Spårning neutrofila intraluminal Krypande, Transendothelial migration och kemotaxi i vävnad genom Intravital Video Mikroskopi

1. Beredning av Chemoattractant i agarosgel

1. Pipettera 10 ml av 2 × PBS i en 50 ml E-rör och värma upp röret genom att sätta den i en bägare med hett vatten.
2. Pipettera 10 ml destillerat vatten och tillsätt 0,4 g agaros pulver i en annan 50 ml E-rör (med locket lite lösa) och hetta upp blandningen tills bara kokning i en mikrovågsugn (för ~ 1 min i en 700-watts mikrovågsugn) .
3. Lägg till det uppvärmda 2 × PBS till agaroslösningen rör, snurra blandade lösningen och hålla det varmt i hett vatten bägaren.
4. Mikropipett chemoattractant lösning (t.ex. 10 ìl av 0,5 mikrogram av CXC kemokinreceptorantagonist MIP-2 eller 12 l 1 mm WKYMVm) i locket på en 1,5-ml Eppendorf-rör som innehåller 3 l tusch och blanda väl genom aspiration med hjälp av en mikropipett (undvik luftbubbla).
5. Klipp spetsen slutet av en 200-l pipettspetsen och mikropipett 110 ìl agaroslösningen (42 ° C) i locket och omedelbart blanda väl med en annan pipettspetsen (undvik luftbubbla).
6. Förvara chemoattractant gelen vid +4 ° C.

2. Beredning av Cremaster Muscle för Intravital mikroskopi (figur 1)

1. Bedöva en vuxen man musen genom en ip injektion av en blandning av 10 mg / kg xylazin och 200 mg / kg ketamin hydroklorid.
2. Raka området ovanför högra yttre halsvenen och den främre delen av pungen med en elektrisk rakapparat. Efter narkos är det viktigt att ge särskild uppmärksamhet och omsorg till sövd musen. En värmelampa kan användas för att hindra musen från hypotermi. Musen ska vara fri från smärta reflex.
3. Gör ett horisontellt snitt, hitta och ANVÄNDA KATETER stora halsvenen med hjälp av en PE-10 slangar fyllda med 100 E / ml heparin saltlösning. Kateterisering av halspulsådern behövs för tillförsel av ytterligare anestetika och läkemedel vid behov.
4. Fix mus bakbenen med navelsträngen tejp med musen ligger med framsidan upp på en hemlagad cremaster muskel styrelse (Figur 1).
5. Ansluta kortet till en 37 ° C vatten cirkulationspumpen för att hålla cremaster muskler och mus kroppen varm.

Notera: Alla förfaranden från 2,6 till 2,14 måste utföras mycket försiktigt ^5.

6. Gör ett snitt i scrotal huden att exponera vänster cremaster muskeln. Försiktigt dissekera muskler från den tillhörande fascia.
7. Superfuse den cremaster muskeln med 37 ° C värms bikarbonat-saltlösning (131,9 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO _4, 20 NaHCO _3, i mm, pH 7,4) med en peristaltiska pumpar.
8. Knyt en 4-0 sutur till den distala änden av cremaster muskler för att hålla ner den på tydlig visning glas piedestal av cremaster muskeln styrelsen.
9. Bränna den cremaster muskeln longitudinellt. Med 4-0 sutur, håll muskeln platt och fäst den längs kanterna på piedestalen. Separata testikeln och bitestikeln från underliggande muskler och flytta dem i bukhålan.
10. Superfuse muskeln på ~ 0,6 ml / min med 37 ° C värms perfusion buffert och täcka den exponerade muskeln med en 22 × 22 mm glas täckglas.
11. Placera cremaster muskeln ombord på mikroskop scenen, undersöka muskeln under mikroskop, finna en lämplig postcapillary venule (Välj venule som är rak och ogrenad och har normal skjuvhastighet och en diameter på 25-40 mikrometer) och justera videokameran att låta venule att visualiseras i vertikalt läge på antingen vänster eller höger på TV-skärmen.
12. Efter 30 minuter är jämvikt, spela in videobilder på den valda postcapillary venule i 5 min som basuppgifter kontroll med hjälp av en videobandspelare.
13. Stoppa superfusion och ta bort täckglas på muskeln.
14. Placera en ~ 1-mm ³ stora chemoattractant innehåller gel på ytan av cremaster muskeln i en förvald område 350 ìm från och parallellt med de observerade postcapillary venule, lägga täckglas för att hålla gelen på plats och superfuse muskelvävnaden på en mycket långsam takt (≤ 10 ml / min) för att möjliggöra upprättandet av en gradient av chemoattractant som långsamt frigörs och bildas från gelen.
15. Spela in videobilden i 90 minuter efter tillsats av chemoattractant gelen. Under inspelningen, justera och hålla mikroskopet fokus på det fastsittande, krypa, transmigrating och chemotaxing leukocyter inuti venule och i muskelvävnaden.
16. Efter experimentet, importera videofilen till en dator för analys.

3. Cell Tracking Använda ImageJ

1. På en dator, extrahera och konvertera video till AVI-format (t ex använda gratis bitRipper datorprogram för att konvertera DVD-video till AVI-fil).
2. Använd videoredigering programvara för att generera den tiden löpt ut film. Använd till exempel Windows Movie Maker för att göra en tid förfallit film (till 1 / 512 eller 1 / 1024 tidsförlopp enT 30-fps rate) från den ursprungliga, i realtid video. Konvertera och spara okomprimerade tid förfallit film till DV-AVI-format.
3. Spela in bilder av kalibreringen mikrometer under samma mikroskop inställningen importera bilder till datorn, öppna bilder med ImageJ. I ImageJ den totala pixlar visas högst upp till vänster på skärmen (t.ex. 720 × 480 pixlar). Mät storleken på skärmen i både X och Y-axeln (t.ex. 200 × 150 mikrometer). Från denna, beräkna antalet pixlar per ìm (t.ex. x = 720 / 200 = 3,6 pixlar / ìm, och y = 480 / 150 = 3,2 pixlar / mikrometer).
4. För att importera filmen, öppna ImageJ igen klickar du på "File-Import-Med Quicktime-filmer Plug-in", välja film som ska analyseras och klicka "OK" i gränssnittet för "QT Movie öppnare".
5. Klicka på "plugins-Manuell spårning" för att spåra celler. Fyll i uppgifterna i fälten längst ner innan du börja spåra. Kortfattat,
   1. Tidsintervall (i sek) = fold-time-lapse/30 (Till exempel, en 1020 × tidsförlopp skulle vara från 1020 till 1030 = 34 sek / ram intervall).
   2. x / y kalibrering = det ìm / pixel mätning med kalibrering av bilden av mikrometer.
   3. z kalibrering = 0 (som musen cremaster muskeln är ett extremt tunt lager av vävnader och celler krypa och migration är ungefär 2D i starkt fält genomlysning).
   4. Sök kvadrat storlek för centrering = 1.
   5. Dot storlek / Linjebredd / Teckenstorlek: kan de justeras vid behov.
6. Välj en stabil och tydlig punkt som en referenspunkt. Denna referenspunkt kan vara något tydligt och små strukturella punkt som förblir oförändrad och stabil under hela experimentet. Klicka på "Lägg till spår" för att spåra referenspunkten från den första till den sista bilden och klicka på "Avsluta Track". Uppgifterna visas på resultattabellen automatiskt.
7. Spåra krypande och vandrar neutrofiler en efter en: Klicka på "Lägg till spår" för att spåra cellen från dess utseende i vävnaden till dess försvinnande i varje bildruta och klicka på "End Track" för att avsluta och spara resultatet i Microsoft Excel.

4. Analys av neutrofila Rekrytering Parametrar

1. Öppna resultaten filen i Microsoft Excel och analysera data (ta förändringarna i referenspunkt i analysen).
2. Intraluminal krypande
   1. Krypa avstånd: den totala sträckan cellen kryper i lumen från den första fastsittande webbplatsen för att den optimala själavandring plats (mikrometer).
   2. Krypa hastighet: krypa avstånd / tid (ìm / min).
3. Transendothelial migration
   1. Transmigration tid: från det att cellen börjar transmigrate över endotelet till den tid då hela cellkroppen är precis utanför venule och ingen cellkroppen kan ses i lumen (min eller sek).
   2. Detachment tid: från det hela cellkroppen ligger strax utanför venule (direkt efter själavandring) till den tidpunkt då cellen förlorar kontakten med venule (svansen inåt) (min eller sek).
4. Chemotaxis i vävnaden
   1. Migration avstånd: summan av avståndet cellen rör sig från startpunkten till slutpunkten av migrationen i vävnaden (mikrometer).
   2. Velocity av migration: migration avståndet i vävnaden / tid (Öm / min).
   3. Chemotaxis avstånd: summan av avståndet cellen vandrar i x-axeln i vävnad (mikrometer).
   4. Hastighet av kemotaxi: chemotaxis avstånd / tid (ìm / min).
   5. Chemotaxis index: förhållandet dividera chemotaxis avstånd genom migrationen avståndet i vävnad.

5. Representativa resultat:

Även bightfield intravital mikroskopi används för studier av leukocyt-endotel interaktioner och kanske inte nödvändigtvis för neutrofiler, bekräftade vi att, genom vår histologi studier var mer än 95% av de rekryterade celler i neutrofila chemoattractant behandlade cremaster muskler verkligen neutrofiler . I denna rapport, med hjälp av neutrofil-selektiva chemoattractants presenterar vi förfaranden spåra rekryteringen av neutrofiler in vivo. Konkret beskriver vi ett protokoll med att spåra neutrofila intraluminal krypa, transendothelial migration och kemotaxi i cremaster muskelvävnaden i sövda möss med tidsförlopp intravital video mikroskopi och ImageJ. Den chemoattractant innehåller agarosgel på cremaster muskeln släpper långsamt chemoattractant och gör en chemoattractant lutning som skall fastställas i vävnad. Neutrofila chemoattractant inducerar neutrofil mot endotel interaktioner i cremasteric postcapillary venoler hos möss. Hela experimentet är visualiseras i en upprätt brightfield intravital mikroskop med videobilder projiceras av en färg videokamera till en TV-skärm och registreras av en videobandspelare. Vi bestämde neutrofilaintraluminal krypande, transendothelial migration och migration och kemotaxi i muskelvävnad som svar på neutrofila chemoattractant MIP-2 och WKYMVm upprättats i agarosgelen (figur 2). Vi fann att MIP-2 (vid 0,5 M) och WKYMVm (vid 0,1 mM) framkallade neutrofila intraluminal krypande på samma hastighet, neutrofila transendothelial migration och avskildhet från venule för jämförbara tid, neutrofil migration och kemotaxi i muskelvävnaden i nästan samma hastighet och med liknande neutrofil chemotaxis index (p> 0,05, Student t-test).

Figur 1. Schematisk illustration av en intravital mikroskop system. Musen cremaster muskel är exteriorized på tydlig visning piedestal av cremaster muskler ombord på mikroskop scenen och superfused med 37 ° C värms bikarbonatbuffert saltlösning. Upprätt mikroskop är ansluten med en CCD färg videokamera för brightfield intravital mikroskopi. En monokrom djupt kyls CCD digitalkamera också är kopplad till mikroskop port för fluorescens intravital mikroskopi, varifrån bilderna direkt behandlas av en dator.

Figur 2. Neutrofila rekrytering parametrarna brightfield intravital mikroskopi. Neutrofila rekryteringen var en följd av den gradvisa frisättning av neutrofila chemoattractant MIP-2 eller WKYMVm i agarosgelen preparatet placeras 350 ìm anslutning till postcapillary venule. Time-förfallit video analyserades med ImageJ efter bearbetning den verkliga inspelningstiden video av experimentet. Neutrofila intraluminal krypa (A), själavandring tid och avskildhet tid (B), migration hastighet och kemotaxi hastighet i vävnaden (C), och kemotaxi index i cremaster muskel (D) fastställdes efter administrering av MIP-2 eller WKYMVm agarosgel på cremaster muskel i C57BL / 6 möss (n = 3, # av spårade celler = 22 (i A och B) och 27 (i C och D) respektive för MIP-2, och = 26 (i A och B) och 44 ( i C och D) respektive för WKYMVm).

Intravital mikroskopi är det viktigt verktyg för att avslöja de cellulära och molekylära mekanismer av leukocyt-rekrytering vid inflammation. Kvantitativa visualisering för bestämning av leukocyt-endotel interaktioner i mikrocirkulation av genomskinligt vävnader såsom cremaster muskler och tarmkäx kvar guldmyntfoten för tillämpning av tekniken ^1,5. Den konventionella brightfield intravital mikroskopi har många unika tekniska egenskaper och rekrytering mekanismer som avslöjas i dessa vävnader är tillämpliga på de flesta vävnader in vivo ^1,2,6. Däremot har de mekanismer av leukocyter rekrytering i några andra vävnader såsom lunga, lever och hjärna funnits ganska olika de uppenbarades i cremaster muskler och tarmkäx ^1. Dessutom har fluorescensmikroskopi att användas i något mindre transparenta vävnader.

Jämfört med fluorescens-baserade mikroskopi som är känd för fotoskador till funktioner i levande celler, är brightfield intravital mikroskopi mer fysiologiska och mindre skadligt för celler och vävnader (därmed med mindre artefakter) när länge bildhantering för att observera dynamiska cellulära beteenden i levande djur är nödvändig ^7. Det är också mer praktiskt, mindre kostsam och ingen fluorescerande märkning behövs. Å andra sidan, med genomlysning imaging i intravital mikroskopi, automatisk spårning cellulär rörelse omöjligt med tillgängliga kommersiella bildbehandlingsprogram på marknaden. Men det är väldigt lätt att ställa in ett separat fluorescens intravital Imaging System (t.ex. genom att projicera bilderna till en fluorescens CCD-kamera och dator) på samma brightfield intravital mikroskop (Figur 1). Detta kan du enkelt växla mellan brightfield mikroskopi och fluorescens avbildning på samma provberedning i ett enda experiment. Detta gör det också möjligt att automatiskt spåra flödet av fluorescerande celler under fluorescens intravital mikroskopi när kontrasten mellan fluorescensintensiteten av märkta celler och bakgrunden är tillräckligt stor och lämplig bildbehandlingsprogram installerat på datorn.

Som skildras här i vår presentation visar vi värdet av detta in vivo teknik för direkt observation av hela processen för neutrofila rekrytering och för fastställande av de funktioner av celler och molekyler i varje rekrytering steg. Med chemoattractant i agarosgel förberedelse och höll på vävnaden, kan en enkelriktad kemotaxi gradient vara etablerad i den vävnad som inducerar leukocyt rekrytering svar som liknar de som förekommer naturligt under lokal inflammation ^8,9. Den riktade leukocyt rörelse från postcapillary venule mot källan chemoattractant klart kan visualiseras genom brightfield intravital mikroskopi och video fotografi. Med time-lapse video bearbetning, kan cellen rörelse spåras av ImageJ och en serie av mycket reproducerbar parametrar kan mätas. Med specifika transgena möss, hämmare och selektiv chemoattractants, hjälper analyssystem för oss att avslöja funktioner av specifika proteiner i leukocyt rekrytering. Till exempel denna teknik hjälpt oss att identifiera den roll LSP1 i endotelceller som portvakt i regleringen av neutrofila transendothelial migration ^10, rollen för Mac-1 (αMβ2 integrin) i neutrofila intraluminal krypande, ett viktigt steg för optimal transendothelial migration ^3, och den roll PI3Kγ i neutrofila chemotaxis i vävnad ^11.