reagens kunnen worden gebruikt om RNA te isoleren, zolang het maar kleine RNA's bewaart. We gebruiken over het algemeen TRIzol (Invitrogen) aan de totale RNA-extract, met voldoende kwaliteit en kwantiteit van RNA preparaten, zoals gemeten door A _260nm en _280nm A lezingen.
2. Voor RNA-etikettering, mix ~ 25 pg totaal RNA met 0,5 ug van 5'-PCU-DY547-3 ^'6 in 1 x buffer (50 mM HEPES, pH 7,8, 20 mM _MgCl2, 10 ug / ml BSA, 10% DMSO) met ~ 20 eenheden T4 RNA-ligase 1, aangevuld met ~ 10 mM DTT en ~ 0,02-0,03 laatste deel van de 10 x T4 RNA-ligase een buffer voor ATP.
3. Laat etikettering om door te gaan op het ijs in een koelkast voor 2-24 uur. Neerslag RNA met 0,3 M natriumacetaat en drie volumes ethanol. Voor een efficiënte ligatie en neerslag, te ontbinden totaal RNA meer dan 2 mg / ml, en houd het totale ligatie volume op ~ 20 ul.
   1. Als er minder RNA beschikbaar is, het bedrag van de voorbelasting RNA en 5'-PCU-DY547-3 'kan worden verlaagd. </ Li>
   2. Als het RNA is zeer verdunde, voeg drager zoals gist tRNA om te helpen bij neerslag.
4. Combineer en label in totaal 1 ug van DNA-oligonucleotiden die overeenkomen met een subset van zoogdieren miRNAs het gebruik van de Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit ⁶ als een controle voor de hybridisatie proces. Zuiver het gelabelde DNA met behulp van een CentriSep kolom en op te slaan in het donker bij -20 ° C.

3. Microarray hybridisatie

1. Voor het gebruik van de dia's voor de eerste keer, de dia's pre-hybridiseren in een gefilterde oplossing van 3 x SSC, 0,1% SDS, 0,2% BSA gedurende 30-60 minuten bij 37 ° C. Dompel ze in het water een paar keer, dan in isopropanol. Droog de glaasjes met behulp van een centrifuge met een dia-adapter bij 100 g gedurende 5 minuten bij 22 ° C.

Opmerking: Wij gebruiken Corning microarray hybridisatie kamers en Erie Scientific mSeries van Lifterslips om microarray hybridisatie uit te voeren.

2. Spoel de lifterslips in het water, dan in ethanol, voor het drogen in de lucht. Plaats een dia in een microarray hybridisatie kamer basis, en een lifterslip op de top van de dia. De lifterslip zal betrekking hebben op de sonde gebied, met zijn witte strips contact opnemen met de slide.
3. In het donker, spin down van de neergeslagen, gelabeld RNA. Een keer wassen met 70% ethanol, en de lucht droog de pellet. De pellet moet worden roodachtig.
4. Bereid een hybridisatie-oplossing met 400 mM Na ₂ HPO ₄ pH 7,0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% formamide ⁶ met 1/15-1/100 ul van het gezuiverde, gelabeld DNA-(2,4) per RNA monster. De hoeveelheid toegevoegde verwijzing DNA hangt af van hoeveel verschillende oligonucleotiden zijn gelabeld (2.4). Als er meer dan 100, zijn er minder verdunning nodig is.
5. Lossen goed op de RNA-pellet met ~ 60 ul van de hybridisatie-oplossing.
6. Voeg 20 ul van het water aan elk van de bevochtigen putten in het Corning microarray hybridisatie kamer basis.
7. Voeg toe tHij mengsel van gelabelde RNA en DNA aan de dia. Gebruik een dunne pipet tip, zachtjes tegen de rand van de lifterslip, en laat de oplossing voor de ruimte tussen de lifterslip en schuif door de zuigkracht in te voeren.
8. Plaats het deksel van hybridisatie over de basis, dan sluit de kamer met metalen clips.
9. Zet de hele kamer in de plastic zak die bij de kamer cassette van Corning.
10. Plaats de kamer cassette (s) in een container met natte papieren handdoek; deksel van de container af met plasticfolie en plaats deze in een 37 ° C vochtig, celkweek incubator voor ~ 24 uur. Deze voorzorgsmaatregelen (3.6, 3.9, 3.10) ervoor zorgen dat de hybridisatie-oplossing niet uitdrogen tijdens de incubatie.

4. Post-hybridisatie verwerking

1. Demonteer de kamer cassettes een voor een. Dompel een glijbaan en de lifterslip in 2 x SSC bij 22 ° C. De lifterslip zal natuurlijk vallen de dia. Plaats deze in 0,8 x SSC. Wassende dia's in 0,8 x SSC twee keer, toen drie keer in 0,4 x SSC, 1-2 min in totaal. Droog de glaasjes met behulp van een centrifuge met een dia-adapter. Was de lifterslips met water en later op te slaan voor hergebruik.
2. Scan de dia's met een geschikte scanner, bijvoorbeeld, de Perkin Elmer ScanArray 5000 of Molecular Devices Axon GenePix 4000B microarray scanner. Scannen op golflengten dicht bij de 547 nm en 647 nm op de bijbehorende beeldbestanden te krijgen.
3. Gebruik programma's zoals BlueFuse om pixel intensiteiten kwantificeren in de input-, beeld-bestanden van 4.2). Inspecteer de individuele spots met het programma om abnormale vlekken op de micro-arrays van verdere beschouwing te sluiten. Deze abnormale vlekken ontstaan ​​gewoonlijk uit een slechte foto afdrukken of foto manipulatie na hybridisatie.
4. Gebruik programma's zoals GeneSpring en Excel voor data-analyse en presentatie. Algemene overwegingen voor microarray data normalisatie toe te passen, dat buiten het bestek van dit paper.
5. Zodra voldoende signalen worden verkregen after 4,3), strip de microarray dia's voor hergebruik ^7. Spoel de dia's in het water, daarna onder te dompelen in voorverwarmde, 1 mM NaOH en 0,1 x SSC in een kleuring schotel op 62 ° C gedurende 10-20 minuten. Herhaal de incubatie. Was de dia's een paar keer in het water tot 60 minuten zachtjes schudden bij 22 ° C. Droog de glaasjes met behulp van een centrifuge, en sla bij 22 ° C.
6. Voor het gebruik van de geregenereerde dia's, is het niet nodig om opnieuw pre-hybridiseren ze. Gewoon was ze in het water, gevolgd door isopropanol, en droog de dia's vlak voor hybridisatie.

5. Representatieve resultaten:

We hebben grotendeels de beschreven procedures die worden gevolgd aan de mondiale miRNA expressie profiel in duizenden monsters, dat wil zeggen, RNA geïsoleerd van zebravissen naar menselijk specimen onder diverse omstandigheden. Figuur 1 toont een gescand beeld van een microarray tot zeer nauwkeurig en sterke hybridisatie signalen te tonen op de glijbaan. De Pearson correlatiop de coëfficiënten tussen technische replica van microarray hybridisatie zijn ~ 0.99 ^7, wat aangeeft een uitstekende reproduceerbaarheid.

Figuur 1 Composite beeld van een gescande miRNA microarray dia na hybridisatie. Rode vlekken het gevolg van kruisingen door de referentie-DNA, groene vlekken van de DY547-gelabelde RNA-monster, terwijl de gele plekken waren van hybridisaties door zowel het DNA en RNA naar dezelfde sondes.

Ondanks de recente ontwikkelingen in de diepe sequencing technologie, micro-array nog steeds een levensvatbare keuze voor high-throughput analyse van DNA en RNA. In vergelijking met diepe sequencing, microarray experimenten zijn goedkoper, en een typische moleculaire biologie laboratorium kan de meeste van de experimenten en data-analyse in huis, die zorgt voor flexibiliteit en bespaart tijd. In de toekomst, microarrays zijn waarschijnlijk zeer geschikt om intensief te ondervragen sets van genen, bijvoorbeeld, kan alle of een deel van de transcriptie factoren in een genoom-of miRNAs, en dezelfde principes en procedures hier gepresenteerd worden gebruikt in aangepaste microarray experimenten om te studeren genfamilies naast miRNAs. Natuurlijk een groot nadeel over de micro-arrays is dat de sequentie-informatie beschikbaar moet zijn a priori. Dit is geen probleem voor de meeste eiwitten gen families in modelorganismen, maar hoeveel miRNA genen zijn er nog steeds onduidelijk. De sonde set we hebben gebruikt is ontworpen op basis van miRBase ⁸ 9, 10, is het duidelijk dat de meest voorkomende en meest biologisch relevante zoogdieren miRNAs reeds onder deze probe set.

Er zijn geen grote technische uitdagingen om aangepaste microarray experimenten uit te voeren. Op basis van onze ervaring, de sleutels tot het succes van een microarray experiment zijn: 1) goed gedrukt dia's, 2) te verkrijgen tot RNA van goede kwaliteit voor te bereiden en in voldoende hoeveelheid, en 3) goed het wassen van de objectglaasjes na hybridisatie. TRIzol reagens levert meestal voldoende hoeveelheden intact RNA voor latere studies. Toch miRNA expressie varieert tussen de verschillende weefsels en cellijnen. Onder de meeste omstandigheden dient 20 tot 25 pg totaal RNA geven voldoende sterk microarray signalen wanneer gelabeld door de ligatie methode. Minder RNA is vereist voor miRNA-rijke monsters zoals gebieden van de hersenen en de neuronen. Al was het maar 1-5 pg totaal RNA of minder beschikbaar is, andere etikettering methodes kan worden gebruikt, bijvoorbeeld, RNA etikettering kits van Invitrogen, en zij verenigbaar zijn met de aangepaste microarray platform hier beschreven. Voor de beste vergelijking, moet men altijd tegelijk label ten minste een kopie van alle controle-en experimentele monsters en hybridiseren ze naar dezelfde print partij van dia's in een enkel experiment. Dit onderzoek ontwerp zal het minimaliseren van de bijdrage aan de differentiële microarray signalen voortvloeien uit de variaties in de steekproef etikettering en de verwerking en schuif kwaliteit. De verwijzing DNA (in het rood kanaal) dient als een controle voor de kwaliteit van de glijbaan, hybridisatie en wassen. Een succesvolle hybridisatie geeft schoon en sterk signaal in het rood. Als DNA-signalen zijn goed, maar RNA signalen niet, dan moet men probleemloos schieten de stappen van RNA isolatie en etikettering. Bijvoorbeeld, heeft het RNA heeft de verhouding A _260nm / A _280nm tussen 1,9 en 2,1? Is de pellet roodachtig in 3.3?

Het grootste deel van de investeringvoor de micro-arrays kunnen worden voor dia afdrukken en scannen. Een microarray printer en een scanner worden vaak uitgerust met de core faciliteit op vele universiteiten en medische faculteiten. Afdrukken microarrays in bulk en hergebruiken van dia's en lifterslips zal aanzienlijk verminderen van de kosten. Hergebruik van dia's heeft het extra voordeel van het verbeteren van de consistentie van de microarray experimenten ^7. We hebben hergebruikt dia's meer dan zes keer en vond de kwaliteit van de gegevens nog steeds bevredigend. Om ervoor te zorgen de beste gevoeligheid voor de meest waardevolle monsters of monsters met minimale input RNA's, echter, is het nog steeds verstandig om met verse dia ^7.