Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

1. Preparación de quimioatrayente en gel de agarosa

1. Pipeta de 10 ml de 2 × PBS en un tubo cónico de 50 ml, y calentar el tubo por ponerlo en un recipiente que contiene agua caliente.
2. Pipeta de 10 ml de agua destilada y añadir 0,4 g de polvo de agarosa en otro tubo cónico de 50 ml (con la tapa ligeramente floja) y calentar la mezcla hasta que esté hirviendo en un horno de microondas (para ~ 1 min en un horno microondas de 700 vatios) .
3. Agregue el calentado de 2 × PBS a la solución de agarosa al tubo, agitar la solución mixta y mantenerlo caliente en el vaso de agua caliente.
4. Micropipeta solución quimiotáctica (por ejemplo, 10 l de 0,5 mg de quimiocinas CXC MIP-2 y 12 l de WKYMVm 1 mM) en la tapa de un tubo de 1,5 ml Eppendorf que contiene 3 l tinta china y mezclar bien mediante aspiración con una micropipeta (evitar burbuja de aire).
5. Cortar el extremo de la punta de una punta de pipeta de 200 l 110 l y micropipeta de agarosa solución (42 ° C) en la tapa e inmediatamente mezclar bien con otro punta de la pipeta (evite burbujas de aire).
6. Guarde el gel quimioatrayente que contienen a + 4 ° C.

2. Preparación de músculo Cremaster de microscopía intravital (Figura 1)

1. Anestesiar a un ratón macho adulto con una inyección ip de una mezcla de 10 mg / kg de xilazina y 200 mg / kg de clorhidrato de ketamina.
2. Afeitar el área de más de vena yugular externa derecha y la cara anterior del escroto con una maquinilla de afeitar eléctrica. Después de la anestesia, es importante prestar especial atención y cuidado para el ratón anestesiado. Una lámpara de calor se puede utilizar para evitar que el ratón de la hipotermia. El ratón debe estar libre de dolor reflejo.
3. Se practica una incisión horizontal, encontrar y cateterizar la vena yugular con una tubería de PE-10 lleno de solución salina con heparina 100 U / mL. La cateterización de la vena yugular que se necesita para la administración de anestésicos y medicamentos adicionales cuando sea necesario.
4. Fijar las patas traseras del ratón con una cinta umbilical con el ratón boca arriba sobre una placa de fabricación casera músculo cremáster (Figura 1).
5. Conecte la tarjeta a un 37 ° C de recirculación de agua para mantener el músculo cremáster y el cuerpo del ratón caliente.

Nota: Todos los procedimientos de 2,6 a 2,14 se debe realizar con mucho cuidado ^5.

6. Hacer una incisión en la piel del escroto para exponer el músculo cremáster izquierda. Diseccionar cuidadosamente el músculo de la fascia asociada.
7. Superfuse el músculo cremáster con 37 ° C, calentado bicarbonato de solución salina tamponada (131,9 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO _4, 20 NaHCO _3, en mM, pH 7,4) usando una bomba peristáltica.
8. Atar una sutura 4-0 al extremo distal del músculo cremáster que se mantenga en el pedestal de visualización de cristal transparente de la junta directiva del músculo cremáster.
9. Cauterizar el músculo cremáster longitudinalmente. Con sutura 4-0, mantenga el plano muscular y seguro que a lo largo de los bordes en el pedestal. Separar el testículo y el epidídimo del músculo subyacente y los trasladan a la cavidad abdominal.
10. Superfuse el músculo en 22 ~ 0,6 ml / min con el tampón de 37 ° C-perfusión caliente y cubrir el músculo expuesto con un 22 × cubreobjetos mm.
11. Coloque la tarjeta de músculo cremáster en la platina del microscopio, examina el músculo bajo el microscopio, encontrar una vénula adecuado postcapilares (Seleccione la vénula que es recto y no ramificado y tiene una tasa de corte normal y un diámetro de 25-40 micras) y ajustar la cámara de vídeo para permitir la vénula para ser visualizados en una posición vertical en los extremos izquierdo o derecho de la pantalla del televisor.
12. Después de equilibrio de 30 min, grabar las imágenes de vídeo de la vénula seleccionado postcapilares durante 5 minutos como datos de referencia utilizando una grabadora de video.
13. Detener la superfusión y quitar el cubreobjetos sobre el músculo.
14. Un lugar ~ ^1-3 mm de tamaño quimioatrayente que contienen gel en la superficie del músculo cremáster en un área preseleccionada 350 micras y paralelo a la vénula postcapilares observado, añadir cubreobjetos para mantener el gel en su lugar y superfuse el tejido muscular en un momento muy ritmo lento (≤ 10 l / min) para permitir el establecimiento de un gradiente de quimioatrayente que se libera lentamente y formado a partir del gel.
15. Grabar la imagen de vídeo de 90 minutos después de la adición del gel que contiene chemoattractant. Durante la grabación, ajustar y mantener el enfoque en el microscopio de la adhesión, gatear, transmigración y chemotaxing leucocitos en el interior de la vénula y en el tejido muscular.
16. Después del experimento, importar el archivo de vídeo a un ordenador para su análisis.

3. Celular seguimiento mediante ImageJ

1. En un equipo, extraer y convertir el vídeo a formato AVI (por ejemplo, el uso de software libre bitRipper equipo para convertir el vídeo de DVD a formato AVI).
2. Utilice el software de edición de vídeo para generar la película el tiempo transcurrido. Por ejemplo, utilizar Windows Movie Maker para hacer una película de tiempo transcurrido (a 1 / 512 o 1 / 1024 de lapso de tiempo unt 30 fps velocidad) de la original, vídeo en tiempo real. Convertir y guardar el tiempo transcurrido sin comprimir películas a formato DV-AVI.
3. Grabar las imágenes del micrómetro de calibración en el ajuste mismo microscopio, importar imágenes a la computadora, abrir las imágenes con ImageJ. En ImageJ, el total de píxeles aparecen en la parte superior izquierda de la pantalla (por ejemplo, 720 × 480 píxeles). Medir el tamaño de la pantalla en ambos ejes X e Y (por ejemplo, 200 x 150 mm). De esto, calcular el número de píxeles por micras (por ejemplo, x = 720/200 = 3,6 píxeles / m, y = 480/150 = 3,2 píxeles / mm).
4. Para importar la película, abre ImageJ nuevo, haga clic en "Archivo-Importar-Uso de películas de QuickTime Plug-in", seleccionar la película a analizar y haga clic en "OK" en la interfaz de "Abridor de la película de QT".
5. Haga clic en "Plugins-Manual de seguimiento" para rastrear las células. Llene la información relevante en los campos de la base antes de comenzar el seguimiento. En pocas palabras,
   1. Intervalo de tiempo (en segundos) = fold-time-lapse/30 (Por ejemplo, un 1020 × lapso de tiempo sería 1020/30 = 34 seg / marco de intervalo).
   2. x / y calibración de la medición = m / pixel con la calibración de la imagen del micrómetro.
   3. z de calibración = 0 (ya que el músculo cremáster de ratón es una capa muy delgada de arrastre de tejidos y células y la migración son aproximadamente 2D en campo brillante transiluminación).
   4. Buscar tamaño cuadrados para centrar = 1.
   5. Tamaño de punto / Ancho de línea / Tamaño de fuente: se puede ajustar si es necesario.
6. Seleccione un punto estable y claro como punto de referencia. Este punto de referencia puede ser cualquier punto estructural claro y pequeño que se mantiene sin cambios y estables a lo largo de todo el experimento. Haga clic en "Añadir pista" para realizar el seguimiento del punto de referencia desde el primero hasta el último fotograma y haga clic en "Track End". Los datos aparecen en la tabla de resultados de forma automática.
7. Seguimiento de rastreo y la migración de neutrófilos, uno por uno: haga clic en "Añadir pista" para hacer un seguimiento de la célula desde su aparición en el tejido a su desaparición en cada fotograma y haga clic en "Track End" para finalizar y guardar los resultados en Microsoft Excel.

4. Análisis de los parámetros de reclutamiento de neutrófilos

1. Abra el archivo de resultados en Microsoft Excel, y analizar los datos (toma los cambios de punto de referencia en el análisis).
2. Gatear intraluminal
   1. Rastreo distancia: la distancia total de la célula se arrastra en el lumen del sitio adherentes iniciales a la transmigración sitio óptimo (m).
   2. Rastreo de velocidad: el rastreo a distancia / tiempo (m / min).
3. Migración transendotelial
   1. Tiempo de la transmigración: desde el momento en la célula comienza a transmigrar a través del endotelio a la época en que el cuerpo de célula entera está a las afueras de la vénula y no del cuerpo celular puede ser observado en la luz (minutos o segundos).
   2. Tiempo de separación: desde el momento en que el cuerpo de célula entera está a las afueras de la vénula (inmediatamente después de la transmigración) hasta el punto de tiempo cuando la célula pierde el contacto con la vénula (se retrae la cola) (min o seg).
4. Quimiotaxis en el tejido
   1. La distancia de migración: la suma de la distancia de la celda se mueve desde el punto de inicio hasta el punto final de la migración en el tejido (m).
   2. La velocidad de la migración: la migración en el tejido de distancia / tiempo (m / min).
   3. Distancia de la quimiotaxis: la suma de la distancia de la célula migra en el eje x en el tejido (m).
   4. La velocidad de la quimiotaxis: quimiotaxis de distancia / tiempo (m / min).
   5. Quimiotaxis índice: el coeficiente de dividir la distancia de la quimiotaxis de la distancia de migración en el tejido.

5. Los resultados representativos:

Aunque bightfield microscopía intravital se utiliza para el estudio de las interacciones leucocito-endotelial y pueden no ser necesariamente de los neutrófilos, que confirmó que, por nuestros estudios de histología, más del 95% de las células reclutadas en los neutrófilos tratados quimioatrayente los músculos cremáster eran de hecho los neutrófilos . En este informe, el uso selectivo de neutrófilos quimiotácticos, se presentan los procedimientos de seguimiento del reclutamiento de neutrófilos en vivo. En concreto, se describe un protocolo de seguimiento de rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial, y la quimiotaxis en el tejido músculo cremáster en ratones anestesiados utilizando time-lapse video microscopía intravital y ImageJ. El gel de agarosa que contienen chemoattractant en el músculo cremáster libera lentamente quimioatrayente y permite un gradiente quimiotáctico que se establezca en el tejido. Quimiotáctica de neutrófilos induce neutrófilos interacciones célula endotelial en cremastérico vénulas post-capilares en ratones. El experimento se visualiza con un microscopio de campo claro en posición vertical intravital con imágenes de video proyectadas por una cámara de vídeo en color de un monitor de televisión y grabado por una grabadora de vídeo. Se determinó el recuento de neutrófilosgatear intraluminal, la migración y la migración transendotelial y la quimiotaxis en el tejido muscular en respuesta a los neutrófilos chemoattractant MIP-2 y WKYMVm preparados en gel de agarosa (Figura 2). Se encontró que el MIP-2 (a 0,5 M) y WKYMVm (a 0,1 mM) provocó el rastreo intraluminal de neutrófilos a una velocidad similar, la migración de neutrófilos transendotelial y el desprendimiento de la vénula para la longitud de tiempo comparable de la migración de neutrófilos y quimiotaxis en el tejido muscular a casi la misma velocidad y con similares índices de quimiotaxis de neutrófilos (P> 0,05, prueba t de Student).

Figura 1. La representación esquemática de un sistema de microscopía intravital. El músculo cremáster de ratón se exterioriza en el pedestal de una visión clara de la junta del músculo cremáster en platina del microscopio y superfused con 37 ° C, calentado bicarbonato de solución salina tamponada. El microscopio vertical se conecta con una cámara de vídeo CCD color de campo claro microscopía intravital. Un blanco y negro profundo enfriado cámara CCD digital también está conectado al puerto de microscopio de fluorescencia microscopia intravital, las imágenes de las cuales están directamente procesados ​​por un ordenador.

Figura 2. Neutrófilos parámetros de contratación de la microscopía de campo claro intravital. El reclutamiento de neutrófilos fue inducida por la liberación gradual de quimioatrayente de neutrófilos MIP-2 o WKYMVm en la preparación de un gel de agarosa 350 micras colocado junto a la vénula postcapilares. El tiempo transcurrido de datos de vídeo fueron analizados por ImageJ después de procesar la grabación de vídeo en tiempo real del experimento. Rastreo de neutrófilos intraluminal (A), el tiempo de la transmigración y el tiempo de separación (B), la velocidad de la migración y la velocidad de la quimiotaxis de los tejidos (C), y el índice de quimiotaxis en el músculo cremáster (D) se determinaron después de la administración de MIP-2 o WKYMVm en gel de agarosa en cremáster muscular en ratones C57BL / 6 (n = 3, N º de células seguimiento = 22 (en A y B) y 27 (en C y D), respectivamente, para MIP-2, y 26 = (en A y B) y 44 ( en C y D), respectivamente, para WKYMVm).

Microscopia intravital es la herramienta esencial para revelar los mecanismos celulares y moleculares de reclutamiento de leucocitos durante la inflamación. Visualización para la determinación cuantitativa de las interacciones leucocito-endotelial en la microvasculatura de los tejidos translúcidos como el músculo cremáster y mesenterio sigue siendo el estándar de oro para la aplicación de la técnica de ^1,5. La microscopía de campo claro intravital convencional tiene muchas características técnicas únicas y los mecanismos de contratación se revela en estos tejidos son aplicables a la mayoría de los tejidos in vivo ^1,2,6. Sin embargo, los mecanismos de reclutamiento de leucocitos en algunos otros tejidos como los pulmones, el hígado y el cerebro se han encontrado muy diferentes de las que revelan en el músculo cremáster y mesenterio ^1. Además, la microscopía de fluorescencia se ha utilizado en algunos tejidos menos transparente.

En comparación con la microscopía de fluorescencia basada en que es conocida por el daño solar a las funciones de las células vivas, campo claro microscopía intravital es más fisiológica y menos dañinas para las células y tejidos (por lo tanto, con menos artefactos), cuando desde hace mucho tiempo de imágenes para la observación de los comportamientos dinámicos celular animales vivos es necesario ^7. También es más conveniente, menos costoso y no es necesario el etiquetado fluorescente. Por otro lado, con las imágenes de microscopía intravital transiluminación, rastrear el movimiento celular automático es imposible con el software de imágenes disponibles en la actualidad en el mercado comercial. Sin embargo, es muy fácil de configurar una fluorescencia intravital sistema de imágenes (por ejemplo, mediante la proyección de las imágenes de fluorescencia cámara CCD y equipo) en el microscopio de campo claro intravital mismo (Figura 1). Esto proporciona la conveniencia de cambiar de microscopía de campo claro y las imágenes de fluorescencia en la preparación de la muestra misma en un solo experimento. Esto también hace posible el seguimiento de forma automática el movimiento de las células marcados con fluorescencia bajo microscopio de fluorescencia intravital cuando el contraste entre la intensidad de fluorescencia de células marcadas y el fondo es lo suficientemente grande y adecuado software de imágenes está instalado en el ordenador.

Como se muestra aquí, en nuestra presentación, nos demuestran el valor de esta técnica in vivo para la observación directa de todo el proceso de reclutamiento de neutrófilos y para la determinación de las funciones de las células y las moléculas en cada etapa de reclutamiento. Con quimioatrayente contenida en la preparación de gel de agarosa y se mantiene en el tejido, un gradiente quimiotáctico unidireccional se puede establecer en el tejido que induce respuestas parecidas a las de reclutamiento de leucocitos que ocurre naturalmente durante la inflamación local de ^8,9. El movimiento direccional de leucocitos de vénulas postcapilares hacia la fuente de chemoattractant puede ser claramente visualizada por microscopía de campo claro intravital y la fotografía de vídeo. Con el procesamiento de vídeo time-lapse, el movimiento celular puede ser rastreado por ImageJ y una serie de parámetros altamente reproducibles se puede medir. Con ratones transgénicos específicos, los inhibidores selectivos y quimiotácticos, el sistema de análisis nos ayuda a revelar las funciones de las proteínas específicas en el reclutamiento de leucocitos. Por ejemplo, esta técnica nos ha ayudado a identificar el papel de LSP1 en las células endoteliales como el portero en la regulación de la migración de neutrófilos transendotelial ^10, el papel de Mac-1 (αMβ2 integrina) en el rastreo intraluminal de neutrófilos, un paso esencial para la migración transendotelial óptima ^3, y el papel de PI3Kγ en la quimiotaxis de neutrófilos en el tejido ^11.