Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

1. Preparação de quimioatraente em gel de agarose

1. Pipeta de 10 mL de 2 × PBS em um tubo cônico de 50 ml, e aquecer o tubo colocando-o em um copo contendo água quente.
2. Pipetar 10 mL de água destilada e adicionar 0,4 g de pó de agarose em outro tubo cônico de 50 mL (com a tampa ligeiramente soltos) e aquecer a mistura ferver até ficar em um forno de microondas (por 1 min ~ em um forno de microondas 700-watt) .
3. Adicione o aquecido 2 × PBS para a solução de agarose tubo, redemoinho solução mista e mantê-lo aquecido no copo de água quente.
4. Micropipeta solução chemoattractant (por exemplo, 10 ml de 0,5 mg de CXC quimiocinas MIP-2 ou 12 mL de uma WKYMVm mM) na tampa de um tubo Eppendorf de 1,5 mL contendo 3 mL de tinta da Índia e misture bem por aspiração utilizando uma micropipeta (evitar bolha de ar).
5. Corte a extremidade da ponta de uma pipeta de 200 mL e 110 mL micropipeta de agarose solução (42 ° C) na tampa e imediatamente misture bem utilizando outra ponta da pipeta (evitar bolhas de ar).
6. Armazenar o gel chemoattractant contendo a +4 ° C.

2. Preparação de músculo Cremaster para Microscopia intravital (Figura 1)

1. Anestesiar um rato macho adulto por uma injeção ip de uma mistura de xilazina 10 mg / kg e 200 mg de cloridrato / kg cetamina.
2. Raspar a área ao longo da veia jugular externa direita e face anterior do escroto com um barbeador elétrico. Após a anestesia, é importante dar atenção e cuidados especiais para o rato anestesiado. A lâmpada de calor pode ser usado para impedir o mouse de hipotermia. O mouse deve estar livre de dor reflexa.
3. Faça uma incisão horizontal, encontrar e cateterização da veia jugular utilizando um tubo PE-10 preenchido com solução salina com heparina 100 U / mL. Cateterismo da veia jugular é necessário para a administração de anestésicos e medicamentos adicionais, quando necessário.
4. Fixar as pernas traseiras do mouse com fita umbilical com o mouse deitado de barriga para cima em um home-made bordo do músculo cremaster (Figura 1).
5. Conectar a placa para um circulador de água 37 ° C para manter o músculo cremaster eo corpo do mouse quente.

Nota: Todos os procedimentos 2,6-2,14 deve ser realizada muito gentilmente ^5.

6. Faça uma incisão na pele escrotal para expor o músculo cremaster esquerda. Dissecar cuidadosamente o músculo da fáscia associados.
7. Superfuse o músculo cremaster com 37 ° C-aquecido bicarbonato-buffered saline (131,9 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO _4, 20 NaHCO _3, em mM, pH 7,4) usando uma bomba peristáltica.
8. Amarre uma sutura 4-0 para a extremidade distal do músculo cremaster para segurá-la para baixo sobre o pedestal de vidro clara visualização da placa do músculo cremaster.
9. Cauterizar o músculo cremaster longitudinalmente. Com sutura 4-0, mantenha o plano muscular e fixá-lo ao longo das bordas sobre o pedestal. Separar o testículo e epidídimo do músculo subjacente e movê-los para dentro da cavidade abdominal.
10. Superfuse o músculo em ~ 0,6 ml / min com o tampão de perfusão 37 ° C-aquecido e cobrir o músculo exposto com uma lamela de vidro 22 × 22 mm.
11. Coloque a placa do músculo cremaster no palco microscópio, examine o músculo sob o microscópio, encontrar uma vênula adequado postcapillary (Selecione a vênula que é reto e não ramificados e tem taxa de cisalhamento normal e um diâmetro de 25-40 mm) e ajustar a câmera de vídeo para permitir a vênula para ser visualizado em uma posição vertical em ambos os lados esquerdo ou direito do monitor de TV.
12. Após 30 min de equilíbrio, a gravar as imagens de vídeo da vênula selecionados postcapillary por 5 min como dados de base de controle utilizando um gravador de vídeo.
13. Parar o superfusão e retire a lamínula sobre o músculo.
14. Coloque um ~ ^1-3 mm de tamanho gel chemoattractant contendo na superfície do músculo cremaster em uma área pré-selecionadas 350 mM de e paralela à vênula observado postcapillary, adicione lamela para segurar o gel no local e superfuse o tecido muscular em muito ritmo lento (≤ 10 mL / min) para permitir o estabelecimento de um gradiente de chemoattractant que é liberada lentamente e formado a partir do gel.
15. Gravar a imagem de vídeo de 90 min após a adição do gel contendo chemoattractant. Durante a gravação, ajustar e manter o foco microscópio sobre a aderir, rastejando, transmigrando e chemotaxing leucócitos dentro da vênula e no tecido muscular.
16. Após a experiência, importe o arquivo de vídeo para um computador para análise.

3. Rastreamento de células Usando ImageJ

1. Em um computador, extrair e converter o vídeo para o formato AVI (por exemplo, use software livre bitRipper computador para converter vídeo de DVD para arquivos AVI).
2. Use software de edição de vídeo para gerar o filme tempo decorrido. Por exemplo, use o Windows Movie Maker para fazer um filme tempo decorrido (até 1 / 512 ou 1 / 1024 tempo-lapsot taxa de 30 fps) a partir do original, vídeo em tempo real. Converter e salvar o filme tempo decorrido sem compressão de DV-AVI formato.
3. Gravar as imagens de um micrômetro de calibração sob o microscópio mesma configuração, importar imagens para o computador, abra as imagens com ImageJ. No ImageJ, o total de pixels aparecem no canto superior esquerdo da tela (por exemplo, 720 × 480 pixels). Medir o tamanho da tela em ambos os eixos X e Y (por exemplo, 200 × 150 mm). A partir daí, calcular o número de pixels por M (por exemplo, x = 720 / 200 = 3,6 pixels / M, e y = 480 / 150 = 3,2 pixels / mm).
4. Para importar o filme, abra ImageJ novamente, clique em "File-Import-Usando Movies Quicktime Plug-in", selecionar o filme a ser analisado e clique em "OK" na interface de "abridor de Filme QT".
5. Clique em "Rastreamento Plugins-Manual" para rastrear células. Preencha as informações relevantes para os campos no fundo antes de iniciar o rastreamento. Brevemente,
   1. Intervalo de tempo (em seg) = fold-time-lapse/30 (Por exemplo, um 1020 × lapso de tempo seria 1020-1030 = 34 intervalo de seg / frame).
   2. x / y = calibração da medição M / pixel usando a calibração da imagem do micrômetro.
   3. z = 0 calibração (como o mouse músculo cremaster é uma camada extremamente fina de tecidos e células rastejando e migração são aproximadamente 2D sob brilhante-campo transiluminação).
   4. Pesquisa tamanho quadrado para centrar = 1.
   5. Dot size / Linha de largura / Tamanho da fonte: eles podem ser ajustados se necessário.
6. Selecione um ponto estável e claro como um ponto de referência. Este ponto de referência pode ser qualquer ponto claro e pequenas estruturais que permanece inalterado e estável durante todo o experimento. Clique em "Add Track" para rastrear o ponto de referência do primeiro ao último frame e clique em "Track End". Os dados aparecem na tabela de resultados automaticamente.
7. Acompanhar o rastreamento ea migração de neutrófilos, um por um: clique em "Add Track" para rastrear o celular de sua aparência no tecido ao seu desaparecimento em cada quadro e clique em "Track End" para finalizar e salvar os resultados no Microsoft Excel.

4. Análise dos Parâmetros recrutamento de neutrófilos

1. Abra o arquivo de resultados no Microsoft Excel, e analisar os dados (se as mudanças de ponto de referência em análise).
2. Rastejando intraluminal
   1. Rastreamento de distância: a distância total da célula rasteja no lúmen do site inicial aderente ao site a transmigração ideal (m).
   2. Crawling velocidade: rastreamento de distância / tempo (mM / min).
3. Migração transendotelial
   1. Transmigração tempo: a partir do momento da célula começa a transmigrar através do endotélio ao tempo em que o corpo da célula toda é apenas fora da vênula e nenhum corpo celular pode ser visto no lúmen (min ou seg.)
   2. Tempo de descolamento: a partir do momento em que o corpo da célula toda é apenas fora da vênula (imediatamente após a transmigração) para o ponto no tempo quando a célula perde o contato com a vênula (o retrai cauda) (min ou seg.)
4. Quimiotaxia em tecido
   1. Distância de migração: a soma da distância da célula se move a partir do ponto inicial ao ponto final da migração no tecido (mm).
   2. Velocidade de migração: a distância de migração no tecido / hora (mM / min).
   3. Quimiotaxia distância: a soma de células a distância migra no eixo-x no tecido (mm).
   4. Velocidade de quimiotaxia: quimiotaxia distância / tempo (mM / min).
   5. Quimiotaxia índice: a taxa de dividir a distância quimiotaxia pela distância de migração no tecido.

5. Resultados representativos:

Embora bightfield microscopia intravital é utilizado para o estudo das interações leucócito-endotélio celular e não podem ser necessariamente para os neutrófilos, que confirmou que, por nossos estudos de histologia, mais de 95% das células recrutadas em neutrófilos tratados com músculos chemoattractant cremaster foram de fato neutrófilos . Neste relatório, usando neutrófilos seletivo quimioatrativos, apresentamos os procedimentos de monitoramento do recrutamento de neutrófilos in vivo. Especificamente, nós descrevemos um protocolo de rastreamento rastreamento de neutrófilos intraluminal, a migração transendotelial, e quimiotaxia em cremaster tecido muscular em ratos anestesiados com lapso de tempo de microscopia intravital de vídeo e ImageJ. O chemoattractant contendo gel agarose no músculo cremaster libera lentamente chemoattractant e permite um gradiente chemoattractant a ser estabelecida no tecido. Chemoattractant neutrófilos induz interações neutrófilos-célula endotelial em cremastérico vênulas pós-capilares em camundongos. Todo o experimento é visualizado sob um microscópio de campo claro vertical intravital com imagens de vídeo projetadas por uma câmera de vídeo de cor para um monitor de TV e gravado por um gravador de vídeo. Nós determinamos os neutrófilosrastejando intraluminal, a migração transendotelial e migração e quimiotaxia em tecido muscular em resposta à neutrófilos chemoattractant MIP-2 e WKYMVm preparada em gel de agarose (Figura 2). Descobrimos que MIP-2 (0,5 mM) e WKYMVm (0,1 mM) provocou rastejando intraluminal de neutrófilos em velocidade similar, a migração de neutrófilos transendotelial e desprendimento da vênula de comprimento comparável de tempo, a migração de neutrófilos e quimiotaxia no tecido muscular em quase a mesma velocidade e com índices similares quimiotaxia de neutrófilos (P> 0,05, teste t de Student).

Figura 1. A ilustração esquemática de um sistema de microscópio intravital. O mouse músculo cremaster é exteriorizado no pedestal visualização clara de cremaster bordo muscular no palco microscópio e superfused com 37 ° C-aquecido bicarbonato tampão salina. O microscópio na posição vertical é conectado com uma câmera de vídeo CCD de cor para brightfield microscopia intravital. A profunda monocromática CCD refrigerado a câmera digital também é conectado à porta microscópio de fluorescência para microscopia intravital, as imagens a partir do qual são diretamente processados ​​por um computador.

Figura 2. Neutrófilos parâmetros recrutamento de brightfield microscopia intravital. Recrutamento de neutrófilos foi induzida pela liberação gradual de chemoattractant neutrófilos MIP-2 ou WKYMVm na preparação gel agarose colocados 350 mM adjacente à vênula postcapillary. Tempo decorrido dados de vídeo foram analisadas pelo ImageJ após o processamento da gravação de vídeo em tempo real do experimento. Neutrófilos rastejando intraluminal (A), o tempo de transmigração e tempo de descolamento (B), velocidade de migração e velocidade de quimiotaxia em tecido (C), e índice de quimiotaxia em cremaster muscular (D) foram determinados após a administração de MIP-2 ou agarose gel em WKYMVm cremaster muscular em camundongos C57BL / 6 (n = 3, # de células rastreado = 22 (em A e B) e 27 (em C e D), respectivamente, para MIP-2, e = 26 (em A e B) e 44 ( em C e D), respectivamente, para WKYMVm).

Microscopia intravital é a ferramenta essencial para revelar os mecanismos celulares e moleculares do recrutamento de leucócitos durante a inflamação. Visualização quantitativa para a determinação das interações leucócito-endotélio celular na microvasculatura de tecidos translúcido como o músculo cremaster e mesentério continua sendo o padrão ouro para a aplicação da técnica ^1,5. A microscopia intravital convencionais brightfield tem muitas características únicas técnicas e os mecanismos de recrutamento revelou nestes tecidos são aplicáveis ​​a maioria dos tecidos in vivo ^1,2,6. No entanto, os mecanismos de recrutamento de leucócitos em alguns outros tecidos, como pulmão, fígado e cérebro foram encontrados completamente diferentes das reveladas em cremaster muscular e mesentério ^1. Além disso, a microscopia de fluorescência tem que ser usado em alguns tecidos menos transparente.

Comparado com o de microscopia de fluorescência baseada em que é conhecida por photodamage para as funções de células vivas, brightfield microscopia intravital é mais fisiológica e menos prejudiciais para as células e tecidos (portanto, com menos artefatos), quando de longa data de imagens para observar comportamentos dinâmicos celular em animais vivos é necessário ^7. Também é mais conveniente, menos onerosa e sem marcação fluorescente é necessário. Por outro lado, com imagens em microscopia intravital transiluminação, o movimento de rastreamento automático de celulares é impossível com software de imagem atualmente disponíveis no mercado comercial. No entanto, é muito fácil de configurar um separado fluorescência intravital sistema de imagem (por exemplo, projetando as imagens para uma câmera CCD de fluorescência e de computador) no microscópio de campo claro mesmo intravital (Figura 1). Isto proporciona a conveniência de comutação entre microscopia de campo claro e imagens de fluorescência na preparação mesma amostra em um único experimento. Isso também torna possível monitorar automaticamente o movimento das células em microscópio fluorescente etiquetado intravital fluorescência quando o contraste entre a intensidade de fluorescência de células marcadas eo fundo é grande o suficiente e adequado software de imagem está instalado no computador.

Tal como é descrito aqui, em nossa apresentação, nós demonstramos o valor deste na técnica in vivo para observação direta de todo o processo de recrutamento de neutrófilos e para a determinação das funções das células e moléculas em cada etapa de recrutamento. Com chemoattractant contidas na preparação agarose gel e mantidos no tecido, um gradiente quimiotático unidirecional pode ser estabelecida no tecido que induz o recrutamento de leucócitos respostas semelhantes às que ocorrem naturalmente durante a inflamação local ^8,9. O movimento direcional dos leucócitos da vênula postcapillary em direção à fonte de chemoattractant pode ser claramente visualizado por microscopia intravital brightfield e fotografia de vídeo. Com lapso de tempo de processamento de vídeo, o movimento das células pode ser rastreado por ImageJ e uma série de parâmetros altamente reprodutíveis podem ser medidos. Com específicas camundongos transgênicos, os inibidores seletivos e quimioatrativos, o sistema de análise nos ajuda a revelar as funções de proteínas específicas no recrutamento de leucócitos. Por exemplo, esta técnica nos ajudaram a identificar o papel de LSP1 nas células endoteliais como o gatekeeper na regulação da migração de neutrófilos transendotelial ^10, o papel de Mac-1 (αMβ2 integrina) em rastejando intraluminal de neutrófilos, um passo essencial para a migração transendotelial ideal ^3, e do papel para PI3Kγ na quimiotaxia de neutrófilos no tecido ^11.