Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

1. Preparazione del chemiotattico in gel

1. Pipettare 10 ml di 2 × PBS in un tubo da 50 ml conica, e scaldare il tubo mettendolo in un bicchiere contenente acqua calda.
2. Pipettare 10 ml di acqua distillata e aggiungere 0,4 g di polvere di agarosio in un altro tubo da 50 ml coniche (con il suo tappo leggermente allentato) e scaldare la miscela fino a poco bollente in un forno a microonde (per ~ 1 minuto in un 700-watt forno a microonde) .
3. Aggiungere il riscaldato 2 × PBS alla soluzione di agarosio tubo, agitare la soluzione mista e tenerlo caldo nel bicchiere di acqua calda.
4. Micropipetta soluzione chemiotattico (ad esempio, 10 ml di 0,5 mg di CXC chemochine MIP-2 o 12 ml di 1 WKYMVm mM) nel coperchio di un 1,5 mL provetta Eppendorf contenente 3 inchiostro microlitri India e mescolare bene per aspirazione mediante una micropipetta (evitare bolle d'aria).
5. Tagliare l'estremità di una punta di 200 microlitri punta della pipetta e micropipetta 110 ml di soluzione di agarosio (42 ° C) nel coperchio e subito mescolare bene con un altro puntale (evitare bolle d'aria).
6. Conservare il chemiotattico contenenti gel a +4 ° C.

2. Preparazione di Cremaster muscolare per microscopia intravitale (Figura 1)

1. Anestetizzare un topo adulto di sesso maschile con una iniezione ip di una miscela di 10 mg / kg xylazina e 200 mg / kg di ketamina cloridrato.
2. Radere l'area più giusta vena giugulare esterna e la faccia anteriore dello scroto con un rasoio elettrico. Dopo l'anestesia, è importante prestare particolare attenzione e cura per il mouse anestetizzato. Una lampada di calore può essere usato per prevenire il mouse da ipotermia. Il mouse deve essere privo di riflesso il dolore.
3. Effettuare una incisione orizzontale, trovare e cateterizzare la vena giugulare con un tubo in PE-10 pieno di 100 U / mL soluzione salina eparina. Cateterismo della vena giugulare è necessario per la somministrazione di anestetici e farmaci aggiuntivi se necessario.
4. Fissare le gambe posteriori del mouse con il nastro ombelicale con il mouse, sdraiato a faccia in su un fatto in casa a bordo del muscolo cremastere (Figura 1).
5. Collegare la scheda ad un circolatore d'acqua a 37 ° C per mantenere il muscolo cremastere e il corpo del mouse caldo.

Nota: Tutte le procedure di 2,6-2,14 deve essere effettuata molto delicatamente ^5.

6. Fare un'incisione nella pelle scrotale per esporre il muscolo cremastere sinistra. Con attenzione sezionare il muscolo dalla fascia associati.
7. Superfuse il muscolo cremastere con 37 ° C-riscaldato bicarbonato soluzione salina tamponata (131,9 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgSO _4, 20 NaHCO _3, in mM, pH 7,4) utilizzando una pompa peristaltica.
8. Tie una sutura 4-0 alla fine distale del muscolo cremastere a tenerlo premuto sul piedistallo in vetro trasparente visione della scheda del muscolo cremastere.
9. Cauterizzare il muscolo cremastere longitudinalmente. Con sutura 4-0, tenere premuto il piatto muscolare e fissarlo lungo i bordi sul piedistallo. Separare il testicolo e l'epididimo dal muscolo sottostante e spostarli nella cavità addominale.
10. Superfuse il muscolo a ~ 0,6 ml / min con il 37 ° C-riscaldata buffer di perfusione e coprire il muscolo esposto con un 22 × 22 millimetri coprioggetto di vetro.
11. Posizionare la scheda del muscolo cremastere sul palco microscopio, esamina il muscolo sotto il microscopio, trovare un venule adatto postcapillari (Selezionare il venule che è dritto e ramificato ed ha frequenza normale di taglio e un diametro di 25-40 micron) e regolare la telecamera per consentire l'venule da visualizzare in posizione verticale su entrambi i lati a sinistra oa destra del monitor TV.
12. Dopo 30 minuti di equilibrio, registrare le immagini video delle venule selezionati postcapillari per 5 minuti come dati di controllo di base utilizzando un videoregistratore.
13. Fermare il superfusione e rimuovere il vetrino sul muscolo.
14. Inserire un ~ 1-mm ³ dimensioni chemoattractant contenenti gel sulla superficie del muscolo cremastere in una zona preselezionata da 350 micron e parallelo al venule osservato postcapillari, aggiungere il coprioggetto per tenere il gel a posto e superfuse il tessuto muscolare ad una molto ritmo lento (≤ 10 microlitri / min) per consentire la creazione di un gradiente di chemiotattico che viene rilasciato lentamente e formata dal gel.
15. Registrare l'immagine video per 90 minuti dopo l'aggiunta del gel contenente chemoattractant. Durante la registrazione, regolare e mantenere l'attenzione sul microscopio aderenti, strisciando, e trasmigrante chemotaxing leucociti all'interno del venule e nel tessuto muscolare.
16. Dopo l'esperimento, importare il file video su un computer per l'analisi.

3. Cellula di rilevamento utilizzando ImageJ

1. Su un computer, estrarre e convertire il video in formato AVI (per esempio, l'uso gratuito bitRipper software per convertire video DVD in un file AVI).
2. Utilizzare il software di editing video per generare il tempo trascorso film. Ad esempio, utilizzare Windows Movie Maker per fare un tempo trascorso film (a 1 / 512 o 1 / 1024 time-lapse unoT 30-fps rate) da quella originale, video in tempo reale. Convertire e salvare il tempo trascorso non compresso film formato DV-AVI.
3. Registrare le immagini del micrometro calibrazione sotto il microscopio stessa impostazione, importare le immagini al computer, aprire le immagini con ImageJ. In ImageJ, i pixel totali appaiono in alto a sinistra dello schermo (ad esempio, 720 × 480 pixel). Misurare le dimensioni dello schermo, sia gli assi X e Y (ad esempio 200 × 150 micron). Da questo, calcolare il numero di pixel per micron (ad esempio, x = 720/200 = 3,6 pixel / micron, e y = 480/150 = 3,2 pixel / micron).
4. Per importare il filmato, aprire ImageJ di nuovo, fare clic su "File-Import-Utilizzo filmati QuickTime Plug-in", selezionare il film da analizzare e fare clic su "OK" a livello di interfaccia di "Opener filmato QT".
5. Fare clic su "Plugin-Manual monitoraggio" per tenere traccia delle cellule. Compila le informazioni rilevanti nei campi in basso prima di iniziare il monitoraggio. In breve,
   1. Intervallo di tempo (in secondi) = fold-time-lapse/30 (Ad esempio, un 1020 × time-lapse sarebbe 1020/30 = 34 sec / frame intervallo).
   2. x / y = calibrazione della micron / pixel di misura utilizzando la calibrazione dell'immagine del micrometro.
   3. z calibrazione = 0 (come il muscolo cremastere topo è uno strato estremamente sottile di strisciare tessuti e cellule e le migrazioni sono circa 2D in campo chiaro transilluminazione).
   4. Cerca formato quadrato per centrare = 1.
   5. Dot dimensioni / Linea larghezza / Dimensione carattere: possono essere modificate se necessario.
6. Selezionare un punto stabile e chiaro come punto di riferimento. Questo punto di riferimento può essere un punto chiaro e piccole strutturali che rimane invariato e stabile durante l'intero esperimento. Fare clic su "Add Track" per tenere traccia del punto di riferimento dal primo all'ultimo fotogramma e fare clic su "Track finale". I dati appaiono sul tavolo i risultati automaticamente.
7. Pista strisciando e la migrazione di neutrofili uno per uno: fare clic su "Add Track" per monitorare la cellula dalla sua apparizione nel tessuto alla sua scomparsa in ogni fotogramma e fare clic su "Track Fine" per terminare e salvare i risultati in Microsoft Excel.

4. Analisi dei parametri di reclutamento dei neutrofili

1. Aprire il file dei risultati in Microsoft Excel, e analizzare i dati (prendere i cambiamenti di punto di riferimento in analisi).
2. Crawling intraluminali
   1. Crawling distanza: la distanza totale della cellula striscia nel lume dal sito iniziale aderente al sito trasmigrazione ottimale (micron).
   2. Crawling velocità: crawling distanza / tempo (micron / min).
3. Migrazione transendoteliale
   1. Trasmigrazione tempo: dal momento in cui il cellulare inizia a trasmigrare attraverso endotelio al tempo in cui l'intero corpo cellulare si trova appena fuori le venule e nessun corpo cellulare può essere visto nel lume (min o sec).
   2. Tempo distacco: dal momento in cui il corpo cellulare tutto è appena fuori dal venule (subito dopo la trasmigrazione) al punto di tempo in cui la cellula perde il contatto con le venule (la coda si ritrae) (min o sec).
4. Chemiotassi nei tessuti
   1. Distanza di migrazione: la somma della distanza della cella si sposta dal punto iniziale al punto finale della migrazione nel tessuto (micron).
   2. Velocità di migrazione: la migrazione nel tessuto distanza / tempo (micron / min).
   3. Chemiotassi distanza: la somma della distanza della cellula migra in asse x nel tessuto (micron).
   4. Velocità di chemiotassi: chemiotassi distanza / tempo (micron / min).
   5. Chemiotassi indice: il rapporto tra dividendo la distanza chemiotassi dalla distanza di migrazione nei tessuti.

5. Rappresentante dei risultati:

Anche se bightfield microscopia intravitale viene utilizzato per lo studio delle interazioni leucociti-endotelio delle cellule e non possono essere necessariamente per i neutrofili, abbiamo confermato che, dai nostri studi di istologia, oltre il 95% delle cellule reclutate in neutrofili chemoattractant trattati con muscoli cremastere erano davvero neutrofili . In questo rapporto, con neutrofili selettivi chemiotattici, vi presentiamo le procedure di tracking il reclutamento dei neutrofili in vivo. In particolare, si descrive un protocollo di monitoraggio strisciare neutrofili intraluminale, migrazione transendoteliale, chemiotassi e nel tessuto muscolare cremastere in topi anestetizzati utilizzando la microscopia time-lapse intravitale video e ImageJ. Il chemoattractant contenenti gel sul muscolo cremastere rilascia lentamente chemiotattico e permette un gradiente chemiotattico da stabilire in tessuto. Chemiotattico dei neutrofili induce neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali in cremasterico venule postcapillari nei topi. L'intero esperimento viene visualizzato sotto un microscopio a campo chiaro verticale intravitale con immagini video proiettate da una telecamera a colori ad un monitor TV e registrate da un videoregistratore. Abbiamo determinato i neutrofilistrisciare intraluminale, la migrazione e la migrazione transendoteliale e chemiotassi nel tessuto muscolare in risposta a dei neutrofili chemoattractant MIP-2 e WKYMVm preparati in gel (Figura 2). Abbiamo scoperto che MIP-2 (a 0,5 mM) e WKYMVm (a 0,1 mm) ha suscitato neutrofili strisciando intraluminale a velocità simili, la migrazione dei neutrofili transendoteliale e distacco dalle venule per la lunghezza paragonabile di tempo, la migrazione e chemiotassi dei neutrofili nel tessuto muscolare quasi alla stessa velocità e con simili indici chemiotassi dei neutrofili (p> 0.05, test t di Student).

Figura 1. L'illustrazione schematica di un sistema di microscopio intravitale. Il muscolo cremastere è esteriorizzata del mouse sul piedistallo visione chiara del bordo del muscolo cremastere sul palco microscopio e superfused con 37 ° C-riscaldato bicarbonato-salina tamponata. Il microscopio in posizione verticale è collegata con una videocamera a colori CCD per microscopia campo chiaro intravitale. Un bianco e nero profondo raffreddato CCD fotocamera digitale è anche collegato alla porta microscopio a fluorescenza per microscopia intravitale, le immagini da cui sono direttamente elaborati da un computer.

Figura 2. Parametri di reclutamento dei neutrofili di microscopia brightfield intravitale. Reclutamento dei neutrofili è stata indotta dal rilascio graduale di chemoattractant neutrofili MIP-2 o WKYMVm nella preparazione gel messo 350 micron adiacente alla venule postcapillari. Tempo trascorso dati video sono stati analizzati con ImageJ dopo l'elaborazione del video in tempo reale la registrazione di questo esperimento. Crawling dei neutrofili intraluminale (A), il tempo trasmigrazione e tempo distacco (B), la velocità di migrazione e la velocità chemiotassi nei tessuti (C), e l'indice chemiotassi nel muscolo cremastere (D) sono stati determinati dopo la somministrazione di MIP-2 o WKYMVm gel su muscolo cremastere in topi C57BL / 6 (n = 3, # di cellule tracciati = 22 (in A e B) e 27 (in C e D) rispettivamente per MIP-2, e = 26 (in A e B) e 44 ( in C e D) rispettivamente per WKYMVm).

Microscopia intravitale è lo strumento essenziale per rivelare i meccanismi cellulari e molecolari del reclutamento dei leucociti durante l'infiammazione. Visualizzazione quantitativa per la determinazione delle interazioni leucociti-endotelio cellula microcircolo dei tessuti traslucida come il muscolo cremastere e mesentere rimane il gold standard per l'applicazione della tecnica di ^1,5. La microscopia convenzionale intravitale brightfield ha molte caratteristiche uniche tecniche e dei meccanismi di reclutamento rivelato in questi tessuti sono applicabili alla maggior parte dei tessuti in vivo ^1,2,6. Tuttavia, i meccanismi di reclutamento dei leucociti in alcuni altri tessuti come i polmoni, il fegato e il cervello sono stati trovati molto diversa da quelle che si rilevano nel muscolo cremastere e mesentere ^1. Inoltre, microscopia a fluorescenza deve essere utilizzato in alcuni tessuti meno trasparente.

In confronto con la fluorescenza a base di microscopia che è noto per fotodanneggiamento alle funzioni di cellule vive, brightfield microscopia intravitale è più fisiologico e meno dannosi per le cellule e tessuti (quindi con meno artefatti), quando lungo tempo di imaging per osservare dinamiche dei comportamenti cellulari animali vivi è necessaria ^7. E 'anche più comodo, meno costoso e senza marcatura fluorescente è necessario. D'altra parte, con immagini transilluminazione in microscopia intravitale, movimento di tracciamento automatico cellulare è impossibile con il software di imaging attualmente disponibili sul mercato commerciale. Tuttavia, è molto facile da configurare una diversa fluorescence intravitale sistema di imaging (ad esempio, proiettando le immagini su un fluorescence telecamera CCD e computer) al microscopio stesso campo chiaro intravitale (Figura 1). Questo offre la comodità di passaggio tra campo chiaro e microscopia imaging di fluorescenza per la preparazione del campione stesso in un singolo esperimento. Questo rende anche possibile seguire automaticamente il movimento delle cellule fluorescente in microscopia a fluorescenza intravitale quando il contrasto tra l'intensità di fluorescenza delle cellule etichettati e lo sfondo è abbastanza grande e adatto software di imaging è installato sul computer.

Come illustrato qui nella nostra presentazione, dimostriamo il valore di questo nella tecnica in vivo per l'osservazione diretta di tutto il processo di reclutamento dei neutrofili e per la determinazione delle funzioni delle cellule e molecole in ogni fase di reclutamento. Con chemiotattico contenute in preparazione gel e tiene il tessuto, un gradiente chemiotattico unidirezionale può essere stabilita nel tessuto che induce risposte reclutamento dei leucociti simili a quelle naturali che si verificano durante l'infiammazione locale ^8,9. Il movimento direzionale dei leucociti da venule postcapillari verso la sorgente di chemoattractant può essere chiaramente visualizzate al microscopio brightfield intravitale il video e la fotografia. Con time-lapse elaborazione video, il movimento delle cellule possono essere monitorati da ImageJ e una serie di parametri altamente riproducibili può essere misurata. Con specifico topi transgenici, gli inibitori selettivi e fattori chemiotattici, dal sistema di analisi ci aiuta a svelare le funzioni di specifiche proteine ​​nel reclutamento dei leucociti. Per esempio, questa tecnica ci ha aiutato a identificare il ruolo di LSP1 nelle cellule endoteliali come il gatekeeper nella regolazione della migrazione dei neutrofili transendoteliale ^10, il ruolo di Mac-1 (αMβ2 integrina) in neutrofili strisciare intraluminale, un passo essenziale per ottimizzare la migrazione transendoteliale ^3, e il ruolo di PI3Kγ in chemiotassi dei neutrofili nei tessuti ^11.