Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

1. Vorbereitung der Lockstoff in Agarose Gel

1. Je 10 ml 2 × PBS in einem 50-mL konischen Rohr, und Aufwärmen der Röhre, indem Sie es in ein Becherglas mit heißem Wasser.
2. Je 10 ml destilliertem Wasser und 0,4 g Agarose Pulver in einem anderen 50-mL konischen Rohr (mit seiner Mütze etwas gelockert) und erhitzt die Mischung bis kurz Kochen in der Mikrowelle (für ca. 1 min in einem 700-Watt-Mikrowelle) .
3. Fügen Sie die erwärmte 2 × PBS für Agarose-Lösung Schlauch, wirbeln die gemischte Lösung und halten Sie sie warm in das heiße Wasser Becher.
4. Micropipette chemoattractant Lösung (z. B. 10 ul 0,5 ug CXC-Chemokin MIP-2 oder 12 ul 1 mM WKYMVm) in den Deckel eines 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen mit 3 ul Tusche und gut mischen durch Absaugen mit einer Mikropipette (zu vermeiden Luftblase).
5. Schneiden Sie die Spitze eines 200-ul Pipettenspitze und Mikropipette 110 ul Agarose-Lösung (42 ° C) in den Deckel und sofort gut mischen mit einem anderen Pipettenspitze (Vermeidung von Luftblasen).
6. Bewahren Sie die Lockstoff-Gel bei +4 ° C.

2. Vorbereitung der Cremaster Muskel für Intravital Mikroskopie (Abbildung 1)

1. Anesthetize ein erwachsener Mann mit der Maus durch eine ip-Injektion einer Mischung von 10 mg / kg Xylazin und 200 mg / kg Ketamin-Hydrochlorid.
2. Shave Bereich über rechte äußere Halsschlagader und der Vorderseite des Hodensacks mit einem elektrischen Rasierer. Nach der Anästhesie, ist es wichtig, besondere Aufmerksamkeit und Sorgfalt auf die narkotisierten Maus zu geben. Eine Wärmelampe kann verwendet werden, um die Maus vor Unterkühlung zu verhindern. Die Maus sollte frei sein von Schmerz-Reflex.
3. Machen Sie ein horizontaler Schnitt, finden und Katheterisierung der Jugularvene mit einer PE-10-Schlauch mit 100 U / mL Heparin Kochsalzlösung gefüllt. Katheterisierung der Jugularvene für die Verabreichung von zusätzlichen Anästhesie und Medikamente benötigt, wenn erforderlich.
4. Fix Maus Hinterbeine mit Nabelschnur-Band mit der Maus mit dem Gesicht auf einem hausgemachten M. cremaster Bord (Abbildung 1).
5. Verbinden Sie das Board zu einem 37 ° C Wasser Thermostaten zu halten cremaster Muskel-und Maus Körper warm.

Hinweis: Alle Verfahren 2,6 bis 2,14 müssen sehr vorsichtig ⁵ durchgeführt werden.

6. Machen Sie einen Schnitt in der Haut des Hodensackes auf der linken M. cremaster aussetzen. Sorgfältig sezieren den Muskel aus dem zugehörigen Faszie.
7. Superfuse M. cremaster mit 37 ° C vorgewärmt Bicarbonat-gepufferte Kochsalzlösung (NaCl 131,9, 4,7 KCl, 1,2 MgSO _4, 20 NaHCO _3, in mM, pH 7,4) mit einer Schlauchpumpe.
8. Tie einem 4:0-Naht am distalen Ende des M. cremaster zu halten auf die klare Sichtscheibe Sockel des M. cremaster Bord.
9. Cauterize M. cremaster in Längsrichtung. Mit 4-0 Nahtmaterial, halten Sie die Muskeln flach und befestigen Sie es an den Rändern auf dem Podest. Trennen Sie die Hoden und Nebenhoden von der darunter liegenden Muskeln und verschieben Sie sie in die Bauchhöhle.
10. Superfuse der Muskel bei ~ 0,6 ml / min mit dem 37 ° C vorgewärmt Perfusionspuffer und decken den freigelegten Muskel mit einer 22 × 22 mm Deckglas.
11. Setzen Sie den M. cremaster Bord auf dem Mikroskoptisch, untersuchen Sie die Muskeln unter dem Mikroskop, einen geeigneten postkapillären venule (Wählen Sie die venule, dass gerade und unverzweigt ist und normale Scherrate und einen Durchmesser in 25-40 um) und passen Sie die Video-Kamera damit die venule zu sein in einer vertikalen Position auf der linken oder rechten Ende der TV-Monitor visualisiert.
12. Nach 30 min aus dem Gleichgewicht, Aufzeichnung der Videobilder der ausgewählten postkapillären venule für 5 min als Ausgangswert Steuerdaten mit Hilfe eines Video-Recorders.
13. Stoppen Sie die Superfusion und entfernen Sie das Deckglas auf den Muskel.
14. Ein ~ 1-mm ³ große Lockstoff-Gel auf der Oberfläche des M. cremaster in einem vorgewählten Bereich von 350 um und parallel zu den beobachteten postkapillären venule, fügen Deckglas auf das Gel in Position zu halten und superfuse das Muskelgewebe in einem sehr langsam (≤ 10 ml / min), um die Einrichtung einer Steigung von Lockstoff, die langsam freigesetzt wird und gebildet aus dem Gel zu ermöglichen.
15. Notieren Sie sich die Video-Bild für 90 min nach der Zugabe der Lockstoff Gel. Während der Aufnahme einstellen und halten das Mikroskop Fokus auf die Einhaltung, Krabbeln, transmigrating und chemotaxing Leukozyten im venule und im Muskelgewebe.
16. Nach dem Experiment, importieren Sie die Video-Datei auf einen Computer zur Auswertung.

3. Handy-Tracking mit ImageJ

1. Auf einem Computer, extrahieren und konvertieren das Video in AVI-Format (zB Nutzung freier Software bitRipper auf DVD-Video zu AVI Datei umwandeln).
2. Verwenden Sie Video-Editing-Software, um die zeitversetzt Film zu erzeugen. Verwenden Sie zum Beispiel Windows Movie Maker zu einem zeitversetzt Film (auf 1 / 512 oder 1 / 1024 im Zeitraffer einet 30-fps-Rate) von der ursprünglichen, Echtzeit-Video. Konvertieren und speichern Sie die unkomprimierte zeitversetzt Films an ein DV-AVI-Format.
3. Notieren Sie sich die Bilder der Kalibrierung Mikrometer unter den gleichen Mikroskop-Einstellung, importieren Bilder auf den Computer, öffnen Sie die Bilder mit ImageJ. In ImageJ, erscheinen die insgesamt Pixel auf dem oberen Rand des Bildschirms (z. B. 720 × 480 Pixel) links. Messen Sie die Größe des Bildschirms an beiden Achsen X und Y (z. B. 200 × 150 pm). Daraus errechnen die Anzahl der Pixel pro um (zB x = 720/200 = 3,6 Pixel / um, und y = 480/150 = 3,2 Pixel / um).
4. So importieren Sie den Film, offene ImageJ wieder, klicken Sie auf "Datei-Import-Mit Quicktime Movies Plug-in", wählen Sie den Film zu analysieren und klicken Sie auf "OK" an der Schnittstelle von "QT Film Opener".
5. Klicken Sie auf "Plugins-Manual Tracking", um Zellen zu verfolgen. Füllen Sie die relevanten Informationen in die Felder unten vor dem Start Tracking-Systems. Kurz gesagt,
   1. Zeitintervall (in sec) = fold-time-lapse/30 (zum Beispiel ein 1020 × Zeitraffer wäre 1020-1030 = 34 sec / frame Intervall).
   2. x / y = Kalibrierung der um / pixel-Messung mit der Kalibrierung des Bildes des Mikrometers.
   3. z-Kalibrierung = 0 (wie die Maus M. cremaster einer extrem dünnen Schicht aus Gewebe und Zellen kriechen und Migration sind ca. 2D unter Hellfeld-Durchlicht ist).
   4. Suche Quadratmeter Größe zur Zentrierung = 1.
   5. Punktgröße / Line Breite / Schriftgrad: Sie können bei Bedarf angepasst werden.
6. Wählen Sie einen stabilen und klaren Punkt als Bezugspunkt. Dieser Bezugspunkt kann eine klare und kleine struktureller Hinsicht, dass unverändert und stabil in der gesamten Experiment bleibt. Klicken Sie auf "Add Track" zum Bezugspunkt von der ersten bis zur letzten Frame aus und klicken Sie "End Track". Die Daten erscheinen auf den Ergebnissen Tabelle automatisch.
7. Spur kriecht und die Migration von Neutrophilen eins nach dem anderen: klicken Sie auf "Add Track", um die Zelle von ihrer Erscheinung in Gewebe bis zu seinem Verschwinden in jedem Frame aus und klicken Sie "End Track" zu beenden und speichern die Ergebnisse in Microsoft Excel.

4. Die Analyse der Neutrophilen Recruitment Parameters

1. Öffnen Sie die Ergebnisse in Microsoft Excel, und die Daten analysieren (nehmen Sie die Änderungen der Bezugspunkt in-Analyse).
2. Intraluminale kriechen
   1. Crawling Distanz: die totale Entfernung der Zelle kriecht in das Lumen von der ersten Anhänger vor Ort, um die optimale Seelenwanderung Website (um).
   2. Crawling Geschwindigkeit: Crawling Weg / Zeit (um / min).
3. Transendotheliale Migration
   1. Transmigration Zeit: ab dem Zeitpunkt der Zelle beginnt in Endothel, um die Zeit abwandern, wenn die ganze Zellkörper liegt etwas außerhalb des venule und keine Zelle Körper kann in das Lumen (min oder sec) gesehen werden.
   2. Detachment der Zeit: von der Zeit die ganze Zellkörper liegt etwas außerhalb des venule (unmittelbar nach der Seelenwanderung), um den Zeitpunkt, wenn die Zell-Kontakt verliert mit der venule (den Schwanz eingezogen) (min oder sec).
4. Chemotaxis in Gewebe
   1. Laufstrecke: die Summe der Abstand der Zelle bewegt sich vom Startpunkt bis zum Endpunkt der Wanderung im Gewebe (um).
   2. Geschwindigkeit der Migration: Laufstrecke im Gewebe / Uhrzeit (um / min).
   3. Chemotaxis Entfernung: die Summe der Abstand der Zelle wandert in x-Achse im Gewebe (um).
   4. Velocity der Chemotaxis: Chemotaxis Weg / Zeit (um / min).
   5. Chemotaxis Index: Das Verhältnis der Aufteilung der Chemotaxis Abstand von der Laufstrecke im Gewebe.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Obwohl bightfield Intravitalmikroskopie zur Untersuchung der Leukozyten-Endothel-Zell-Interaktionen benutzt wird und nicht unbedingt für Neutrophile, bestätigt uns, dass durch unsere Histologie Studien, mehr als 95% der rekrutierten Zellen in neutrophilen Lockstoff behandelten cremaster Muskeln waren in der Tat Neutrophilen . In diesem Bericht, mit Neutrophilen-selektive Lockstoffe, präsentieren wir Verfahren zur Verfolgung der Rekrutierung von Neutrophilen in vivo. Insbesondere beschreiben wir ein Protokoll der Tracking neutrophilen intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in cremaster Muskelgewebe in narkotisierten Mäusen mit Zeitraffer-Intravitalmikroskopie Video-Mikroskopie und ImageJ. Der Lockstoff-haltigen Agarosegel auf dem M. cremaster langsam freisetzt chemoattractant und ermöglicht einen Lockstoff-Gradienten in Gewebe festgestellt werden. Neutrophile chemoattractant induziert Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen in cremasterica postkapillären Venolen in Mäusen. Das ganze Experiment ist unter einer aufrechten Hellfeld intravital Mikroskop mit Videobildern von einer Farb-Videokamera zu einem TV-Monitor projiziert und von einem Videorecorder visualisiert. Wir bestimmten die Neutrophilenintraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Migration und Chemotaxis in Muskelgewebe als Reaktion auf neutrophilen chemoattractant MIP-2 und WKYMVm in Agarosegel hergestellt (Abb. 2). Wir fanden, dass MIP-2 (bei 0,5 pM) und WKYMVm (bei 0,1 mM) neutrophilen intraluminale kriechen hervorgerufen zu ähnlichen Geschwindigkeit, Neutrophilen transendotheliale Migration und Ablösung von der venule für vergleichbare Länge der Zeit, die Migration von Neutrophilen-Chemotaxis und im Muskelgewebe mit nahezu gleichen Geschwindigkeit und mit ähnlichen Neutrophilen-Chemotaxis Indizes (P> 0,05, Student t-Test).

Abbildung 1. Die schematische Darstellung einer intravitalen Mikroskop-System. Die Maus M. cremaster ist auf der klare Sicht Sockel M. cremaster Bord auf Mikroskoptisch exteriorisiert und superfundiert mit 37 ° C vorgewärmt Bicarbonat-gepufferte Kochsalzlösung. Die aufrechten Mikroskop ist mit einem CCD-Farb-Videokamera für Hellfeld Intravitalmikroskopie verbunden. Eine monochrome tief gekühlte CCD-Kamera ist auch für Mikroskop-Port für die Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie verbunden, die Bilder aus, die direkt von einem Computer verarbeitet.

Abbildung 2. Neutrophil Rekrutierung Parameter Hellfeld Intravitalmikroskopie. Neutrophile Rekrutierung wurde durch die allmähliche Freisetzung von neutrophilen chemoattractant MIP-2 oder WKYMVm im Agarosegel Vorbereitung platziert 350 um neben der postkapillären venule induziert. Zeitversetzt Videodaten wurden von ImageJ nach der Verarbeitung der Echtzeit-Video-Aufzeichnung des Experiments analysiert werden. Neutrophile intraluminale kriechen (A), Seelenwanderung Zeit und Distanz der Zeit (B), Wanderungsgeschwindigkeit und Chemotaxis Geschwindigkeit im Gewebe (C), und Chemotaxis Index in M. cremaster (D) wurden nach der Verabreichung von MIP-2 oder WKYMVm Agarosegel festgestellt M. cremaster in C57BL / 6 Mäuse (n = 3, # der verfolgten Zellen = 22 (in A und B) und 27 (in C und D) bzw. für MIP-2 und = 26 (in A und B) und 44 ( in C und D) bzw. für WKYMVm).

Intravitalmikroskopie ist das wesentliche Werkzeug für die Entdeckung der zellulären und molekularen Mechanismen der Rekrutierung von Leukozyten während der Entzündung. Quantitative Visualisierung für die Bestimmung der Leukozyten-Endothel-Zell-Interaktionen in Mikrovaskulatur von transluzenten Gewebe wie M. cremaster und Mesenterium bleibt der Goldstandard für die Anwendung der Technik ^1,5. Die konventionellen Hellfeld Intravitalmikroskopie hat viele einzigartige technische Ausstattung und die Rekrutierung Mechanismen in diesen Geweben offenbart gelten für die meisten Gewebe in vivo ^1,2,6. Allerdings haben die Mechanismen der Rekrutierung von Leukozyten in einigen anderen Geweben wie Lunge, Leber und das Gehirn gefunden ganz anders als in M. cremaster und Mesenterium ¹ zeigte. Darüber hinaus hat die Fluoreszenzmikroskopie in einigen weniger transparent Geweben verwendet werden.

Verglichen mit dem Fluoreszenz-basierten Mikroskopie, die für Lichtschäden, die Funktionen der lebenden Zellen bekannt ist, ist Hellfeld Intravitalmikroskopie mehr physiologischen und weniger schädlich für die Zellen und Gewebe (also mit weniger Artefakte), wenn lange Zeit Bildgebung für die Beobachtung dynamischer zellulärer Verhaltensweisen in lebenden Tieren notwendig ist ^7. Es ist auch bequemer, billiger und keine Fluoreszenzmarkierung erforderlich ist. Auf der anderen Seite, mit Durchleuchtung Bildgebung in der Intravitalmikroskopie ist die automatische Tracking zelluläre Bewegung mit derzeit verfügbaren kommerziellen Imaging-Software auf dem Markt nicht möglich. Allerdings ist es sehr einfach, eine separate Fluoreszenz intravitales Imaging System (z. B. durch die Projektion der Bilder auf einem Fluoreszenz-CCD-Kamera und Computer) auf dem gleichen Hellfeld intravital Mikroskop (Abbildung 1). Dies bietet den Komfort des Umschaltens zwischen Hellfeld-Mikroskopie und Fluoreszenz-Bildgebung auf dem gleichen Probenvorbereitung in einem einzigen Experiment. Dies macht es auch möglich, automatisch die Bewegung von fluoreszenzmarkierten Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop Intravitalmikroskopie, wenn der Kontrast zwischen der Fluoreszenzintensität der markierten Zellen und der Hintergrund ist groß genug und geeignet Imaging-Software auf dem Computer installiert ist.

Wie hier in unserer Präsentation dargestellt, zeigen wir den Wert dieser In-vivo-Technik für die direkte Beobachtung des gesamten Prozesses der neutrophilen Rekrutierung und für die Bestimmung der Funktionen von Zellen und Molekülen in jeder Einstellung Schritt. Mit Lockstoff in Agarosegel Zubereitung enthaltenen und hielt auf das Gewebe, kann eine unidirektionale chemotaktischen Gradienten im Gewebe, die Rekrutierung von Leukozyten Reaktionen ähneln denen natürlich vorkommende während lokale Entzündung hervorruft ^8,9 hergestellt werden. Die gerichtete Bewegung von Leukozyten postkapillären venule in Richtung der Quelle der Lockstoff werden übersichtlich visualisiert durch Hellfeld Intravitalmikroskopie und Video Fotografie. Mit Zeitraffer-Video-Verarbeitung, können Zellbewegung von ImageJ verfolgt werden und eine Reihe von hoch reproduzierbare Parameter gemessen werden können. Mit spezifischen transgenen Mäusen, Hemmer und selektive Lockstoffe, hilft das Testsystem uns, die Funktionen der Proteine ​​in Leukozytenrekrutierung offenbaren. Zum Beispiel diese Technik uns geholfen, die Rolle für LSP1 in Endothelzellen als Gatekeeper in der Regulation der Neutrophilen transendotheliale Migration ^10, die Rolle für Mac-1 (αMβ2 Integrin) in neutrophilen intraluminale Krabbeln, ein wesentlicher Schritt zur optimalen transendotheliale Migration zu identifizieren ^3, und die Rolle für PI3Kγ in Neutrophilen-Chemotaxis in Gewebe ^11.