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 JoVE Immunology and Infection

ट्रैकिंग न्युट्रोफिल Intraluminal क्रॉलिंग, Transendothelial प्रवासन और intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा chemotaxis ऊतक में

, ,

Department of Pharmacology, University of Saskatchewan

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Cite this Article: ट्रैकिंग न्युट्रोफिल Intraluminal क्रॉलिंग, Transendothelial प्रवासन और intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा chemotaxis ऊतक में

Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296, doi:10.3791/3296 (2011).

Abstract: ट्रैकिंग न्युट्रोफिल Intraluminal क्रॉलिंग, Transendothelial प्रवासन और intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा chemotaxis ऊतक में

रक्त प्रवाह से सूजन ऊतक leukocytes परिसंचारी की भर्ती सूजन 1,2 की एक महत्वपूर्ण और जटिल प्रक्रिया है. सूजन ऊतक के postcapillary venules में शुरू venular दीवार के luminal सतह पर पगहा और रोल leukocytes. Endothelium पर रोलिंग leukocytes गिरफ्तारी और केमोकाइन या venular सतह पर अन्य chemoattractants के जवाब में फर्म आसंजन गुजरना. कई अनुयायी leukocytes endothelium में junctional परिस्त्राव साइट के लिए आसंजन के प्रारंभिक स्थल से स्थानांतरित करने के लिए, एक प्रक्रिया intraluminal 3 रेंगने करार दिया. रेंगने के बाद, leukocytes endothelium (स्थानांतरगमन) के पार चाल और chemoattractant के स्रोत (chemotaxis) 4 की ओर extravascular ऊतकों में विस्थापित. Intravital माइक्रोस्कोपी vivo में ल्युकोसैट endothelial सेल बातचीत visualizing और ल्युकोसैट 2,5 भर्ती के सेलुलर और आणविक तंत्र का खुलासा करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. इस रिपोर्ट में, हम brightfield intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए कल्पना और न्युट्रोफिल chemoattractant की ढाल के जवाब में माउस cremaster मांसपेशियों में न्युट्रोफिल भर्ती की विस्तृत प्रक्रियाओं का निर्धारण करने के लिए एक व्यापक वर्णन प्रदान करते हैं. न्युट्रोफिल भर्ती agarose जेल की एक छोटा सा टुकड़ा (~ 1 मिमी आकार 3) न्युट्रोफिल chemoattractant (CXCL2, एक CXC केमोकाइन) एमआईपी-2 या WKYMVm (टीआरपी - Lys - Tyr वैल डी - मेट, एक कृत्रिम अनुरूप युक्त प्रेरित बैक्टीरियल पेप्टाइड) मांसपेशी मनाया postcapillary venule के लिए आसन्न ऊतकों पर रखा गया है. समय व्यपगत वीडियो फोटोग्राफी और कंप्यूटर सॉफ्टवेयर ImageJ, न्युट्रोफिल endothelium, न्युट्रोफिल transendothelial प्रवास और प्रवास और ऊतकों में chemotaxis पर intraluminal रेंगने कल्पना और ट्रैक किए गए हैं. इस प्रोटोकॉल intraluminal रेंगने वेग, स्थानांतरगमन समय, टुकड़ी समय, प्रवास वेग, chemotaxis वेग और ऊतकों में chemotaxis सूचकांक जैसे कई न्युट्रोफिल भर्ती मापदंडों के विश्वसनीय और मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है. हमें दिखाना है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, इन न्युट्रोफिल भर्ती मापदंडों stably हो सकता है और निर्धारित कर सकते हैं एकल कक्ष हरकत सुविधा vivo में पता लगाया.

Protocol: ट्रैकिंग न्युट्रोफिल Intraluminal क्रॉलिंग, Transendothelial प्रवासन और intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा chemotaxis ऊतक में

1. Chemoattractant के agarose जेल में तैयार

  1. पिपेट एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 2 × पीबीएस के 10 एमएल, और यह एक गर्म पानी से युक्त बीकर में डाल कर गर्म ट्यूब.
  2. आसुत पानी के 10 एमएल और एक और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 0.4 छ agarose पाउडर जोड़ने के लिए अपनी टोपी के साथ थोड़ा ढीला () और मिश्रण को गर्मी पिपेट तक सिर्फ एक माइक्रोवेव ओवन में उबलते (~ 700 वाट एक माइक्रोवेव ओवन में 1 मिनट के लिए) .
  3. Agarose समाधान ट्यूब, ज़ुल्फ़ मिश्रित समाधान के लिए गरम 2 × पीबीएस जोड़ें और गर्म पानी बीकर में इसे गर्म रखने के.
  4. Micropipette एक 1.5 एमएल Eppendorf 3 μl भारत स्याही युक्त ट्यूब के ढक्कन में chemoattractant (उदाहरण के लिए, CXC केमोकाइन एमआईपी 2 1 मिमी WKYMVm के या 12 μl 0.5 μg की 10 μl) समाधान और एक micropipette का उपयोग आकांक्षा से मिश्रण अच्छी तरह से (से बचने हवा बुलबुला).
  5. Pipet 200 μl और ढक्कन में micropipette agarose समाधान (42 डिग्री सेल्सियस) के 110 μl टिप टिप अंत काटें और तुरंत मिश्रण अच्छी तरह से दूसरे विंदुक टिप (हवाई बुलबुले से बचने के लिए) का उपयोग.
  6. 4 में स्टोर chemoattractant युक्त जेल डिग्री सेल्सियस

2. Cremaster बलवान intravital माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार (चित्रा 1)

  1. 10 xylazine मिलीग्राम / किग्रा और 200 मिलीग्राम / किग्रा ketamine हाइड्रोक्लोराइड का एक मिश्रण के एक आईपी इंजेक्शन द्वारा एक वयस्क पुरुष माउस anesthetize.
  2. सही बाहरी गले नस और एक बिजली के रेजर के साथ अंडकोश की थैली के पूर्वकाल पहलू पर क्षेत्र दाढ़ी. संज्ञाहरण के बाद, यह महत्वपूर्ण है anesthetized माउस को विशेष ध्यान और देखभाल दे. एक गर्मी दीपक हाइपोथर्मिया से माउस को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. माउस दर्द प्रतिवर्त से मुक्त होना चाहिए.
  3. एक क्षैतिज चीरा पाते हैं और कंठ का शिरा का उपयोग पीई 10 100 U / एमएल हेपरिन खारा से भरा टयूबिंग कैथीटेराइज़. गले का शिरा की कैथीटेराइजेशन अतिरिक्त anesthetics और दवाओं के प्रशासन के लिए आवश्यक है जब आवश्यक है.
  4. नाल की टेप के साथ माउस माउस चेहरा एक घर बनाया cremaster मांसपेशियों बोर्ड (चित्रा 1) पर झूठ बोल के साथ पिछले पैरों को ठीक करें.
  5. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी cremaster मांसपेशियों और माउस शरीर को गर्म रखने के फैलानेवाला बोर्ड कनेक्ट.

नोट: 2.6 से 2.14 के लिए सभी प्रक्रियाओं बहुत 5 धीरे निष्पादित किया जाना चाहिए.

  1. अंडकोषीय त्वचा में एक चीरा के लिए छोड़ दिया cremaster मांसपेशियों का पर्दाफाश करें. जुड़े प्रावरणी से ध्यान मांसपेशी टुकड़े करना.
  2. 37 के साथ cremaster मांसपेशियों Superfuse ° सी - गरम खारा बिकारबोनिट बफर (131.9 NaCl, KCl 4.7, 1.2 4 MgSO, 20 NaHCO 3, मिमी में, 7.4 पीएच) एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर.
  3. Cremaster मांसपेशियों बोर्ड के स्पष्ट देखने गिलास आसन पर इसे नीचे पकड़ cremaster की मांसपेशी के बाहर का अंत करने के लिए एक 4-0 सीवन बाँधो.
  4. Cremaster मांसपेशियों दाग़ना longitudinally. 4-0 सीवन के साथ, मांसपेशियों फ्लैट पकड़ और यह आसन पर किनारों के साथ सुरक्षित. अलग अंतर्निहित मांसपेशियों से अधिवृषण अंडकोष और उन्हें उदर गुहा में कदम.
  5. ~ 0.6 / 37 ° छिड़काव सी गर्म बफर के साथ मिलीलीटर मिनट और 22 के साथ उजागर मांसपेशियों को कवर × 22 मिमी कांच coverslip में पेशी Superfuse.
  6. खुर्दबीन मंच पर cremaster मांसपेशियों बोर्ड प्लेस, खुर्दबीन के नीचे मांसपेशियों की जांच करने के लिए, एक उपयुक्त postcapillary venule (venule है कि सीधे और unbranched और सामान्य कतरनी दर और 25-40 सुक्ष्ममापी में एक व्यास है का चयन करें) को खोजने के लिए और वीडियो कैमरा समायोजित venule या तो टीवी पर नजर रखने के बाएँ या दाएँ छोर पर एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में visualized किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं.
  7. है 30 मिनट के संतुलन के बाद, आधारभूत नियंत्रण एक वीडियो रिकॉर्डर का उपयोग कर डेटा के रूप में 5 मिनट के लिए चयनित postcapillary venule के वीडियो छवियों को रिकार्ड.
  8. Superfusion बंद करो और मांसपेशियों पर coverslip हटायें.
  9. 350 सुक्ष्ममापी से एक preselected क्षेत्र में cremaster मांसपेशियों की सतह पर एक ~ 3 1 मिमी आकार chemoattractant युक्त जेल प्लेस और समानांतर मनाया postcapillary venule coverslip जोड़ने के लिए जगह में जेल पकड़ और एक बहुत मांसपेशियों के ऊतकों superfuse धीमी दर (≤ 10 μl / मिनट) chemoattractant के एक ढाल है कि धीरे धीरे जारी है और जेल से गठित की स्थापना की अनुमति.
  10. Chemoattractant युक्त जेल के अलावा के बाद 90 मिनट के लिए वीडियो छवि रिकॉर्ड. रिकॉर्डिंग के दौरान समायोजित करने के लिए, और पालन पर खुर्दबीन ध्यान रखना, रेंगने, transmigrating और venule अंदर और मांसपेशियों के ऊतकों में leukocytes chemotaxing.
  11. प्रयोग के बाद, विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर के लिए वीडियो फ़ाइल आयात करते हैं.

3. सेल ट्रैकिंग का प्रयोग ImageJ

  1. एक कंप्यूटर पर, निकालने, और AVI प्रारूप (उदाहरण के लिए, मुफ्त कंप्यूटर सॉफ्टवेयर bitRipper के उपयोग करने के लिए AVI फ़ाइल डीवीडी वीडियो परिवर्तित) वीडियो परिवर्तित.
  2. वीडियो संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए समय - व्यपगत फिल्म उत्पन्न. उदाहरण के लिए, Windows मूवी निर्माता का उपयोग करने के लिए समय व्यपगत फिल्म (1 / 512 या 1 / १०२४ समय चूकटी मूल, वास्तविक समय वीडियो से 30 एफपीएस) दर. कन्वर्ट और DV-AVI प्रारूप करने के लिए असम्पीडित समय व्यपगत फिल्म बचाने.
  3. समान खुर्दबीन सेटिंग के तहत अंशांकन सुक्ष्ममापी की छवियों को रिकार्ड करने के लिए, कंप्यूटर के लिए छवियों को आयात करने के लिए, ImageJ के साथ छवियों को खोलने. ImageJ में, कुल पिक्सेल स्क्रीन (उदाहरण के लिए, 720 × 480 पिक्सल) के बाईं शीर्ष पर दिखाई देते हैं. दोनों एक्स और वाई axes (उदाहरण के लिए, 200 × 150 सुक्ष्ममापी) में स्क्रीन के आकार के उपाय. इस से, सुक्ष्ममापी प्रति पिक्सल (उदाहरण के लिए, x = 720 / 200 = 3.6 पिक्सल / सुक्ष्ममापी, और y 480/150 = सुक्ष्ममापी = 3.2 पिक्सल /) की संख्या की गणना.
  4. फिल्म आयात करने के लिए, खुला ImageJ फिर से, पर क्लिक करें "ठीक है" "फ़ाइल आयात प्लग - इन का उपयोग क्विकटाइम सिनेमा, फिल्म विश्लेषण किया जा चयन करें और क्लिक करें" क्यूटी मूवी सलामी बल्लेबाज "के इंटरफ़ेस में.
  5. कोशिकाओं ट्रैक "प्लगइन्स मैनुअल ट्रैकिंग" पर क्लिक करें. शुरू ट्रैकिंग पहले तल पर क्षेत्र में प्रासंगिक जानकारी में भरें. संक्षेप में,
    1. समय अंतराल (सेकंड में) = fold-time-lapse/30 (उदाहरण के लिए, एक 1020 × समय चूक 1020-1030 = 34 / सेक फ्रेम अंतराल होगा).
    2. x / y अंशांकन = सुक्ष्ममापी / पिक्सेल सुक्ष्ममापी की छवि के अंशांकन का उपयोग माप.
    3. अंशांकन z = 0 (के रूप में माउस cremaster मांसपेशियों के ऊतकों और सेल रेंगने और प्रवास की एक अत्यंत पतली परत के उज्ज्वल क्षेत्र transillumination के तहत लगभग 2 डी).
    4. = 1 केंद्रित करने के लिए वर्ग आकार खोजें.
    5. डॉट आकार / लाइन / चौड़ाई फ़ॉन्ट आकार: वे समायोजित किया जा सकता है अगर जरूरत है.
  6. एक संदर्भ बिंदु के रूप में एक स्थिर और स्पष्ट बिंदु का चयन करें. इस संदर्भ बिंदु किसी भी स्पष्ट और छोटे संरचनात्मक का कहना है कि अपरिवर्तित है और पूरे प्रयोग के दौरान स्थिर रहता है हो सकता है. पर क्लिक करें "ट्रैक जोड़ें" पिछले फ्रेम करने के लिए पहले से संदर्भ बिंदु ट्रैक और "अंत ट्रैक" पर क्लिक करें. डेटा के परिणाम की मेज पर स्वचालित रूप से दिखाई देते हैं.
  7. रेंगने और पलायन neutrophils ट्रैक: एक एक करके क्लिक करें "ट्रैक जोड़ें" प्रत्येक फ्रेम में लापता होने के ऊतकों में अपनी उपस्थिति से सेल ट्रैक और "अंत ट्रैक" को समाप्त करने के लिए और Microsoft Excel में परिणाम को बचाने पर क्लिक करें.

4. न्युट्रोफिल भर्ती पैरामीटर्स के विश्लेषण

  1. Microsoft Excel में परिणाम फ़ाइल खोलें, और डेटा का विश्लेषण (संदर्भ बिंदु के विश्लेषण में परिवर्तन ले).
  2. Intraluminal रेंगने
    1. दूरी क्रॉलिंग: कुल दूरी सेल प्रारंभिक अनुयायी साइट से लुमेन में इष्टतम स्थानांतरगमन साइट (सुक्ष्ममापी) को क्रॉल करता है है.
    2. वेग क्रॉलिंग: रेंगने दूरी / समय (सुक्ष्ममापी / मिनट).
  3. Transendothelial प्रवास
    1. स्थानांतरगमन समय: समय सेल endothelium भर में जब पूरे सेल शरीर venule के बस के बाहर है और कोई सेल शरीर लुमेन (मिनट या सेक) में देखा जा सकता है है समय के लिए बसना शुरू से.
    2. टुकड़ी समय: समय से पूरे सेल शरीर venule बस के बाहर है (स्थानांतरगमन तुरंत बाद) समय बिंदु जब सेल (पूंछ retracts) venule (मिनट या सेक) के साथ संपर्क खो देता है.
  4. ऊतक में chemotaxis
    1. प्रवासन दूरी दूरी प्रवास के ऊतकों में अंत बिंदु (सुक्ष्ममापी) के लिए प्रारंभ बिंदु से सेल चाल का योग है.
    2. प्रवास के वेग: ऊतक / समय में प्रवास दूरी सुक्ष्ममापी (/ मिनट).
    3. Chemotaxis दूरी दूरी सेल का योग ऊतकों में x अक्ष (सुक्ष्ममापी) में उत्प्रवासित.
    4. Chemotaxis के वेग: chemotaxis दूरी / समय (सुक्ष्ममापी / मिनट).
    5. Chemotaxis सूचकांक: ऊतक में प्रवास दूरी के अनुसार chemotaxis दूरी विभाजन के अनुपात.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

हालांकि bightfield intravital माइक्रोस्कोपी ल्युकोसैट endothelial सेल बातचीत के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है और neutrophils के लिए जरूरी नहीं किया जा सकता है, हम पुष्टि की है कि, हमारे ऊतक विज्ञान के अध्ययन के द्वारा, न्युट्रोफिल chemoattractant इलाज cremaster मांसपेशियों में भर्ती कोशिकाओं के अधिक से अधिक 95% वास्तव में थे neutrophils . इस रिपोर्ट में, न्युट्रोफिल चयनात्मक chemoattractants का उपयोग, हम vivo में neutrophils की भर्ती पर नज़र रखने की प्रक्रिया मौजूद है. विशेष रूप से, हम ट्रैकिंग न्युट्रोफिल intraluminal रेंगने, transendothelial प्रवास, और cremaster intravital समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी और ImageJ का उपयोग anesthetized चूहों में मांसपेशियों के ऊतकों में chemotaxis के एक प्रोटोकॉल का वर्णन. chemoattractant युक्त cremaster मांसपेशियों पर agarose जेल धीरे chemoattractant विज्ञप्ति और एक chemoattractant ढाल ऊतक में स्थापित करने के लिए अनुमति देता है. न्युट्रोफिल chemoattractant चूहों में cremasteric postcapillary venules में न्युट्रोफिल endothelial सेल बातचीत लाती है. पूरे प्रयोग वीडियो छवियों के साथ एक टीवी पर नजर रखने के लिए एक रंग वीडियो कैमरा के द्वारा पेश किया और एक वीडियो रिकॉर्डर द्वारा दर्ज एक ईमानदार brightfield intravital खुर्दबीन के नीचे कल्पना है. हम न्युट्रोफिल निर्धारितintraluminal रेंगने, transendothelial प्रवास और प्रवास और मांसपेशियों के ऊतकों में प्रतिक्रिया में chemotaxis chemoattractant एमआईपी-2 न्युट्रोफिल के लिए और WKYMVm agarose जेल में तैयार (चित्रा 2). हमने पाया है कि एमआईपी (0.5 सुक्ष्ममापी पर) 2 और WKYMVm (0.1 मिमी पर) समान वेग, न्युट्रोफिल transendothelial प्रवास के समय की तुलना में लंबाई, न्युट्रोफिल प्रवास और मांसपेशियों के ऊतकों में chemotaxis के लिए venule से और सेना की टुकड़ी पर लगभग न्युट्रोफिल intraluminal रेंगने हासिल इसी तरह न्युट्रोफिल chemotaxis अनुक्रमित (पी> 0.05, छात्र टी परीक्षण) के साथ एक ही वेग और.

चित्रा 1
एक intravital खुर्दबीन प्रणाली के चित्रा 1. योजनाबद्ध चित्रण. माउस cremaster मांसपेशियों cremaster मांसपेशी बोर्ड की खुर्दबीन मंच पर स्पष्ट देखने के आसन पर exteriorized है और 37 डिग्री सेल्सियस गर्म खारा बिकारबोनिट बफर के साथ superfused. ईमानदार माइक्रोस्कोप brightfield intravital माइक्रोस्कोपी के लिए एक सीसीडी रंग वीडियो कैमरा के साथ जुड़ा हुआ है. एक मोनोक्रोम गहरे ठंडा सीसीडी डिजिटल कैमरा भी प्रतिदीप्ति intravital माइक्रोस्कोपी के लिए माइक्रोस्कोप बंदरगाह से जुड़ा है, छवियों से जो सीधे एक कंप्यूटर द्वारा संसाधित कर रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. Brightfield intravital माइक्रोस्कोपी के न्युट्रोफिल भर्ती पैरामीटर. न्युट्रोफिल भर्ती एमआईपी-2 या agarose जेल की तैयारी में WKYMVm 350 postcapillary venule आसन्न सुक्ष्ममापी रखा न्युट्रोफिल chemoattractant के क्रमिक रिलीज द्वारा प्रेरित किया गया था. समय व्यपगत वीडियो डेटा ImageJ द्वारा वास्तविक समय वीडियो रिकॉर्डिंग प्रयोग के प्रसंस्करण के बाद विश्लेषण किया गया. न्युट्रोफिल intraluminal रेंगने (ए), स्थानांतरगमन समय और टुकड़ी समय (बी), पलायन वेग और ऊतकों में chemotaxis वेग (सी), cremaster मांसपेशियों (डी) में और chemotaxis सूचकांक एमआईपी-2 या WKYMVm agarose पर जेल के प्रशासन के बाद निर्धारित किया गया है C57BL 6 / चूहों में cremaster मांसपेशियों (n = 3, = (ए बी और) 22 और 27 (सी और डी में) क्रमशः एमआईपी-2 के लिए और 26 = (ए और बी) और 44 (# ट्रैक किए गए कोशिकाओं की सी और डी) WKYMVm के लिए क्रमशः).

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Discussion: ट्रैकिंग न्युट्रोफिल Intraluminal क्रॉलिंग, Transendothelial प्रवासन और intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा chemotaxis ऊतक में

Intravital माइक्रोस्कोपी सूजन के दौरान ल्युकोसैट भर्ती के सेलुलर और आणविक तंत्र का खुलासा करने के लिए आवश्यक उपकरण है. ल्युकोसैट cremaster मांसपेशियों और अन्त्रपेशी जैसे transluscent ऊतकों के microvasculature में endothelial सेल बातचीत के निर्धारण के लिए मात्रात्मक दृश्य 1,5 तकनीक के आवेदन के लिए सोने के मानक बना रहता है. पारंपरिक brightfield intravital माइक्रोस्कोपी कई अनूठे तकनीकी सुविधाओं है और भर्ती तंत्र इन ऊतकों में पता चला 1,2,6 vivo में सबसे ऊतकों को लागू कर रहे हैं. हालांकि, फेफड़े, जिगर और मस्तिष्क के रूप में कुछ अन्य ऊतकों में ल्युकोसैट भर्ती के तंत्र cremaster मांसपेशियों और अन्त्रपेशी 1 में पता चला उन लोगों से काफी अलग पाया गया है. इसके अलावा, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी कुछ कम पारदर्शी ऊतकों में इस्तेमाल किया जा है.

माइक्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति आधारित है जो जीवित कोशिकाओं के कार्यों के लिए photodamage के लिए जाना जाता है के साथ तुलना में, brightfield intravital माइक्रोस्कोपी और अधिक शारीरिक और कम कोशिकाओं और ऊतकों (इसलिए कम कलाकृतियों के साथ) के लिए हानिकारक है जब लंबे समय में गतिशील सेलुलर व्यवहार के अवलोकन के लिए इमेजिंग जीवित पशुओं आवश्यक है 7. यह भी और अधिक सुविधाजनक है, कम महंगा और कोई फ्लोरोसेंट लेबलिंग की जरूरत है. दूसरी ओर, intravital माइक्रोस्कोपी में transillumination इमेजिंग के साथ, स्वचालित ट्रैकिंग सेलुलर आंदोलन बाजार पर वर्तमान में उपलब्ध वाणिज्यिक इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ असंभव है. हालांकि, यह बहुत आसान है उसी brightfield intravital खुर्दबीन पर एक अलग प्रतिदीप्ति intravital इमेजिंग प्रणाली (उदाहरण के लिए, एक प्रतिदीप्ति सीसीडी कैमरा और कंप्यूटर के लिए छवियों को पेश करके) (चित्रा 1) सेट. यह एक ही प्रयोग में एक ही नमूना तैयारी पर brightfield माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के बीच स्विचन करने की सुविधा प्रदान करता है. यह भी यह संभव स्वचालित रूप से प्रतिदीप्ति intravital माइक्रोस्कोपी के तहत fluorescently लेबल की कोशिकाओं के आंदोलन को ट्रैक करने के लिए जब लेबल कोशिकाओं और बड़े पर्याप्त और उपयुक्त पृष्ठभूमि इमेजिंग सॉफ्टवेयर है प्रतिदीप्ति तीव्रता के बीच विपरीत कंप्यूटर पर स्थापित है बनाता है.

हमारी प्रस्तुति के रूप में यहाँ दर्शाया गया है, हम न्युट्रोफिल भर्ती की पूरी प्रक्रिया का प्रत्यक्ष प्रेक्षण के लिए और प्रत्येक भर्ती चरण में कोशिकाओं और अणुओं के कार्यों का निर्धारण करने के लिए vivo तकनीक में इस का मूल्य प्रदर्शित करता है. साथ chemoattractant agarose जेल की तैयारी में रखी जाती है और ऊतकों को आयोजित एक यूनिडायरेक्शनल chemotactic ढाल ऊतक कि ल्युकोसैट भर्ती स्वाभाविक रूप से स्थानीय 8,9 सूजन के दौरान होने वाली उन जैसी प्रतिक्रियाएं लाती में स्थापित किया जा सकता है है. chemoattractant के स्रोत की ओर postcapillary venule से दिशात्मक ल्युकोसैट आंदोलन brightfield intravital माइक्रोस्कोपी और वीडियो फोटोग्राफी द्वारा स्पष्ट रूप से देखे जा सकते हैं. समय चूक वीडियो प्रसंस्करण के साथ, सेल आंदोलन ImageJ द्वारा लगाया जा सकता है और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मानकों की एक श्रृंखला मापा जा सकता है. विशिष्ट ट्रांसजेनिक चूहों, inhibitors और चयनात्मक chemoattractants के साथ, परख प्रणाली हमें ल्युकोसैट भर्ती में विशिष्ट प्रोटीन के कार्यों को प्रकट करने के लिए मदद करता है. उदाहरण के लिए, इस तकनीक हमें सहायता द्वारपाल के रूप में endothelial कोशिकाओं में LSP1 के लिए न्युट्रोफिल transendothelial 10 प्रवास के नियमन में मैक-1 के लिए न्युट्रोफिल intraluminal रेंगने में भूमिका (αMβ2 integrin) की भूमिका, इष्टतम transendothelial प्रवास के लिए एक आवश्यक कदम की पहचान 3, और ऊतकों में 11 न्युट्रोफिल chemotaxis में PI3Kγ भूमिका के लिए.

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Disclosures: ट्रैकिंग न्युट्रोफिल Intraluminal क्रॉलिंग, Transendothelial प्रवासन और intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा chemotaxis ऊतक में

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements: ट्रैकिंग न्युट्रोफिल Intraluminal क्रॉलिंग, Transendothelial प्रवासन और intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा chemotaxis ऊतक में

इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा (CIHR, एमओपी - 86,749) से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. एल लियू CIHR नई अन्वेषक पुरस्कार (MSH 95,374) के एक प्राप्तकर्ता है.

Materials: ट्रैकिंग न्युट्रोफिल Intraluminal क्रॉलिंग, Transendothelial प्रवासन और intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा chemotaxis ऊतक में

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylene tubing, PE10 Becton Dickinson 427401 I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm
India ink Speedball Art Super Black 100% carbon black pigment-no dyes
Cautery Aaron Medical AA03
Xylazine Bayer HealthCare, Bayer Inc. DIN 02169592
Ketamine hydrochloride Bioniche Animal Health Canada, Inc. DIN 01989529
Murine recombinant MIP-2 R&D Systems 452-M2
WKYMVm Phoenix Pharmaceuticals, Inc. 072-12
Agarose Invitrogen 15510-027 Ultrapure
Heparin Sigma H-3393
Upright microscope Olympus BX61WI
3CCD color video camera SONY DXC-990
HD-DVD video recorder LG Electronics Inc. RH398H-M
TV monitor LG Electronics Inc. 22LG30
Water circulator Thermo Scientific HAAKE DC10
Peristaltic pump Gilson; Pharmacia Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3
Cremaster muscle board University of Saskatchewan Home-made

References: ट्रैकिंग न्युट्रोफिल Intraluminal क्रॉलिंग, Transendothelial प्रवासन और intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा chemotaxis ऊतक में

  1. Liu, L. & Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
  2. Petri, B., Phillipson, M., & Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
  3. Phillipson, M., et al. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade. J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).
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  5. Gavins, F.N. & Chatterjee, B.E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
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  7. Hazelwood, K.L., et al. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions., 3-43 (2007).
  8. Hickey, M.J., et al. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
  9. Cara, D.C. & Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
  10. Liu, L., et al. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
  11. Heit, B., et al. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).

Ask the Author: ट्रैकिंग न्युट्रोफिल Intraluminal क्रॉलिंग, Transendothelial प्रवासन और intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा chemotaxis ऊतक में

1 Comment

Great job!! Would you let me know:
What size (diameter) of the postcapillary venule in cremaster muscle in mice was be selected in your imaging?
Thank you very much.

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Posted by: Perry LiuJanuary 3, 2012, 1:58 PM

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