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Ren, D., Daines, D. A. Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (55), e3261, doi:10.3791/3261 (2011).
1. EpiAirway ऊतकों के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट की तैयारी
एक समर्पित प्रयोगशाला कोट पहने हुए, पर वापस और दस्ताने बंधे बालों के साथ, लामिना का प्रवाह शुरू करते हैं. 5 मिनट के बाद, कैबिनेट (pipettors, टिप्स, अपकेंद्रित्र ट्यूबों, आदि) में किसी भी उपकरण को एक तरफ ले जाने के लिए, स्प्रे जैव सुरक्षा कैबिनेट और 70% इथेनॉल और स्वच्छ कागज तौलिये के साथ नीचे पोंछ के साथ इंटीरियर सैश. साफ इंटीरियर फिर से 70% इथेनॉल के साथ और स्प्रे के लिए सूखी छोड़. स्वच्छ पक्ष के लिए उपकरण ले जाएँ और इथेनॉल प्रक्रिया को दोहराने.
कैबिनेट में एयरोसोल बाधा विंदुक युक्तियाँ और समर्पित pipettors का प्रयोग करें. व्यक्तिगत लिपटे बाँझ सीरम वैज्ञानिक pipettes का उपयोग करने के लिए, लामिना का प्रवाह के माध्यम से खामियों को दूर अंत के पास, खुले तोड़ने, और कैबिनेट में पिपेट स्लाइड, पैकेजिंग बाहर discarding.
EpiAirway आवेषण बाँझ संदंश के साथ संभाला होना चाहिए. प्लेस 6 इंच ठीक टिप घुमावदार स्वयं सील नसबंदी पाउच और आटोक्लेव में संदंश विदारक. तैयार करने के लिए पर्याप्त है कम से कम छह प्रति दिन उपयोग के लिए तैयार है.
2. EpiAirway ऊतकों Unpacking
जैव सुरक्षा कैबिनेट में 70% इथेनॉल के साथ काम की सतह पर स्प्रे और स्वच्छ कागज तौलिये के साथ नीचे पोंछे. फिर से स्प्रे और सतह से पहले सूखे के लिए उपयोग करने के लिए अनुमति देते हैं. EpiAirway बॉक्स खोलें और स्टायरोफोम और पैकिंग सामग्री त्यागने.
एंटीबायोटिक मुक्त EpiAirway रखरखाव मीडिया, आकाशवाणी-100-MM ABF (एम एम), MatTek मालिकाना है और आवेषण के साथ किट में भेजा है. जैव सुरक्षा कैबिनेट, मीडिया प्रकार और तारीख के साथ लेबल छह बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों, और ढीला टोपी में. स्प्रे 70% इथेनॉल के साथ मीडिया की बोतल और कैबिनेट के अंदर खुला. एम एम के 25 मिलीलीटर की प्रत्येक प्रत्येक ट्यूब के लिए एक नया बाँझ सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर ट्यूब में विभाज्य, 4 डिग्री सेल्सियस पर टोपियां, और स्टोर कस एम एम के एक ताजा विभाज्य प्रत्येक दिन का उपयोग करें.
1 एक्स Dulbecco है की एक ताजा बोतल फॉस्फेट कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ buffered खारा (डी पीबीएस) का उपयोग करके उपरोक्त 2.2 दोहराएँ. फिर दोहराएँ डी कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना पीबीएस का उपयोग. 4 में सभी aliquots स्टोर ° सी.
आकाशवाणी-100 EpiAirway आवेषण 4 डिग्री सेल्सियस ठोस युक्त agarose मीडिया पर 24 अच्छी तरह से एक थाली में आने, और उपयोग के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेटों में रखा जाना चाहिए. तारीख और विवरण एक इथेनॉल प्रतिरोधी मार्कर का उपयोग के साथ लेबल प्रत्येक प्लेट. जगह एक कुएँ में 1 4 ° EpiAirway सी एम.एम. की मिली लीटर. इसकी पैकेजिंग, 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे, और जैव सुरक्षा कैबिनेट में जगह से परिवहन की थाली निकालें. टेप निकालें और प्लेट खुला. Autoclaved संदंश का प्रयोग, EpiAirway आवेषण पर नम धुंध हटा दें.
6 अच्छी तरह से एक थाली के एक कुएँ में autoclaved एक घुमा गति agarose से जारी करने में सहायता का उपयोग संदंश के साथ सम्मिलित करते हैं, और जगह उठाओ. कुछ agarose सम्मिलित करने के लिए पालन करना है, खासकर के रूप में परिवेश के परिवहन थाली के तापमान बढ़ सकता है. एक बाँझ कपास झाड़ू का प्रयोग करें ध्यान से डालने से agarose हटायें. झिल्ली को छूने से बचें, और जाँच लें कि कोई हवाई बुलबुले आवेषण नीचे फंस रहे हैं. Humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ थाली प्लेस .
सह संस्कृतियों को शुरू करने से पहले इनक्यूबेटर में संतुलित ऊतकों के लिए कम से कम 24 घंटे की अनुमति दें.
3. EpiAirway ऊतकों का रखरखाव
Autoclaved संदंश का प्रयोग, एक डालने उठाओ और धीरे से और ऊतकों पर कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ पूर्व गर्म डी पीबीएस के 200 microliters विंदुक और रॉक डालने. एक कोण पर डालने झुकाएँ और प्लास्टिक की अंगूठी है कि डालने के नीचे झिल्ली धारण के खिलाफ अपने बाँझ P1000 विंदुक टिप जगह है. ऊतक मत छुओ. Aspirate डी पीबीएस कुल्ला और एक लेबल बाँझ cryovial में जगह. नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है और एक बाद की तारीख में mucin और / या cytokine अभिव्यक्ति के लिए assayed.
बेसल aspirating और ताजा एम.एम. की 1 मिली लीटर के साथ जगह से दैनिक एम.एम. बदलें. प्रत्येक अच्छी तरह के लिए एक नई बाधा विंदुक टिप का उपयोग करें. 10% ब्लीच के साथ प्रयोग किया मीडिया रातोंरात समझो और त्यागें.
4. EpiAirway ऊतकों का टीका
जमी ग्लिसरॉल शेयर से nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) के एक ताजा संस्कृति के बाहर चॉकलेट अगर पर स्ट्रीक . Humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रातोंरात आगे बढ़ें.
अगले दिन, पूर्व गर्म डी पीबीएस में 0.7 लगभग के एक आयुध डिपो (600 एनएम) के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ NTHi के एकल कालोनियों resuspend. भंवर से सख्ती से पहले ऑप्टिकल घनत्व को मापने के लिए. ऑप्टिकल घनत्व के रिश्ते को कॉलोनी के गठन NTHi के प्रति मिलीलीटर (CFU / एमएल) इकाइयों है कि 0.2 के एक आयुध डिपो (600 एनएम) लगभग 1.0 x 10 8 CFU / एमएल के बराबर होती है. इसलिए, 0.7 के एक आयुध डिपो (600 एनएम) के बारे में 3.5 x 10 8 CFU / एमएल है. इस एल्गोरिथ्म प्रत्येक NTHi टीका करने के लिए पहले तनाव के लिए मान्य किया जाना चाहिए.
EpiAirway ऊतकों आकाशवाणी-100 आवेषण पर 0.6 2 सेमी और 0.4 माइक्रोन झिल्ली की एक सतह क्षेत्र के साथ बड़े हो रहे हैं . ऊतकों ~ x 10 5 1.0 ~ x 6 10 8.0 बना रहे हैं </> कोशिकाओं का समर्थन. 12 - इसलिए, 1.0 x 10 7 CFU का एक टीका के बारे में 10 के संक्रमण की बहुलता से मेल खाती है. टीका लगाना करने के लिए, में 3.1 के रूप में प्रत्येक EpiAirway डालने कुल्ला, तो बैक्टीरियल 4.2 में जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रत्येक EpiAirway डालने के शिखर सतह तैयार निलंबन का 28 microliters जोड़ें. बेसल एम.एम. टीका लगाना मत करो. इनक्यूबेटर प्रत्येक प्लेट लौटें.
5. NTHi inoculum की मात्रा का ठहराव
0.1% जिलेटिन (पीबीएस जी), आटोक्लेव बाँझ के साथ एक फॉस्फेट-buffered खारा समाधान (पीबीएस) तैयार करें. लेबल बाँझ वांछित 1:10 बाँझ पीबीएस जी के inoculum और विभाज्य 900 microliters के आयुध डिपो (600 एनएम) के आधार पर प्रत्येक ट्यूब में dilutions के साथ 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों.
चॉकलेट अगर inoculated NTHi एन्यूमरेट की आवश्यकता प्लेटों की संख्या का निर्धारण करते हैं. इन प्लेटों के शीर्ष आधे पर एक घंटे के लिए आराम की थाली के नीचे के साथ एक हवा इनक्यूबेटर में उल्टा प्लेस. यह करने के लिए थाली दोनों 37 के लिए गर्म डिग्री सेल्सियस और सतह सूखी, NTHi के ड्रॉप चढ़ाना की सुविधा. अनुमति देगा
4.2 से पहले ट्यूब जीवाणु निलंबन के 100 microliters जोड़कर inoculum के धारावाहिक 1:10 dilutions शुरू करो. प्रत्येक कमजोर पड़ने भंवर 5 सेकंड के लिए सख्ती से पहले अगले बनाने के लिए. पूर्व गर्म और सतह सूखे चॉकलेट अगर प्लेटों पर 10 microliter aliquots गिरा, प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए आधे प्लेट का उपयोग कर. पांच से छह से 10 microliter aliquots प्रत्येक 100 मिमी की थाली के एक आधे पर एक साथ चल रहे बिना फिट कर सकते हैं. जब सूखी है, उल्टा एक humidified 37 में जगह नीचे डिग्री सेल्सियस 2 सीओ इनक्यूबेटर रातोंरात .
अगले दिन, dilutions कि प्रत्येक बूंद में 15-30 अलग कालोनियों की गिनती और वापस NTHi के अपने वास्तविक रूप से व्यवहार्य inoculum की गणना के द्वारा निर्धारित CFU / एमएल.
6. NTHi लंबी अवधि के साथ सह संस्कृति
हर 24 घंटे, आवेषण धोने 3.1 के रूप में तो प्रत्येक ऊतक के धोने पूल -20 में बैक्टीरिया और फ्रीज की एक ही तनाव ° भविष्य के विश्लेषण के लिए एक लेबल cryovial में सी के साथ inoculated है. ये नमूने डॉट blots द्वारा mucin की उपस्थिति के लिए या एलिसा द्वारा साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति के लिए assayed किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, ऊतकों mRNA के लिए काटा जा सकता है और qPCR ब्याज की जीन पर प्रदर्शन किया जा सकता है है. बेसल 3.2 में के रूप में दैनिक एम.एम. बदलें. सह संस्कृति की अवधि के लिए जारी रखें.
7. EpiAirway ऊतकों की फसल काटने वाले
डी पीबीएस में कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना saponin की एक ताजा 1% समाधान तैयार करने के लिए, फिल्टर बाँझ और 37 सी. सेंटीग्रेड गर्म
कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना 37 डिग्री सेल्सियस एम.एम. और डी पीबीएस के दूसरे की एक 50 मिलीलीटर ट्यूब गर्म
5.1 में के रूप में कमजोर पड़ने ट्यूबों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तैयार, एक खाली बाँझ डालने के प्रति 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब डालने के नंबर और NTHi तनाव के साथ लेबल.
EpiAirways या तो कुल सेल जुड़े बैक्टीरिया के लिए काटा जा सकता है है, जो दोनों पक्षपाती और भली भाँति जीवों, या केवल भली भाँति बैक्टीरिया के लिए शामिल हैं.
चॉकलेट अगर प्लेटों की संख्या निर्धारित ड्रॉप - प्लेट सेल जुड़े या 5.2 के रूप में NTHi, लेबल और एक हवाई इनक्यूबेटर में एक घंटे के लिए सूखी आक्रमण जरूरत
कुल सेल जुड़े बैक्टीरिया फसल, कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना 200 डी पीबीएस microliters के साथ EpiAirways के शिखर सतह तीन बार कुल्ला, तो डालने के झुकाव और बेसल झिल्ली से किसी भी शेष एम.एम. कुल्ला. पहले धो बाद में विश्लेषण के लिए जमे हुए किया जा सकता है, निम्नलिखित washes त्यागें.
प्रत्येक ऊतक के शिखर सतह पर 7.1 से 6 अच्छी तरह एम.एम. के बिना एक ताजा थाली में धोया सम्मिलित करें, और बाँझ 1% सैपोनिन समाधान के विंदुक 250 microliters रखें. 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटर पर लौटें.
इनक्यूबेटर से निकालें, और एक बाँझ P1000 विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए, एक वापस आगे गति, डालने के किनारों से ऊतक निकालने के लिए एक परिपत्र गति से बाद उपयोग कर झिल्ली से ऊतकों साफ़. एक बड़े बोर बाँझ P1000 विंदुक टिप का उपयोग करना है, खाली लेबल 7.3 में तैयार ट्यूब में निलंबन जगह है. या डालने के शिखर सतह पर कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना डी पीबीएस के 250 microliters जोड़ें.
एक औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग निर्धारित करने के लिए अगर वहाँ किसी भी शेष ऊतक के लिए काटा जा डालने जांच करते हैं. यदि आवश्यक हो, दूसरे बाँझ P1000 विंदुक टिप के साथ फिर से हाथ धोने के लिए, तो ट्यूब को 7.8 से इस निलंबन एक बड़े बोर बाँझ P1000 विंदुक टिप का उपयोग कर जोड़ने. ट्यूब के कुल 1 कैल्शियम मैग्नीशियम या बिना डी पीबीएस का उपयोग मिली लीटर मात्रा को लाओ.
एक मिनट के लिए शीर्ष गति पर सख्ती भंवर सेल निलंबन. एक बाँझ 1 मिलीलीटर एक 26 गेज सुई के साथ फिट सिरिंज का प्रयोग, सिरिंज में सुई के माध्यम से निलंबन aspirate. धीरे धीरे सुई तीन बार के माध्यम से निलंबन से गुजारें, ध्यान लेने के बुलबुले को नहीं बना. एक मिनट के लिए तेजी से फिर भंवर.
पहली कमजोर पड़ने 7 में तैयार ट्यूब में एक बड़े बोर पिपेट टिप, निलंबन की जगह 100 microliters का उपयोग करना.3. भंवर सख्ती से पाँच सेकंड के लिए, तो धारावाहिक 1:10 dilutions. ड्रॉप - थाली सतह सूखे चॉकलेट अगर प्लेटों पर वांछित dilutions.
भली भाँति बैक्टीरिया केवल फसल के लिए, प्रत्येक डालने कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना 200 डी पीबीएस microliters के साथ 3 बार धो लो. पहले धो बनाए रखने और स्थिर. पूर्व गर्म 100 micrograms / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एम.एम. gentamicin सल्फेट जोड़ें. डालने के प्रति मीडिया को काटा जा 1.5 मिलीलीटर तैयार. Gentamicin युक्त एम.एम. साथ बेसल एम.एम. बदलें, और शिखर सतह पर gentamicin युक्त एम.एम. की 300 microliters जोड़ने. प्लेट एक घंटे के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में वापस प्लेस.
शिखर सतह से युक्त एम.एम. gentamicin निकालें और शिखर सतह और पूर्व गर्म डी कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना पीबीएस के साथ बड़े पैमाने पर डालने के बेसल झिल्ली धोने. 7.7-7.11 में के रूप में आगे बढ़ें.
8. प्रतिनिधि परिणाम:
(ए) असंक्रमित EpiAirway ऊतक और ऊतक (बी) के बाद एक 5 दिन NTHi के साथ सह संस्कृति इलेक्ट्रॉन micrographs स्कैन चित्र 1 में दिखाया NTHi लंबी अवधि के साथ सह संस्कृति के शिखर के लिए महत्वपूर्ण नुकसान में परिणाम नहीं करता है. ऊतकों, EpiAirway मॉडल की उपयोगिता को रेखांकित. भली भाँति ऊतकों के अंदर समय से अधिक मात्रा निर्धारित बैक्टीरिया की संख्या चित्रण ग्राफ चित्रा 2 में दिखाया गया है दोनों परिणाम काफी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं. EpiAirway ऊतकों बनाने एक सुसंगत और biologically मानव ऊपरी airway के इन विट्रो मॉडल में प्रासंगिक है, जो में अध्ययन करने के लिए मेजबान रोगज़नक़ NTHi बातचीत.
चित्रा 1 EpiAirway ऊतकों की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग. ए uninfected नियंत्रण ऊतक. NTHi सह संस्कृति के साथ पांच दिनों के बाद बी ऊतक. शिखर की सतह के लिए कोई महत्वपूर्ण नुकसान संक्रमित ऊतकों में मनाया जाता है.
चित्रा 2 NTHi की संख्या EpiAirway सह - संस्कृति के दौरान समय पर भली भाँति . तनाव R2866 1.0 लगभग x 10 7 CFU / (0 दिन) सम्मिलित करते हैं, तो प्रत्येक संकेत समय बिंदु पर भली भाँति बैक्टीरिया के लिए काटा inoculated किया गया था. बार्स पता प्रतिनिधित्व करते हैं = 3 कम से कम दो प्रतियों में replicates. त्रुटि सलाखों एसडी हैं.
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इस विधि हवा तरल इंटरफ़ेस में प्राथमिक मानव श्वसन ऊतकों की एक biologically प्रासंगिक पृष्ठभूमि में लंबे समय तक मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की जांच की अनुमति देता है. यहाँ हम संक्रमण जीव के रूप में NTHi का इस्तेमाल किया है, लेकिन किसी भी जीवाणु की बातचीत है कि समय पर अस्वीकार्य cytotoxicity परिचय नहीं करता है इस विधि के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है. EpiAirway मॉडल भी वायरस, दवाओं, या रसायनों कि मानव ऊपरी airway 5 प्रभाव के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 6, 7, 8. हम अधिक से अधिक 40 दिन, और ऊतकों को कम से कम 10 दिनों के लिए NTHi से संक्रमित के लिए असंक्रमित ऊतकों को बनाए रखा है. हमें उम्मीद है कि संक्रमित ऊतकों के लिए काफी लंबे समय तक बनाए रखा जा सकता है, अगर वांछित.
इन ऊतकों में सक्षम प्रतिरक्षा प्रणाली के पुनर्गठन में असमर्थता सहित इन विट्रो मॉडल में किसी भी है कि इस विधि की सीमाओं समान हैं. हालांकि ऊतकों की दैनिक washes के लिए सामान्य mucociliary निकासी की नकल, इन ऊतकों में उत्पादन mucin के लिए एक प्राकृतिक आउटलेट की स्थापना के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं और अधिक वांछनीय हो सकता है 9 होता है. इसके अलावा, NTHi मानव श्वसन उपकला कोशिकाओं में mucin अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है के साथ संपर्क , 10 समस्या exacerbating. दूसरी ओर, दैनिक EpiAirway washes और बचाया जा सकता है प्रोटीन या ब्याज की enzymatic गतिविधियों के लिए assayed, विधि के लिए एक महत्वपूर्ण आयाम जोड़ने और इसकी उपयोगिता बढ़ रही है.
इस विधि का सफल प्रदर्शन में एक महत्वपूर्ण कदम ऊतकों के यांत्रिक विघटन करने के लिए पहले ड्रॉप - चढ़ाना NTHi (7.10 कदम) है. क्योंकि EpiAirways अत्यधिक भेदभाव कर रहे हैं और कई प्रकार की कोशिकाओं से बना है, ऊतकों के रूप में एक सेल monolayer के रूप में बिखर आसान, सैपोनिन उपचार के बाद भी नहीं कर रहे हैं. इसके अलावा, NTHi कुख्यात यौगिकों कि ऊतकों के disaggregation में सहायता करने के लिए संवेदनशील हैं. इसलिए, हमने पाया है कि एक 26 गेज सुई के माध्यम से सेल निलंबन गुजर बहुत हमारे भली भाँति या सेल जुड़े बैक्टीरिया के संगत और repeatable मात्रा का ठहराव उत्पन्न करने की क्षमता में सुधार.
एक बार इस तकनीक में महारत हासिल है, यह भी उत्परिवर्ती जीवाणु उपभेदों के सापेक्ष क्षमता की जांच के रूप में उनके जंगली प्रकार माता पिता की तुलना में जीवित रहने के उपयोग किया जा सकता है, अन्वेषक विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव विशेषताएँ के लिए अनुमति देता है.
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हम उपयोगी विचार - विमर्श के लिए पैट्रिक हेडन (MatTek) का शुक्रिया अदा करना होगा, और रॉबर्ट स्मिथ और उनके EM कौशल के लिए जॉर्जिया स्वास्थ्य विज्ञान विश्वविद्यालय के Libby पेरी. इस अध्ययन NIDCD अनुदान DC010187 द्वारा पिताजी को वित्त पोषित किया गया था
Murphy, T.F. & Apicella, M.A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis.9, 1-15 (1987).
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