Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

1. Voorbereiding van de chemoattractant in agarosegel

1. Pipetteer 10 ml van 2 x PBS in een 50-mL conische buis, en opwarmen van de buis door het in een bekerglas met warm water.
2. Pipetteer 10 ml gedestilleerd water en 0,4 g agarose poeder in een andere 50-mL conische buis toe te voegen (met de dop iets los) en verwarm het mengsel tot net koken in een magnetron (voor ~ 1 min in een 700 watt magnetron) .
3. Voeg de verwarmde 2 × PBS om agarose oplossing buis, zwenk de gemengde oplossing en houd het warm in het hete water beker.
4. Micropipet chemoattractant oplossing (bv. 10 pi van 0,5 ug van CXC chemokine MIP-2 of 12 ul van 1 mM WKYMVm) in het deksel van een 1,5-ml Eppendorf buis met 3 pl Oost-Indische inkt en meng goed door aspiratie met behulp van een micropipet (vermijd luchtbel).
5. Snij het puntje einde van een 200-il pipet en micropipet 110 ul van agarose-oplossing (42 ° C) in de deksel en onmiddellijk goed mengen met een andere pipetpunt (vermijd luchtbel).
6. Bewaar de chemoattractant-bevattende gel bij +4 ° C.

2. Voorbereiding van de Cremaster Muscle voor intravitale Microscopy (figuur 1)

1. Verdoven een volwassen man muis door een ip injectie van een mengsel van 10 mg / kg xylazine en 200 mg / kg ketamine hydrochloride.
2. Scheer de ruimte boven juiste externe halsader en de voorste aspect van het scrotum met een elektrisch scheerapparaat. Na de anesthesie, is het belangrijk om speciale aandacht en zorg geven aan de verdoofde muis. Een warmtelamp kan worden gebruikt om de muis te voorkomen dat onderkoeling. De muis moet vrij zijn van pijn reflex.
3. Maak een horizontale snede, vinden en kateterizeren de halsader met behulp van een PE-10 buis gevuld met 100 U / mL heparine zoutoplossing. Catheterisatie van de halsader is nodig voor de toediening van extra anesthetica en drugs wanneer dat nodig is.
4. Fix muis achterpoten met de navelstreng tape met de muis ligt open op een home-made cremaster spier bord (figuur 1).
5. Sluit het bestuur om een ​​37 ° C water circulatiepomp om de cremaster spier en de muis het lichaam warm.

Let op: Alle procedures 2,6 tot 2,14 moeten zeer voorzichtig ⁵ worden uitgevoerd.

6. Maak een incisie in het scrotum huid aan de linkerkant cremaster spier bloot te leggen. Zorgvuldig ontleden de spier van de geassocieerde fascia.
7. Superfuse de cremaster spier met 37 ° C verwarmde bicarbonaat-gebufferde zoutoplossing (131,9 NaCl, KCl 4,7, 1,2 MgSO _4, 20 NaHCO _3, in mM, pH 7,4) met behulp van een peristaltische pomp.
8. Bind een 4-0 hechtdraad tot het distale uiteinde van de cremaster spier om het te houden naar beneden op de duidelijke kijkglas voetstuk van de cremaster spier bord.
9. Lengterichting cauterize de cremaster spier. Met 4-0 hechtdraad, houdt de spier vlak en zet het langs de randen op het voetstuk. Scheid de zaadbal en de bijbal van de onderliggende spier en zet ze in de buikholte.
10. Superfuse de spier op ~ 0,6 ml / min met de 37 ° C verwarmde perfusie buffer en de blootgestelde spier met een deksel 22 × 22 mm glas dekglaasje aan.
11. Plaats de cremaster spier raad van bestuur op de microscoop podium, onderzoekt de spier onder de microscoop, vinden van een geschikte postcapillaire venule (Selecteer de venule dat is recht en onvertakt en heeft een normale shear rate en een diameter in 25 tot 40 micrometer) en stel de videocamera om de venule te worden gevisualiseerd in een verticale positie op links of rechts van de tv-monitor.
12. Na 30 min evenwicht is, opnemen van de video beelden van de geselecteerde postcapillaire venule voor 5 min als baseline controle gegevens met behulp van een video-recorder.
13. Stop de superfusie en verwijder de dekglaasje op de spier.
14. Plaats een ~ 1-mm ³ grote chemoaantrekkende-bevattende gel op het oppervlak van de cremaster spier in een vooraf geselecteerd gebied 350 micrometer van en parallel aan de waargenomen postcapillaire venule, voeg dekglaasje aan de gel op zijn plaats houden en superfuse het spierweefsel op een zeer langzame snelheid (≤ 10 ul / min) tot de oprichting van een gradiënt van chemoattractant die langzaam wordt vrijgegeven en gevormd uit de gel toe te staan.
15. Opnemen van de video de afbeelding voor een 90 minuten na de toevoeging van de chemoattractant met gel. Tijdens het opnemen, aanpassen en houdt de microscoop focus op de hechtende, kruipen, transmigrating en chemotaxing leukocyten in de venule en in het spierweefsel.
16. Na het experiment, importeert u het videobestand naar een computer voor analyse.

3. Cel volgen met behulp van ImageJ

1. Op een computer, uitpakken en de video converteren naar AVI-formaat (bijvoorbeeld gratis gebruik maken van computersoftware bitRipper om DVD video te converteren naar AVI-bestand).
2. Gebruik video-editing software om de time-vervallen film te genereren. Gebruik bijvoorbeeld Windows Movie Maker om een ​​time-vervallen film (tot 1 / 512 of 1 / 1024 time-lapse maken eent 30-fps rate) van de oorspronkelijke, real-time video. Converteren en opslaan van de niet-gecomprimeerde tijd verstreken film naar DV-AVI-formaat.
3. De beelden van de kalibratie micrometer onder dezelfde microscoop instelling, afbeeldingen importeren naar de computer, opent u de beelden met ImageJ. In ImageJ, het totaal aantal pixels verschijnen op de linkerbovenhoek van het scherm (bijvoorbeeld 720 × 480 pixels). Meet de grootte van het scherm in zowel de X-en Y-assen (bv. 200 × 150 micrometer). Hieruit berekenen van het aantal pixels per um (bv. x = 720/200 = 3,6 pixels / um, en y = 480/150 = 3,2 pixels / pm).
4. Voor het importeren van de film, open ImageJ nogmaals, klikt u op "File-Import-Met behulp van Quicktime films Plug-in", selecteer de film te analyseren en klik op "OK" op het grensvlak van 'QT Movie Opener ".
5. Klik op "Plugins-Manual Tracking 'aan cellen te volgen. Vul de relevante informatie in de velden aan de onderkant voor aanvang tracking. In het kort,
   1. Tijdsinterval (in sec) = fold-time-lapse/30 (bijvoorbeeld een 1020 × time-lapse zou 1020/30 = 34 sec / frame interval zijn).
   2. x / y = kalibratie van de micrometer / pixel meting met behulp van de kalibratie van het beeld van de micrometer.
   3. z kalibratie = 0 (als de muis cremaster spier is een uiterst dun laagje van de weefsels en cellen kruipen en migratie zijn ongeveer 2D onder bright-field transilluminatie).
   4. Zoek vierkante formaat voor het centreren = 1.
   5. Puntgrootte / Line breedte / Lettergrootte: ze kunnen worden aangepast als dat nodig is.
6. Selecteer een stabiel en duidelijk punt als een referentiepunt. Dit referentiepunt kan een duidelijke en kleine structurele punt dat blijft ongewijzigd en stabiel gedurende het hele experiment te zijn. Klik op "Add Track" naar het referentiepunt van het eerste nummer tot het laatste frame en klik op "End Track". De gegevens worden weergegeven op de resultaten van tabel automatisch.
7. Track kruipen en het migreren van neutrofielen een voor een: klik op "Add Track" naar de cel van zijn verschijning in weefsel weg om haar verdwijning in elk frame en "End Track" te voltooien en de resultaten opslaan in Microsoft Excel te klikken.

4. Analyse van de neutrofielen Recruitment Parameters

1. Open het bestand resulteert in Microsoft Excel, en analyseren van de gegevens (neem de veranderingen van het referentiepunt in de analyse).
2. Intraluminale kruipen
   1. Kruipafstand: de totale afstand de cel kruipt in het lumen van de eerste aanhanger site om de optimale transmigratie site (pm).
   2. Crawling snelheid: kruipen afstand / tijd (um / min).
3. Transendotheliale migratie
   1. Transmigratie time: vanaf het moment dat de cel begint te over endotheel transmigreren aan de tijd dat de hele cellichaam ligt net buiten de venule en geen cel lichaam kan worden gezien in het lumen (min of sec).
   2. Detachment tijd: vanaf het moment dat de hele cel lichaam is net buiten de venule (direct na transmigratie) om het tijdstip wanneer de cel contact verliest met de venule (de staart trekt) (min of sec).
4. Chemotaxis in weefsel
   1. Migratie afstand: de som van de afstand de cel van het beginpunt wordt verplaatst naar het eindpunt van de migratie in het weefsel (pm).
   2. Snelheid van migratie: migratie afstand in weefsel / tijd (um / min).
   3. Chemotaxis afstand: de som van de afstand de cel migreert in de x-as in weefsel (pm).
   4. Snelheid van chemotaxis: chemotaxis afstand / tijd (um / min).
   5. Chemotaxis index: de verhouding van de verdeling van de chemotaxis afstand door de migratie afstand in het weefsel.

5. Representatieve resultaten:

Hoewel bightfield intravitale microscopie is gebruikt voor de studie van leukocyt-endotheliale cel interacties en niet noodzakelijk zijn voor neutrofielen, hebben we bevestigd dat, door onze histologie studies, meer dan 95% van de aangeworven cellen in neutrofielen chemoaantrekkende behandeld cremaster spieren inderdaad neutrofielen . In dit rapport, met behulp van neutrofiel-selectieve chemoattractants, presenteren we de procedures van het bijhouden van de rekrutering van neutrofielen in vivo. In het bijzonder beschrijven we een protocol van het bijhouden van neutrofielen intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in cremaster spierweefsel in verdoofde muizen met behulp van time-lapse video intravitale microscopie en ImageJ. De chemoaantrekkende-bevattende agarose gel op de cremaster spier releases langzaam chemoattractant en laat een chemoattractant gradiënt te zijn gevestigd in weefsel. Neutrofielen chemoaantrekkende induceert neutrofiel-endotheel cel interacties in cremasteric postcapillaire venulen in muizen. Het hele experiment is gevisualiseerd in een rechtopstaande helderveld intravitale microscoop met videobeelden geprojecteerd door een kleur video-camera op een tv-monitor en opgenomen door een video-recorder. We bepaalden de neutrofielenintraluminale kruipen, transendotheliale migratie en migratie en chemotaxis in spierweefsel in reactie op chemoaantrekkende MIP-2 neutrofiele en WKYMVm bereid in agarose gel (figuur 2). We vonden dat de MIP-2 (bij 0,5 uM) en WKYMVm (bij 0,1 mM) neutrofiel intraluminale kruipen ontlokte bij vergelijkbare snelheid, neutrofielen transendotheliale migratie en onthechting van de venule voor vergelijkbare lengte van de tijd, neutrofiel migratie en chemotaxis in spierweefsel op bijna de dezelfde snelheid en met dezelfde neutrofielen chemotaxis indexen (P> 0,05, Student t-test).

Figuur 1. De schematische illustratie van een intravitale microscoop systeem. De muis cremaster spier is exteriorized op de duidelijke weergave sokkel van cremaster spier pension op microscoop podium en superfused met 37 ° C verwarmde bicarbonaat-gebufferde zoutoplossing. De rechtopstaande microscoop is verbonden met een CCD-kleuren video camera voor helderveld intravitale microscopie. Een zwart-wit diepe gekoelde CCD digitale camera is ook verbonden met microscoop-poort voor fluorescentie microscopie intravitale, de beelden van die direct verwerkt door een computer.

Figuur 2. Neutrofielen werving parameters van helderveld intravitale microscopie. Neutrofielen rekrutering werd veroorzaakt door de geleidelijke afgifte van de neutrofielen chemoattractant MIP-2 of WKYMVm in de agarosegel voorbereiding geplaatst 350 micrometer grenzend aan de postcapillaire venule. Time-vervallen video gegevens werden geanalyseerd door ImageJ na verwerking van de real-time video-opname van het experiment. Neutrofielen intraluminale kruipen (A), transmigratie tijd en onthechting tijd (B), migratie snelheid en chemotaxis snelheid in weefsel (C), en chemotaxis index in cremaster spier (D) werden bepaald na de toediening van MIP-2 of WKYMVm agarose gel op cremaster spier in C57BL / 6 muizen (n = 3, # gevolgd van cellen = 22 (in A en B) en 27 (in C en D) voor respectievelijk MIP-2, en = 26 (in A en B) en 44 ( in C en D) voor respectievelijk WKYMVm).

Intravitale microscopie is een belangrijk gereedschap voor het openbaren van de cellulaire en moleculaire mechanismen van leukocyten werving tijdens de ontsteking. Kwantitatieve visualisatie voor de bepaling van leukocyten-endotheliale cel interacties in microvasculatuur van doorschijnend weefsels zoals cremaster spier-en mesenterium blijft de gouden standaard voor de toepassing van de techniek ^1,5. De conventionele helderveld microscopie intravitale heeft vele unieke technische eigenschappen en de werving mechanismen geopenbaard in deze weefsels zijn van toepassing op de meeste weefsels in vivo ^1,2,6. Echter, de mechanismen van leukocyten werving in sommige andere weefsels, zoals de longen, de lever en de hersenen is aangetroffen heel anders dan die geopenbaard in cremaster spier-en mesenterium ^1. Daarnaast, fluorescentie microscopie moet worden gebruikt in een aantal minder transparant weefsels.

Vergeleken met de fluorescentie-gebaseerde microscopie, die bekend staat om zonbeschadigde om de functies van levende cellen, helderveld microscopie intravitale is meer fysiologische en minder schadelijk voor de cellen en weefsels (dus met minder artefacten) bij lange-time beeldvorming voor het observeren van dynamische cellulaire gedrag in levende dieren is nodig ^7. Het is ook handiger, goedkoper en geen tl-etikettering nodig is. Aan de andere kant, met transilluminatie beeldvorming in intravitale microscopie, automatisch volgen cellulaire beweging is onmogelijk met de huidige beschikbare commerciële imaging software op de markt. Maar het is heel gemakkelijk om het opzetten van een aparte fluorescentie intravitale imaging-systeem (bijvoorbeeld door het projecteren van de beelden naar een fluorescentie-CCD-camera en computer) op dezelfde helderveld intravitale microscoop (figuur 1). Dit biedt het gemak van het schakelen tussen helderveld microscopie en fluorescentie beeldvorming op hetzelfde monster bereiding in een enkel experiment. Dit maakt het ook mogelijk om automatisch de verplaatsing van fluorescent gelabelde cellen onder fluorescentie microscopie intravitale wanneer het contrast tussen de fluorescentie-intensiteit van de gelabelde cellen en de achtergrond is groot genoeg en geschikt imaging software wordt geïnstalleerd op de computer.

Zoals hier afgebeeld in onze presentatie tonen we de waarde van deze in vivo techniek voor directe observatie van het hele proces van neutrofielen werving en voor de bepaling van de functies van cellen en moleculen in elke werving stap. Met chemoattractant in agarosegel voorbereiding en gehouden op het weefsel, kan een unidirectionele chemotactische gradiënt worden vastgesteld in het weefsel dat leukocyten werving reacties lijken op die van nature in lokale ontsteking ^8,9 induceert. De directionele leukocyten beweging van postcapillaire venule naar de bron van chemoattractant kan duidelijk gevisualiseerd door helderveld intravitale microscopie-en video-fotografie. Met de time-lapse video processing, kan cel beweging worden gevolgd door ImageJ en een reeks van zeer reproduceerbare parameters kunnen worden gemeten. Met specifieke transgene muizen, remmers en selectieve chemoattractants, de test-systeem helpt ons om de functies van specifieke eiwitten onthullen in leukocyten recruitment. Bijvoorbeeld, deze techniek ons geholpen om de rol van LSP1 in endotheelcellen als de poortwachter in de regulatie van de neutrofielen transendotheliale migratie ^10, de rol van Mac-1 (αMβ2 integrine) in neutrofiele intraluminale kruipen, een essentiële stap voor een optimale transendotheliale migratie te identificeren ^3, en de rol van PI3Kγ in neutrofielen chemotaxis in weefsel ^11.