生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

1。アガロースゲルでの誘引物質の調製

1. ピペット10 50 - mLコニカルチューブに2 × PBSの添加、および熱水を入れたビーカーに入れておくことによりチューブのウォームアップを行います。
2. ピペット10の蒸留水を加えて、別の50 mLコニカルチューブに0.4 Gアガロースの粉末を加える（少し緩め、キャップ付き）、混合物を加熱（700ワットの電子レンジで約1分間）電子レンジのちょうど沸騰するまで。
3. アガロース溶液のチューブ、渦混合溶液に加温し、2 × PBSを追加し、お湯のビーカーに、冷えないように保管してください。
4. マイクロピペットを用いて吸引しても3μlのインドのインクと混合を含む1.5 mLのエッペンドルフチュー​​ブの蓋に、マイクロピペット走化性溶液（例えば、CXCケモカインMIP - 2または1 mM WKYMVmの12μlの0.5μgの10μlのは）（避ける空気の泡）。
5. 蓋に200μlのピペットチップおよびアガロース溶液（42 ° C）のマイクロピペット110μlの先端をカットし、すぐに別のピペットチップを（空気の泡を避けるため）を使用してよく混ぜる。
6. +4化学誘引物質含有ゲル℃にて保存してください。

2。生体顕微鏡検査のための精巣挙筋の調製（図1）

1. 10 mg / kgのキシラジン、200 mg / kgの塩酸ケタミンの混合物の腹腔内注射による成熟雄性マウスを麻酔。
2. 右外頸静脈と電気かみそりと陰嚢の前面を覆う領域を剃る。麻酔後、麻酔マウスに特別な注意とケアを提供することが重要です。ヒートランプは低体温症からマウスを防止するために使用されることがあります。マウスは、痛みの反射のない状態にしてください。
3. 水平方向の切開を行う、100 U / mLのヘパリンの生理食塩水で満たされたPE - 10チューブを使用して頚静脈を見つけて、カテーテルを挿入する。必要な時に頸静脈のカテーテル挿入は、追加の麻酔薬や薬の投与のために必要です。
4. マウスは、ホームメイドの精巣挙筋板（図1）に表向きに横たわっていると臍テープでマウスの後ろ足を修正。
5. 精巣挙筋とマウスの体を暖かく保つために37℃の水循環にボードを接続する。

注：2.6から2.14までのすべての手順は非常に穏やかに⁵を実行する必要があります。

6. 左精巣挙筋を露出するために陰嚢皮膚に切開を加えます。慎重に関連付けられている筋膜から筋肉を細かく分析。
7. ° Cに加温した蠕動ポンプを用いて（131.9のNaCl、4.7 KClを、1.2のMgSO _4、20mMの中のNaHCO _3を 、液、pH7.4）生理食塩水重炭酸緩衝化37で精巣挙筋の表面かん流する。
8. 精巣挙筋板の透明な観覧のガラスの台座の上にそれを保持するために精巣挙筋の遠位端に4から0縫合糸を結びます。
9. 縦方向に精巣挙筋を焼灼する。 4から0縫合糸で、筋肉のフラットを保持し、台座のエッジに沿って固定します。基本となる筋肉から睾丸と精巣上体を分離し、腹腔内にそれらを移動する。
10. 37 ° Cに加温した灌流バッファ付き〜0.6 ml /分で筋肉を表面かん流すると22 × 22 mmのカバーガラスで露出筋肉をカバー。
11. 、顕微鏡のステージ上で精巣挙筋のボードを置き、顕微鏡で筋肉を調べ、適切なpostcapillary静脈を（ストレートおよび非分岐であり、通常のせん断速度25〜40ミクロ​​ンの直径を有する細静脈を選択して）検索して、ビデオカメラを調整する細静脈は、テレビモニターの左右どちらかの端に垂直位置に可視化できるようにする。
12. 30分の平衡した後、ビデオレコーダーを使用してベースラインの制御データとして、5分間選択postcapillary細静脈のビデオ画像を記録する。
13. 灌流を停止し、筋肉でカバーを取り外します。
14. 350μmであるから、事前に選択されたエリアでの精巣挙筋の表面上に約1 mmの³サイズの化学誘引物質を含むゲルを置き、平行観測postcapillary細静脈に、代わりにゲルを保持するためにカバースリップを追加し、非常に筋肉組織を表面かん流する徐々に解放され、ゲルから形成される走化性因子の勾配の確立を可能にするために遅い速度（≤10μL/分）。
15. 化学誘引物質を含むゲルの添加後90分間のビデオ画像を記録する。録音中は、静脈内および筋肉組織の白血球をtransmigratingとchemotaxing、クロール、付着に関する顕微鏡のフォーカスを調整してください。
16. 実験後、解析のためのコンピュータにビデオファイルをインポートします。

3。 ImageJを用いた細胞の追跡

1. コンピュータ上で、抽出して、AVI形式（例えば、AVIファイルにDVDビデオを変換する無料のコンピュータソフトウェアのbitRipperを使用）にビデオを変換します。
2. 時間が経過した動画を生成するためのビデオ編集ソフトウェアを使用してください。例えば、時間が経過した動画を（1 / 512または1024分の1の時間経過のためにWindowsムービーメーカーを使用してくださいオリジナルの、リアルタイムのビデオからT 30 - fpsレート）。 DV - AVI形式に圧縮されていない時間が経過した動画を変換して保存。
3. 同じ顕微鏡の設定でキャリブレーションマイクロメートルの画像を記録し、コンピュータに画像をインポートし、ImageJので画像を開きます。 ImageJのでは、総ピクセルが画面の左上（例えば、720 × 480ピクセル）に表示されます。 X軸とY軸（例えば、200 × 150μm）の両方で画面の大きさを測定します。このことから、ミクロンあたりのピクセル（例えば、X = 200分の720 = 3.6ピクセル/μmの、およびy = 150分の480 = 3.2ピクセル/μm）の数を計算する。
4. 再び映画、オープンImageJをインポートするには、"ファイル - インポート - 使用して、QuickTimeムービープラグイン"をクリックして、分析するムービーを選択し、"QTムービーの開閉"のインタフェースで"OK"をクリックします。
5. 細胞を追跡するために、"プラグイン - マニュアルトラッキング"をクリックしてください。開始トラッキングの前に下部にあるフィールドに関連する情報を入力してください。簡単に言えば、
   1. 時間間隔（秒）= fold-time-lapse/30（例えば、1020 ×タイムラプス= 34秒/フレームの間隔を1020から1030になる）。
   2. x / yのキャリブレーション=マイクロメートルの画像のキャリブレーションを使用してμm/ピクセル測定。
   3. Z校正= 0（マウス精巣挙筋は組織や細胞のクロールと移行の非常に薄い層であるとして明視野透視下で約2Dです）。
   4. センタリング= 1の正方形のサイズを検索します。
   5. ドットサイズ/線幅/フォントサイズ：必要に応じてそれらを調整することができます。
6. 基準点として、安定かつ明瞭なポイントを選択します。この基準点は、全実験を通じて変化と安定している明確な、小さな構造のポイントになります。最後のフレームに最初から基準点を追跡し、"終了トラック"をクリックして"トラックを追加"をクリックします。データは自動的に結果表に表示されます。
7. 好中球をクロールし、移行を追跡一つずつ：クリックすると、各フレームにおけるその消失する組織において、その外観から細胞を追跡し、Microsoft Excelでの結果を終了して保存するには"終了トラック"をクリックして"トラックを追加"。

4。好中球リクルートパラメータの解析

1. Microsoft Excelで結果のファイルを開き、（分析に基準点の変更を行う）、データを分析する。
2. 腔内クロール
   1. 距離をクロール：合計距離はセルが最適な移住地（μm）に初期接着部位から内腔にクロール。
   2. クロール速度：クロールの距離/時間（μm/分）。
3. 経内皮移動
   1. 移住の時間：セル全体の細胞体は、細静脈の外側だけであるとは細胞体が内腔（分または秒）で見られない時の時間に内皮を越え転生するために開始時間から。
   2. 剥離は時間：時から全体の細胞体は単なる静脈外にある（すぐに移住後の）時点にセルが細静脈（尾部が縮んだ状態）（分または秒）との接触を失う。
4. 組織の走化性
   1. 移行距離：距離の和開始点から組織のマイグレーション（μm）のエンドポイントへの細胞移動。
   2. 移行の速度：組織/時間の移動距離（μm/分）。
   3. 走化性の距離：距離のセルの合計は、組織におけるx軸（μm）で移行。
   4. 走化性の速度：走化性の距離/時間（μm/分）。
   5. 走化性指数：組織の移動距離で走化性の距離を分割する比率。

5。代表的な結果：

bightfield生体顕微鏡が白血球 - 内皮細胞相互作用の研究のために使用されており、好中球のために、必ずしもではないかもしれないが、我々は組織学的研究によって、好中球走化性処理精巣挙筋の動員細胞の95％以上が実際に好中球であったことが確認。このレポートでは、好中球選択的誘引物質を使用して、我々はin vivoでの好中球の動員を追跡する手順を紹介します。具体的には、トラッキング好中球腔内クロール、経内皮移動、およびタイムラプス生体内ビデオ顕微鏡とImageJを用いて麻酔したマウスの精巣挙筋の組織における走化性のプロトコルを記述する。精巣挙筋上に化学誘引物質含有アガロースゲルは、徐々に化学誘引物質を放出し、走化性勾配が組織に確立することができます。好中球の走化性因子は、マウスの精巣挙筋postcapillary細静脈における好中球 - 内皮細胞の相互作用を誘導する。全体の実験では、テレビモニターにカラービデオカメラで投影し、ビデオレコーダで記録されたビデオイメージを持つ正立明生体顕微鏡下で可視化です。我々は、好中球を決定アガロースゲル（図2）で調製した化学誘引物質MIP - 2とWKYMVmを好中球への応答における筋肉組織の内腔クロール、経内皮移動と移行し、走化性。我々は、MIP - 2（0.5μMで）とWKYMVmが（0.1 mmで）ほぼで同等の時間の長さは、好中球の遊走および筋肉組織における走化性のための静脈から同じような速度、好中球内皮遊走および剥離時に好中球腔内クロールを引き出したことがわかった同じ速度および同じような好中球の走化性のインデックスを持つ（P> 0.05、スチューデントt検定）。

図1。生体顕微鏡システムの概略図。マウス精巣挙筋は、顕微鏡ステージ上で精巣挙筋板の透明な観覧の台座の上に体外と37℃に加温した重炭酸塩緩衝食塩水で灌流される。正立顕微鏡は、明視野生体顕微鏡用CCDカラービデオカメラと接続されています。モノクロ深い冷却CCDデジタルカメラも蛍光生体顕微鏡用顕微鏡のポートに接続され、イメージはそこから直接コンピュータによって処理されます。

明生体顕微鏡の図2。好中球動員のパラメータ。好中球の動員は、アガロースゲルの準備のMIP - 2またはWKYMVmがpostcapillary細静脈に隣接350μmであるが置かれた好中球の走化性因子が徐々に放出によって誘発された。時間経過ビデオデータは、実験のリアルタイムのビデオ録画を処理した後、ImageJのによって分析した。精巣挙筋（D）における好中球内腔クロール（）、移住の時間と剥離の時間（B）、組織の移動速度と走化性の速度（C）、および走化性の指数は、MIP - 2またはWKYMVmアガロースゲル上での投与後に測定したC57BL / 6マウスの精巣挙筋（n = 3の、＃追跡セルの= 22（AとBで）、27（CおよびDで）それぞれMIP - 2の、と= 26（AとB）、44（ WKYMVmため、それぞれCとD）で）。

生体顕微鏡検査は、炎症時に白血球動員の細胞および分子メカニズムを明らかにするための不可欠なツールです。このような精巣挙筋および腸間膜としてtransluscent組織の微小血管系における白血球-内皮細胞の相互作用を測定するための定量的可視化は、技術^1,5のアプリケーションのためのゴールドスタンダードのまま。従来の明視野生体顕微鏡は、多くのユニークな技術的特徴を有しており、これらの組織で明らかに募集のメカニズムは、 生体内 ^1,2,6 のほとんどの組織に適用可能です。しかし、このような肺、肝臓、脳などのいくつかの他の組織における白血球の動員のメカニズムは、精巣挙筋および腸間膜¹で明らかと大きく異なる発見されている。さらに、蛍光顕微鏡は、いくつかの少ない透明な組織で使用する必要があります。

ときに、動的な細胞の振る舞い​​を観察するための長い時間イメージング生きている細胞の機能への光損傷のために知られている蛍光ベースの顕微鏡と比較して、明視野生体顕微鏡は、多くの生理学的および細胞や組織（したがって、以下のアーティファクトを持つ）への害が少ないです。生きた動物は⁷必要です。それは、また、より便利に低コストでは蛍光標識は必要ありません。一方、生体顕微鏡で透視イメージングで、自動トラッキング携帯電話の動きは、市場で現​​在利用可能な商用のイメージングソフトウェアでは不可能です。しかし、同じ明生体顕微鏡（図1）に別々の蛍光生体イメージングシステム（例えば、蛍光をCCDカメラとコンピュータに画像を投影すること）を設定するのは非常に簡単です。これは、単一の実験で同一の試料調製に明視野顕微鏡と蛍光イメージングの切り替えの利便性を提供します。これはまた、標識された細胞の蛍光強度と背景のコントラストが十分な大きさと、適切なイメージングソフトウェアがコンピュータにインストールされている場合、自動的に蛍光生体顕微鏡下で蛍光標識した細胞の動きを追跡することが可能になります。

私たちのプレゼンテーションでここに示すように、我々は、好中球動員の全体のプロセスの直接観察と各募集の段階での細胞や分子の機能を決定するためのin vivoでの技術では、このの値を示しています。化学誘引物質はアガロースゲルの準備に含まれると組織に開催して、単方向の走化性勾配は、自然に局所の炎症^8,9の間に起こるものに類似している白血球の動員の応答を誘発する組織を設立することができます。走化性因子の源に向かってpostcapillary静脈から方向性白血球の動きが明生体顕微鏡とビデオの撮影で明瞭に可視化することができる。タイムラプスビデオ処理で、細胞の運動は、ImageJので追跡することができ、再現性の高い一連のパラメータを測定することができます。特定のトランスジェニックマウス、阻害剤および選択的な化学誘引物質で、アッセイ系は、私たちは白血球動員における特定のタンパク質の機能を明らかにするために役立ちます。例えば、このテクニックは、好中球の内皮遊走¹⁰の規制におけるゲートキーパーとしての内皮細胞におけるLSP1の役割、好中球腔内クロールのMac - 1の役割（αMβ2インテグリン）、最適な経内皮移動するための不可欠なステップを識別するために、私たちを支援^3、組織¹¹の好中球走化性におけるPI3Kγの役割。