Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

1. Préparation de Chemoattractant en gel d'agarose

1. Pipeter 10 mL de 2 × PBS dans un tube conique de 50 ml, et de se réchauffer le tube en le plaçant dans un bécher contenant de l'eau chaude.
2. Pipeter 10 mL d'eau distillée et ajouter 0,4 g de poudre d'agarose dans un autre tube conique de 50 ml (avec son bouchon légèrement desserré) et chauffer le mélange jusqu'à ce que d'ébullition dans un four à micro-ondes (pour ~ 1 min dans un four à micro-ondes de 700 watts) .
3. Ajouter le réchauffé 2 × PBS à la solution d'agarose du tube, agiter la solution mixte et garder au chaud dans le bécher d'eau chaude.
4. Solution chimioattractive Micropipette (par exemple, 10 ul de 0,5 ug d'chimiokines CXC MIP-2 ou de 12 pi de 1 WKYMVm mM) dans le couvercle d'un tube de 1,5 ml Eppendorf contenant d'encre 3 ul Inde et bien mélanger par aspiration à l'aide d'une micropipette (éviter bulle d'air).
5. Coupez l'extrémité pointe d'un cône de pipette 200 ul et micropipette 110 pi d'agarose solution (42 ° C) dans le couvercle et bien mélanger immédiatement en utilisant une autre extrémité de la pipette (éviter bulle d'air).
6. Stocker le gel de chimioattractive contenant à +4 ° C.

2. Préparation du crémaster pour la microscopie intravitale (figure 1)

1. Anesthetize une souris adulte mâle par une injection ip d'un mélange de 10 mg / kg de xylazine et de 200 mg / kg de chlorhydrate de kétamine.
2. Rasez la zone devant le pied droit veine jugulaire externe et la face antérieure du scrotum avec un rasoir électrique. Après l'anesthésie, il est important d'accorder une attention spéciale et de soins à la souris anesthésiée. Une lampe de chaleur peut être utilisée pour empêcher la souris de l'hypothermie. La souris doit être exempt de réflexes douleur.
3. Faire une incision horizontale, trouver et cathétériser la veine jugulaire en utilisant un tube PE-10 rempli de 100 salines héparine U / ml. Cathétérisme de la veine jugulaire est nécessaire pour l'administration d'anesthésiques et de médicaments supplémentaires si nécessaire.
4. Fixer les jambes arrières de souris avec du ruban ombilical avec la souris à plat ventre sur une planche faite maison crémaster (figure 1).
5. Branchez le conseil d'administration à un circulateur d'eau à 37 ° C pour garder le muscle crémaster et le corps de la souris chaude.

Remarque: Toutes les procédures de 2,6 à 2,14 doit être réalisée très doucement ^5.

6. Faire une incision dans la peau du scrotum pour exposer le muscle crémaster gauche. Soigneusement disséquer le muscle du fascia associé.
7. Superfuse crémaster à 37 ° C-réchauffé bicarbonate de solution saline tamponnée (131,9 NaCl, KCl 4,7, 1,2 MgSO _4, 20 NaHCO _3, en mM, pH 7,4) en utilisant une pompe péristaltique.
8. Attachez un fil de suture 4-0 face à l'extrémité distale du muscle crémaster pour le maintenir vers le bas sur le piédestal de verre visionnement clair du conseil crémaster.
9. Cautériser le crémaster longitudinalement. Avec de suture 4-0, tenir le plat de muscle et le fixer sur les bords sur le piédestal. Séparez le testicule et l'épididyme du muscle sous-jacent et les déplacer dans la cavité abdominale.
10. Superfuse le muscle à ~ 0,6 ml / min avec le tampon de 37 ° C-perfusion réchauffés et couvrir les muscles exposés avec un 22 × 22 mm lamelle de verre.
11. Placez le plateau crémaster sur la platine du microscope, examiner le muscle sous le microscope, de trouver une veinule adaptée postcapillaires (Sélectionnez la veinule qui est droit et non ramifié et a un taux de cisaillement normal et un diamètre de 25 à 40 um) et ajuster la caméra vidéo pour permettre à la veinule pour être visualisées dans une position verticale à chaque extrémité gauche ou à droite de l'écran de télévision.
12. Après 30 min de l'équilibre, d'enregistrer les images vidéo de la veinule sélectionnés postcapillaires pendant 5 min comme données de contrôle de base à l'aide d'un enregistreur vidéo.
13. Arrêter la surfusion et enlever la lamelle sur le muscle.
14. Placez une ~ ^1-3 mm de taille chimiotactique-contenant du gel sur la surface du muscle crémaster dans une zone de 350 um d'présélectionnés et parallèle à la veinule observés postcapillaires, ajouter la lamelle de tenir le gel en place et superfuse le tissu musculaire à un niveau très rythme lent (≤ 10 pl / min) pour permettre l'établissement d'un gradient de chimiotactique qui est libérée lentement et formé à partir du gel.
15. Enregistrement de l'image vidéo pendant 90 min après l'addition du gel contenant chimiotactique. Pendant l'enregistrement, ajuster et garder le focus sur le microscope à adhérer, en rampant, et transmigrant chemotaxing leucocytes à l'intérieur de la veinule et dans le tissu musculaire.
16. Après l'expérience, importer le fichier vidéo sur un ordinateur pour analyse.

3. Suivi cellule à l'aide ImageJ

1. Sur un ordinateur, d'extraire et de convertir la vidéo au format AVI (par exemple, l'utilisation gratuite bitRipper logiciel pour convertir des DVD vidéo en fichier AVI).
2. Utilisez un logiciel de montage vidéo pour générer le film du temps écoulé. Par exemple, utiliser Windows Movie Maker pour faire un film du temps écoulé (à 1 / 512 ou 1 / 1024 time-lapse unet de 30 fps taux) de l'original, vidéo en temps réel. Convertissez et enregistrez le temps écoulé décompressé film pour le format DV-AVI.
3. Enregistrer les images de calibration du micromètre dans le cadre même microscope, importer des images à l'ordinateur, ouvrez les images avec ImageJ. En ImageJ, le nombre total de pixels apparaissent sur la partie supérieure gauche de l'écran (par exemple, 720 × 480 pixels). Mesurer la taille de l'écran à deux axes X et Y (par exemple, 200 × 150 um). De cela, calculer le nombre de pixels par um (par exemple, x = 720/200 = 3,6 pixels / um, et y = 480/150 = 3,2 pixels / um).
4. Pour importer le film, ouvrez ImageJ nouveau, cliquez sur «File-Import-Utiliser des films QuickTime Plug-in", sélectionnez le film à analyser et cliquez sur "OK" à l'interface de "Opener film QT".
5. Cliquez sur "Plugins-Manuel de suivi" pour suivre les cellules. Remplissez les informations pertinentes dans les champs au fond avant de suivi début. En bref,
   1. L'intervalle de temps (en secondes) = fold-time-lapse/30 (Par exemple, une 1020 × time-lapse serait de 1020 à 1030 = 34 sec / frame interval).
   2. X / Y = étalonnage de la mesure um / pixel en utilisant l'étalonnage de l'image du micromètre.
   3. z = 0 de calibration (comme le muscle de souris crémaster est une couche extrêmement mince de ramper tissus et de cellules et de migration sont environ 2D sous champ lumineux transillumination).
   4. Recherche de taille carrée pour le centrage = 1.
   5. Dot taille / Ligne largeur / Taille de police: ils peuvent être ajustés si nécessaire.
6. Sélectionnez un point stable et clair comme point de référence. Ce point de référence peut être n'importe quel point claire et petite structure qui reste inchangé et stable tout au long de l'expérience tout entière. Cliquez sur "Ajouter une Piste" pour suivre le point de référence de la première à la dernière image et cliquez sur "Track End". Les données apparaissent sur le tableau des résultats automatiquement.
7. Suivre la migration des neutrophiles rampants et un par un: cliquez sur "Ajouter une Piste" pour suivre la cellule de son apparence dans le tissu à sa disparition dans chaque image et cliquez sur "Track Fin" pour terminer et enregistrer les résultats dans Microsoft Excel.

4. Analyse des paramètres de recrutement des neutrophiles

1. Ouvrez le fichier de résultats dans Microsoft Excel, et analyser les données (prendre les changements de point de référence dans l'analyse).
2. Ramper intraluminale
   1. Crawling distance: la distance totale de la cellule se traîne dans la lumière à partir du site initial adhérente au site de transmigration optimale (um).
   2. Crawling vitesse: ramper distance / temps (um / min).
3. Migration trans
   1. Temps de la Transmigration: à partir du moment de la cellule commence à transmigrer à travers l'endothélium au moment où le corps de la cellule entière est juste en dehors de la veinule et aucun corps cellulaire peut être vu dans la lumière (min ou sec).
   2. Détachement du temps: à partir du moment du corps cellulaire entier est juste à l'extérieur de la veinule (immédiatement après la transmigration) au point dans le temps lorsque la cellule perd le contact avec la veinule (la queue se rétracte) (min ou sec).
4. Chimiotactisme dans le tissu
   1. Distance de migration: la somme de la distance de la cellule se déplace du point de départ au point final de la migration dans les tissus (um).
   2. Vitesse de migration: la distance de migration dans les tissus / heure (um / min).
   3. Distance de chimiotactisme: la somme de la distance de la cellule migre dans l'axe x dans le tissu (um).
   4. Vitesse de chimiotactisme: chimiotactisme distance / temps (um / min).
   5. Chimiotactisme indice: le ratio de division de la distance par chimiotactisme la distance de migration dans les tissus.

5. Les résultats représentatifs:

Bien que la microscopie intravitale bightfield est utilisé pour l'étude des interactions leucocytes-endothélium et peuvent ne pas être nécessairement pour les neutrophiles, nous a confirmé que, par nos études histologiques, plus de 95% des cellules neutrophiles recrutés dans les muscles crémaster chimioattractive traités étaient effectivement neutrophiles . Dans ce rapport, l'aide sélective chimiotactiques neutrophiles, nous présentons les procédures de suivi du recrutement des neutrophiles in vivo. Plus précisément, nous décrivons un protocole de suivi de ramper intraluminale neutrophiles, migration trans, et le chimiotactisme dans le tissu musculaire chez des souris anesthésiées crémaster utilisant la microscopie time-lapse vidéo intravitale et ImageJ. Le gel chimioattractive contenant agarose sur le muscle crémaster libère lentement chimioattractant et permet un gradient chimiotactique être établi dans les tissus. Chimiotactique des neutrophiles induit des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium dans les veinules post crémastérien chez la souris. L'expérience entière est visualisée sous un microscope fond clair debout intravitale avec des images vidéo projetées par une caméra vidéo couleur à un écran de télévision et enregistrées par un enregistreur vidéo. Nous avons déterminé les neutrophilesramper intraluminale, migration trans et la migration et le chimiotactisme dans le tissu musculaire en réponse à des neutrophiles chimioattractive MIP-2 et WKYMVm préparé en gel d'agarose (figure 2). Nous avons constaté que MIP-2 (à 0,5 uM) et WKYMVm (à 0,1 mM) a suscité des neutrophiles ramper intraluminale à une vitesse similaire, la migration des neutrophiles transendothéliale et le détachement de la veinule de longueur de temps comparable, la migration des neutrophiles et le chimiotactisme dans le tissu musculaire à peu près au même vitesse et avec des index similaires chimiotactisme des polynucléaires neutrophiles (p> 0,05, test t de Student).

Figure 1. La représentation schématique d'un système de microscope intravitale. Le muscle crémaster la souris est extériorisé sur le piédestal visionnement clair du conseil d'administration crémaster sur scène microscope et perfusées avec 37 ° C-réchauffé bicarbonate de solution saline tamponnée. Le microscope droit est relié à une caméra CCD vidéo couleur pour fond clair intravitale microscopie. Un monochrome profonde refroidi caméra numérique CCD est également connecté au port de microscope pour la microscopie à fluorescence intravitale, les images à partir de laquelle sont directement traitées par un ordinateur.

Figure 2. Paramètres de recrutement de neutrophiles fond clair microscopie intravitale. Recrutement des neutrophiles a été induite par la libération progressive de chimiotactique des neutrophiles MIP-2 ou WKYMVm dans la préparation gel d'agarose placé 350 um adjacent à la veinule postcapillaires. Temps écoulé-données vidéo ont été analysés par ImageJ après traitement à l'enregistrement vidéo en temps réel de l'expérience. Neutrophiles ramper intraluminale (A), le temps de la transmigration et le temps de détachement (B), la vitesse et la vitesse de migration dans les tissus chimiotactisme (C), et l'indice de chimiotactisme dans le muscle crémaster (D) ont été déterminés après l'administration de la MIP-2 ou WKYMVm gel d'agarose sur crémaster chez les souris C57BL / 6 (n = 3, # des cellules suivi = 22 (en A et B) et 27 (en C et D) respectivement pour le MIP-2, et = 26 (en A et B) et 44 ( en C et D) respectivement pour WKYMVm).

Microscopie intravitale est l'outil indispensable pour révéler les mécanismes cellulaires et moléculaires de recrutement des leucocytes pendant l'inflammation. La visualisation quantitative pour la détermination des interactions leucocytes-endothélium dans les microvaisseaux des tissus translucides tels que le muscle crémaster et le mésentère reste le gold standard pour l'application de la technique de ^1,5. La microscopie à fond clair conventionnels intravitale a beaucoup uniques caractéristiques techniques et les mécanismes de recrutement a révélé dans ces tissus sont applicables à la plupart des tissus in vivo ^1,2,6. Cependant, les mécanismes de recrutement des leucocytes dans certains autres tissus tels que le poumon, le foie et le cerveau ont été trouvés assez différente de celles révélées dans le muscle crémaster et le mésentère ^1. De plus, la microscopie par fluorescence doit être utilisé dans certains tissus moins transparent.

Par rapport à la microscopie par fluorescence basée sur ce qui est connu pour photovieillissement aux fonctions des cellules vivantes, fond clair intravitale microscopie est plus physiologique et moins nocifs pour les cellules et les tissus (donc avec moins d'artefacts) lors de longue date d'imagerie pour l'observation des comportements dynamiques cellulaires animaux vivants est nécessaire ^7. Il est également plus pratique, moins coûteux et sans marquage fluorescent est nécessaire. D'autre part, avec l'imagerie en microscopie intravitale transillumination, le mouvement de suivi automatique cellulaires est impossible avec un logiciel d'imagerie actuellement disponibles sur le marché commercial. Cependant, il est très facile à mettre en place une fluorescence intravitale séparées système d'imagerie (par exemple, en projetant les images d'une caméra CCD à fluorescence et de l'ordinateur) sur le microscope fond clair même intravitale (figure 1). Cette offre la commodité de la commutation entre la microscopie fond clair et l'imagerie de fluorescence sur la préparation de l'échantillon même dans une expérience unique. Cela rend également possible de suivre automatiquement le mouvement des cellules marquées par fluorescence en microscopie à fluorescence intravitale lorsque le contraste entre l'intensité de fluorescence des cellules marquées et le fond est assez grand et adapté un logiciel d'imagerie est installé sur l'ordinateur.

Comme le montre ici, dans notre présentation, nous démontrons la valeur de cette technique dans les in vivo pour l'observation directe de l'ensemble du processus de recrutement des neutrophiles et pour la détermination des fonctions des cellules et des molécules dans chaque étape du recrutement. Avec chimioattractive contenues dans un gel d'agarose de préparation et tenue sur le tissu, un gradient chimiotactique unidirectionnel peut être établie dans le tissu qui induit des réponses recrutement des leucocytes ressemblant à ceux d'origine naturelle pendant l'inflammation locale ^8,9. Le mouvement directionnel des leucocytes à partir veinule postcapillaires vers la source de chimiotactique peut être clairement visualisé par microscopie à fond clair intravitale et de la photographie vidéo. Avec le traitement vidéo time-lapse, le mouvement des cellules peuvent être suivis par ImageJ et une série de paramètres hautement reproductible peut être mesurée. Avec spécifiques des souris transgéniques, les inhibiteurs sélectifs et chimiotactiques, le système de dosage nous permet de révéler les fonctions des protéines spécifiques dans le recrutement des leucocytes. Par exemple, cette technique nous a aidé à identifier le rôle des LSP1 dans les cellules endothéliales comme le gardien dans la régulation de la migration trans neutrophiles ^10, le rôle de Mac-1 (αMβ2 intégrine) dans ramper intraluminale neutrophiles, une étape essentielle pour la migration transendothéliale optimale ^3, et le rôle des PI3Kγ dans le chimiotactisme des neutrophiles dans le tissu ^11.