Отслеживание нейтрофилов внутрипросветный Crawling, трансэндотелиальной миграции и Хемотаксис в ткани Прижизненное микроскопии видео

1. Подготовка хемоаттрактант в агарозном геле

1. Внесите 10 мл 2 х PBS в 50-мл коническую трубку, и согреться трубке, поместив его в стакан с горячей водой.
2. Внесите 10 мл дистиллированной воды и добавляют 0,4 г порошка агарозы в другой 50-мл коническую трубку (с ее вершины слегка ослаблены) и нагревайте смесь до кипения только в микроволновой печи (в течение ~ 1 мин в 700-Вт микроволновая печь) .
3. Добавить нагревается 2 × PBS в агарозном решение трубки, вихревые смешанный раствор и держать его в теплой стакан горячей воды.
4. Микропипетки хемоаттрактант решения (например, 10 мкл 0,5 мкг CXC хемокинов MIP-2 или 12 мкл 1 мМ WKYMVm) в крышку 1,5 мл Eppendorf пробирку, содержащую 3 мкл тушью и хорошо перемешать стремлением использовании микропипетки (избегайте воздушный пузырь).
5. Отрежьте кончик конце 200-мкл кончика пипетки и микропипетки 110 мкл агарозном решение (42 ° С) в крышке и сразу хорошо перемешать с использованием другого кончика пипетки (избегайте воздушных пузырей).
6. Магазин хемоаттрактант содержащих гель при температуре +4 ° С.

2. Подготовка мышц Кремастер для Прижизненное микроскопии (рис. 1)

1. Обезболить взрослого самца мыши, IP-инъекция смеси 10 мг / кг ксилазина и 200 мг / кг кетамина гидрохлорид.
2. Бритье области за правой наружной яремной вены и передняя поверхность мошонки с электрической бритвой. После анестезии, очень важно уделять особое внимание и заботу к анестезии мыши. Тепло лампы может быть использован для предотвращения мышь от переохлаждения. Мышь должна быть свободна от боли рефлекс.
3. Сделать горизонтальный надрез, найти и катетеризации яремной вены использованием ПЭ-10 трубки заполнены 100 ЕД / мл гепарина физиологического раствора. Катетеризация яремной вены необходимо для управления дополнительными анестетиков и наркотиков, когда это требуется.
4. Fix мыши задние ноги с пупочной лента с мышью лежал лицом вверх на самодельных кремастер мышц плате (рис. 1).
5. Подключение платы к 37 ° С воды циркуляционный держать мышцы кремастер и мышь тело в тепле.

Примечание: Все процедуры от 2,6 до 2,14 должны выполняться очень нежно ^5.

6. Сделайте разрез на мошонке кожи подвергать мышцу левого кремастер. Осторожно рассекают мышцы от связанных фасции.
7. Переливать мышц кремастер с 37 ° C-нагревается гидрокарбонатно-солевой буфер (131,9 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO _4, 20 NaHCO _3, в мМ, рН 7,4) с помощью перистальтического насоса.
8. Tie 4-0 шва до дистального конца мышцы кремастер провести его на пьедестал ясно стекла просмотра борту мышцы кремастер.
9. Cauterize мышц кремастер продольно. С 4-0 шва, удерживайте мышцы плоскими и закрепите его по краям на пьедестале. Отдельные яичка и придатка из основных мышц и переместить их в брюшной полости.
10. Переливать мышц при ~ 0,6 мл / мин при 37 ° С разогреть перфузии буфера и крышки подвергаются мышцы с 22 × 22 покровного стекла мм.
11. Место борту кремастер мышцы на столике микроскопа, исследовать мышцы под микроскопом, найти подходящую посткапиллярных венулы (Выберите венулы, что прямая и неразветвленные и нормальной скоростью сдвига и диаметром 25-40 мкм) и настроить видеокамеру чтобы венулы, чтобы быть визуализированы в вертикальном положении на левой или правой части телевизора.
12. После 30 мин равновесия, записать видео-изображения выбранного посткапиллярных венулы в течение 5 мин в качестве базовых контроль данных с использованием видеомагнитофона.
13. Стоп superfusion и удалить покровное на мышцы.
14. Место ~ 1 мм, ³ размера хемоаттрактант-геля на поверхности мышц кремастер в заданный район 350 мкм от и параллельно наблюдается посткапиллярных венулы, добавьте покровное провести гель на месте и переливать мышечной ткани в очень медленно (≤ 10 мкл / мин), чтобы позволить создание градиента хемоаттрактант, который медленно освобождается и формируется из геля.
15. Запись видеоизображения в течение 90 мин после добавления хемоаттрактант содержащего геля. Во время записи, настроить и сохранить микроскопом сосредоточиться на соблюдении, ползание, переселяющимся и chemotaxing лейкоцитов в венулы и в мышечной ткани.
16. После эксперимента, импортировать видео файл на компьютер для анализа.

3. Сотовые Отслеживание Использование ImageJ

1. На компьютере, извлекать и конвертировать видео в AVI-формате (например, использование свободных bitRipper компьютерного программного обеспечения для преобразования DVD видео в файл AVI).
2. Используйте программное обеспечение для редактирования видео, для создания временных истек кино. Например, можно использовать Windows Movie Maker, чтобы времени истек фильм (до 1 / 512 или 1 / 1024 покадровойт 30-кадр ставка) от оригинала, в реальном времени видео. Преобразование и сохранение несжатых времени истек фильм DV-AVI формате.
3. Запись изображения калибровки микрометра под микроскопом же настройки, импорт изображений в компьютер, откройте изображение с ImageJ. В ImageJ, общее число пикселей на верхней левой части экрана (например, 720 × 480 пикселей). Измерьте размер экрана в обоих X и Y осей (например, 200 × 150 мкм). Исходя из этого, подсчитать количество пикселей в мкм (например, х = 720/200 = 3,6 пикселей / мкм, а у = 480/150 = 3,2 пикселей / мкм).
4. Чтобы импортировать кино, открытые ImageJ еще раз, нажмите "Файл-Импорт-Использование Quicktime фильмы Плагин", выбрать фильм, которые будут проанализированы и нажмите кнопку "OK" на стыке "QT фильм открывалка".
5. Нажмите кнопку "Плагины-Ручной отслеживания", чтобы отслеживать клеток. Заполните соответствующую информацию в поля, на дне до начала отслеживания. Короче говоря,
   1. Временной интервал (в секундах) = fold-time-lapse/30 (например, 1020 × покадровой будет 1020/30 = 34 сек / кадр интервала).
   2. х / у = калибровки мкм / пиксел измерения с использованием калибровки образ микрометра.
   3. г калибровка = 0 (как мышцы мыши кремастер является чрезвычайно тонкий слой ткани и клеточных ползать и миграции примерно 2D при ярком поле просвечивание).
   4. Поиск квадратных размеров для центрирования = 1.
   5. Dot размер / Line ширина / Размер шрифта: они могут быть скорректированы в случае необходимости.
6. Выберите стабильные и четкие точки, точки отсчета. Эта контрольная точка может быть любой четкие и небольшие структурные такой степени, что остается неизменным и стабильным на протяжении всего эксперимента. Нажмите кнопку "Добавить трек", чтобы отслеживать точки отсчета от первого до последнего кадра и нажмите кнопку "Конец пути". Данные появляются на таблицу результатов автоматически.
7. Трек ползать и миграции нейтрофилов один за другим: нажмите кнопку "Добавить трек", чтобы отслеживать клетки от ее появления в ткани к его исчезновению в каждом кадре и нажмите кнопку "Конец пути", чтобы закончить и сохранить результаты в Microsoft Excel.

4. Анализ нейтрофилов Параметры Набор

1. Откройте файл результатов в Microsoft Excel, а также анализировать данные (принять изменения точкой отсчета в анализе).
2. Внутрипросветный сканирование
   1. Сканирование расстояние: общее расстояние клетка ползет в просвете от начальной приверженцем сайт оптимального места переселения (мкм).
   2. Сканирование Скорость: ползком расстояние / время (мкм / мин).
3. Трансэндотелиальной миграции
   1. Переселение время: с того времени, клетка начинает переселяться через эндотелий в то время, когда все тело ячейка находится совсем рядом с венулы и не тело клетки можно увидеть на просвет (мин или сек).
   2. Отряд время: с того времени, все тело ячейка находится совсем рядом с венулы (сразу после переселения) в момент времени, когда клетка теряет контакт с венулы (хвост втягивается) (мин или сек).
4. Хемотаксис в ткани
   1. Миграция расстояние: сумма расстояния клетка переходит от начальной точки до конечной точки миграции в ткани (мкм).
   2. Скорость миграции: миграция в тканях расстояние / время (мкм / мин).
   3. Хемотаксис расстояние: сумма расстояния клетка мигрирует в оси Х в ткани (мкм).
   4. Скорость хемотаксис: хемотаксис расстояние / время (мкм / мин).
   5. Хемотаксис индекс: отношение деления хемотаксис расстояния миграции расстояние в ткани.

5. Представитель Результаты:

Хотя bightfield прижизненной микроскопии для исследования лейкоцитов эндотелия взаимодействия клеток и, возможно, не обязательно для нейтрофилов, мы подтвердили, что, по нашим исследования гистологии, более 95% от набранных клетки нейтрофилов хемоаттрактант обработанных мышцы кремастер действительно нейтрофилов . В этом докладе, используя нейтрофилов-селективные хемоаттрактантов, мы представляем процедуры отслеживания набора нейтрофилов в естественных условиях. В частности, мы описываем протокол отслеживания нейтрофилов внутрипросветный ползать, трансэндотелиальной миграцию и хемотаксис в кремастер мышечной ткани у мышей под наркозом использованием покадровой прижизненной микроскопии видео и ImageJ. Хемоаттрактант содержащих агарозном гель на мышцы кремастер медленно выпускает хемоаттрактант и позволяет хемоаттрактант градиент, который будет создан в тканях. Нейтрофилов хемоаттрактант побуждает нейтрофилы, эндотелиальные взаимодействия ячейку в cremasteric посткапиллярных венул у мышей. Весь эксперимент визуализируется при вертикальном светлое прижизненной микроскоп с видео-изображения, проецируемые на цветная камера видео на экран телевизора и записаны видеомагнитофон. Мы определили нейтрофиловвнутрипросветный ползать, трансэндотелиальной миграция и миграция и хемотаксис в мышечной ткани в ответ на нейтрофилов хемоаттрактант MIP-2 и WKYMVm подготовлен в агарозном геле (рис. 2). Мы обнаружили, что MIP-2 (на 0,5 мкМ) и WKYMVm (на 0,1 мм) вызвал нейтрофилов внутрипросветный ползком на аналогичных скоростей, нейтрофилов трансэндотелиальной миграции и отрыва от венулы за сопоставимый период времени, миграцию нейтрофилов и хемотаксис в мышечной ткани почти той же скоростью и с аналогичными хемотаксис нейтрофилов индексы (Р> 0,05, студент т теста).

Рисунок 1. Схематическое изображение прижизненной системы микроскопа. Мышцы мыши кремастер является экстериоризируется на пьедестал ясно просмотра кремастер мышц доску на столик микроскопа и superfused с 37 ° C-нагревается гидрокарбонатно-солевой буфер. Прямой микроскоп связано с видео CCD цветная камера для микроскопии светлого прижизненной. Монохромный глубокого охлаждения CCD цифровой камеры также связан с микроскопом порт для флуоресцентной прижизненной микроскопии, изображения с которых непосредственно обработан на компьютере.

Рисунок 2. Нейтрофилов набора параметров светлое прижизненной микроскопии. Нейтрофилов набора было вызвано постепенное высвобождение нейтрофилов хемоаттрактант MIP-2 или WKYMVm в подготовке агарозном геле размещены 350 мкм, прилегающих к посткапиллярных венулы. Времени истек видео данных были проанализированы ImageJ после обработки записи в реальном времени видео эксперимента. Нейтрофилов внутрипросветный ползком (), время переселения и отряд времени (В), скорость миграции и хемотаксиса скорость в ткань (C), и хемотаксис индекс в кремастер мышцы (D) были определены после введения MIP-2 или WKYMVm агарозном гель на кремастер мышцы в C57BL / 6 мышей (п = 3, # гусеничных клетки = 22 (в А и В) и 27 (на С и D), соответственно, для MIP-2, а = 26 (в А и В) и 44 ( в С и D), соответственно, для WKYMVm).

Прижизненные микроскопия является существенным инструментом для выявления клеточных и молекулярных механизмов лейкоцитов вербовки во время воспаления. Количественные визуализации для определения лейкоцитов эндотелиальных клеток взаимодействий в микроциркуляторном русле полупрозрачная тканей, таких как кремастер мышц и брыжейки остается золотым стандартом для применения техники ^1,5. Обычные микроскопии прижизненной светлое имеет много уникальных технических характеристик и набор механизмов проявляется в этих тканях, применимы для большинства тканей в естественных условиях ^1,2,6. Тем не менее, механизмы лейкоцитов набора в некоторых других тканей, таких как легкие, печень и мозг были обнаружены сильно отличаются от тех, раскрывается в кремастер мышц и брыжейки ^1. Кроме того, флуоресцентной микроскопии должна быть использована в некоторых менее прозрачной ткани.

По сравнению с флуоресценцией-микроскопии, который известен фотоповреждения к функциям живые клетки, светлое прижизненной микроскопии более физиологические и менее вредные для клеток и тканей (поэтому с меньшим количеством артефактов), когда долгое время визуализации для наблюдения динамического поведения в сотовых живых животных необходимо ^7. Кроме того, более удобным, менее дорогостоящими и не флуоресцентные маркировки не требуется. С другой стороны, с просвечивание изображений в прижизненной микроскопии, автоматическое слежение сотовых движение невозможно в настоящее время коммерческое программное обеспечение визуализации на рынке. Тем не менее, она очень проста в настройке отдельных флуоресценции прижизненной визуализации системы (например, путем проецирования изображения флуоресценции ПЗС-камеры и компьютера) на том же светлое прижизненной микроскопии (рис. 1). Это обеспечивает удобство переключения между микроскопии светлого и флуоресценции на той же подготовки образца в одном эксперименте. Это также позволяет автоматически отслеживать движение флуоресцентно меченых клеток под флуоресценции прижизненной микроскопии, когда контраст между интенсивности флуоресценции меченых клеток и фона достаточно велика, и подходит изображений программное обеспечение устанавливается на компьютер.

Как показано здесь, в нашей презентации, мы демонстрируем ценность этого в естественных техника для прямого наблюдения весь процесс нейтрофилов найма и для определения функции клеток и молекул в каждом наборе шаг. С хемоаттрактант, содержащиеся в подготовке агарозном геле и провел на ткани, однонаправленный градиент хемотаксиса могут быть установлены в ткани, что вызывает лейкоцитов ответы набора напоминающие естественные во время местное воспаление ^8,9. Направленное движение от лейкоцитов посткапиллярных венулы к источнику хемоаттрактант можно четко визуализируются с помощью светлого прижизненной микроскопии и видео съемки. При покадровой обработки видео, движения клетки могут быть отслежены по ImageJ и ряд весьма воспроизводимые параметры могут быть измерены. Что касается конкретно трансгенных мышей, ингибиторы и селективные хемоаттрактантов, анализа система помогает нам выявить функции специфических белков в лейкоцитарной вербовки. Например, этот метод помогает нам определить роль LSP1 в эндотелиальных клетках, как привратник в регулировании миграции нейтрофилов трансэндотелиальной ^10, роль для Mac-1 (αMβ2 интегрин) в нейтрофилов внутрипросветный ползать, существенным шагом для оптимального трансэндотелиальной миграции ^3, а также роль PI3Kγ в нейтрофилов хемотаксис в ткани ^11.