Hibridación in situ para la localización precisa de las transcripciones de las plantas

Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants. J. Vis. Exp. (57), e3328, doi:10.3791/3328 (2011).

Con los avances en la investigación genómica de la década pasada, la biología vegetal ha sido testigo de la presentación de numerosos estudios a gran escala análisis cuantitativo de la expresión génica. Microarrays y la próxima generación de métodos de secuenciación se utilizan para investigar los procesos de respuesta de desarrollo, fisiología y el estrés, diseccionar las vías de ARN epigenético y pequeños, y construir grandes redes de genes reguladores ^1.3. Si bien estas técnicas facilitan el análisis simultáneo de grandes conjuntos de genes, por lo general ofrecen una resolución espacio-temporal muy limitado de cambios de expresión génica. Esta limitación puede superarse parcialmente usando perfiles método junto con lasermicrodissection o fluorescencia de células activadas por la clasificación ^7.4. Sin embargo, para comprender plenamente el papel biológico de un gen, el conocimiento de su patrón espacio-temporal de la expresión a una resolución celular es esencial. En particular, cuando se estudia el desarrollo o los efectos ambientales de las ITSmuli y mutantes pueden el análisis detallado del patrón de expresión de un gen es esencial. Por ejemplo, sutiles diferencias cuantitativas en los niveles de expresión de los genes reguladores clave puede dar lugar a fenotipos dramática cuando se asocia con la pérdida o ganancia de expresión en tipos celulares específicos.

Varios métodos se utilizan habitualmente para el examen detallado de los patrones de expresión génica. Una de ellas es a través del análisis de las líneas transgénicas reportero. Este análisis puede, sin embargo, se convierten en mucho tiempo en el análisis de múltiples genes o de trabajo en las plantas recalcitrantes a la transformación. Por otra parte, una validación independiente para asegurarse de que el patrón de expresión de los transgenes imita a la de los genes endógenos que normalmente se requiere. Localización de la proteína del ARNm inmunohistoquímica o hibridación in situ presentar alternativas relativamente rápido para la visualización directa de la expresión génica en las células y tejidos. Este último tiene la ventaja de que puede ser fácilmente used en cualquier gen de interés. La hibridación in situ permite la detección de ARNm diana en las células por hibridación con una etiqueta anti-sentido sonda de ARN obtenido mediante transcripción in vitro del gen de interés.

Aquí resumimos un protocolo para la localización in situ de la expresión génica en las plantas que es altamente específica y sensibilidad. Está optimizado para su uso con paraformaldehído fijo, incluidos en parafina secciones, que dan una excelente conservación de la histología, y las sondas DIG-etiquetados que se visualizan por inmuno-detección y fosfatasa alcalina reacción colorimétrica. Este protocolo se ha aplicado con éxito a una serie de tejidos a partir de una amplia gama de especies de plantas, y puede ser utilizado para analizar la expresión de ARNm y ARN pequeños ^8-14.

1. Preparación de la muestra

Nota: Todas las medidas hasta e incluyendo el paso de hibridación son sensibles a la actividad de RNAsa. Por tanto, es esencial para el trabajo en condiciones de limpieza. También es bastante común para hacer que todas las soluciones de RNasa libre mediante el uso de agua tratada con DEPC y la cristalería al horno a 180 ° C durante al menos 3 horas. Envases de plástico se suelen limpiar con el tratamiento con 0,2 N NaOH durante 30 minutos. Sin embargo, ninguna de estas precauciones son esenciales y que por lo general el uso regular limpia milliQ H ₂ O para todas las soluciones. Si el cliente quiere mantener los reactivos por separado, cajas y artículos de vidrio para hibridaciones in situ y almacenarlas en un armario de limpieza.

1. Ejemplo de fijación
   1. Día 1: Preparar fresca de paraformaldehído al 4% (PFA) fijador. Por 500 ml, 400 ml caliente 1x PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3 mM NaH ₂ PO ₄ pH 7,0) a 60 ° C y disolver dos bolitas de NaOH. En una campana de extracción, añadir 20 g de paraformaldehyde y mezcle bien hasta que se disuelva. Ponga la solución en el hielo y cuando se enfría ajustar el pH a 7.2 con H ₂ SO ₄ (1-2 gotas por 100 ml). A continuación, ajustar el volumen a 500 mL con PBS 1x.
      Nota: No use HCl para ajustar el pH, ya que emite gases altamente tóxicos. Paraformaldehído es tóxico, por lo tanto, esta solución debe prepararse en una campana de humos y eliminados adecuadamente. Además, paraformaldehído se almacena a 4 º C y se deben comprar nuevos cada 6-9 meses.
   2. Muestras de la cosecha de tejidos y ponerlos inmediatamente en 15 ml de fijador fresco PFA en el hielo en viales de centelleo de vidrio. Si la disección de tejidos es necesario, es mejor hacerlo sobre el hielo en un fijador de frío.
      Nota: Es importante utilizar un gran exceso de fijador. La relación general que se recomienda es el uso de 10 volúmenes de fijador para un volumen de tejido.
   3. Aplicar un vacío (~ 500 mm Hg) a las muestras, mientras que en el hielo. Mantener el vacío durante 15-20 minutos; pequeñas burbujas que la liberación de la muestras, pero el fijador no debe llegar a hervir. Cortar el vacío lentamente, y renovar el fijador PFA para asegurar el fijador se mantiene en la concentración correcta. Repita este paso hasta que los tejidos sumidero después de la liberación de vacío.
      Nota: La fijación es necesaria para fijar y reticular moléculas de ARN en el tejido. Este paso es fundamental como materiales poco de renta fija una señal de baja. Algunos tejidos no se hunden inmediatamente, pero la mayoría eventualmente se hundirá toda la noche. Para mejorar la infiltración del aislante, los detergentes Pueden añadirse los siguientes: Triton hasta el 0,1% y / o Tween hasta 0,1 - 0,3%. Por otra parte, a base de etanol fijadores, como el formaldehído-alcohol-ácido ácido (FAA), se puede utilizar para los tejidos que son de otra manera no fácilmente infiltrado ^14,15.
   4. Vuelva a colocar el fijador de PFA, una vez más y mantener los viales a 4 ° C durante la noche.
2. Incorporación de los tejidos
   1. Día 2: Pre-enfriar 1x PBS y la serie de etanol a 4 ° C.
   2. Enjuague el twi muestrasce durante 30 minutos cada uno en PBS 1x, en el hielo.
      Nota: Una vez más, se recomienda utilizar un gran exceso de cada solución.
   3. Deshidratar las muestras mediante la adopción a través de una serie de etanol, en el hielo, de la siguiente manera:
      • 10% de etanol de 30 minutos,
      • 30% de etanol de 30 minutos,
      • Etanol al 50% de 1 hora,
      • Etanol al 70% de 1 hora,
      • 85% de etanol de 1 hora,
      • 95% una hora de etanol,
      • 3 cambios de etanol al 100% de una hora cada uno
   4. Al final del día, reemplazar el etanol en un 0,1% Eosina en etanol al 100% durante la noche a 4 ° C. Eosina manchas de la pared celular lo que las muestras más visibles durante la inclusión y corte.
      Notas: Los tiempos indicados aquí se han optimizado para bloques de 3x3x3 mm, pero ya incubación puede ser necesaria para las grandes muestras.
      Las muestras pueden ser almacenadas en el 70% de etanol a 4 ° C durante varios meses. Día 3: A la mañana siguiente, calentar las muestras a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, reemplace el etanol gradualmente con histoclear de la siguiente manera:
      
   5. Al final del día, aumentar el volumen de 1 / 4 de Paraplast Plus chips y coloque el frasco en una estufa a 60 º C. También llenar un vaso de precipitados con chips Paraplast y reponer esta frecuencia con el fin de tener siempre la cera recién fundido a mano.
      Nota: La temperatura del horno se está calentando importante y prolongada de Paraplast por encima de 60 ° C deben ser evitados.
   6. Día 4: Reemplazar gradualmente el histoclear con Paraplast regularmente añadiendo más fichas de parafina (cada hora). Al final del día, con cuidado vierta la mezcla histoclear / cera e inmediatamente reemplazarlo con cera fundida pura. Dejar las muestras a 60 ° C durante la noche.
   7. Días 5 y 6: Cambiar el Paraplast 3 veces al día, aproximadamente cada 4 horas, con la cera fundida fresco mantener la splos a 60 ° C.
      Nota: Es posible cambiar la cera una vez al día, pero la preparación de tejidos tomaría unos días más para completar, ya que la cera se debe cambiar por lo menos 5 o 6 veces. Infiltración al vacío de las muestras de tejidos cuando estos están en EtOH al 100% y / o en la cera puede mejorar aún más la infiltración y la inclusión de los tejidos. Infiltración al vacío de las muestras de cera se debe hacer a 60 ° C.
   8. Día 7: Cambiar la cera una vez más. El olor de la histoclear ahora debe haber desaparecido por completo y las muestras pueden ser incorporados más tarde ese día.
   9. Establecer una placa de calentamiento grande a 60 ° C protegido por una lámina de aluminio.
   10. El método de incorporación pueden variar en función del tipo de tejido para ser analizado. El punto más importante en este paso es asegurar que las muestras tengan la orientación adecuada para la sección posterior. Una forma es utilizar moldes de plástico y anillos. Calentar los moldes en la placa de calentamiento y se vierte cera fundida en la parte inferior del molde. Transferenciauna muestra de tejido en el molde con una pinza caliente y orientarlo en la posición deseada. Coloque el anillo blanco en el molde y añadir más cera fundida de tal manera que los tejidos están cubiertos por completo. Mueva con cuidado el molde de la placa a la banca. Dejar que la cera se enfríe poco a poco.

Otra posibilidad es la distribución de todas las muestras en una placa de Petri que contiene cera fundida (las muestras debe estar completamente cubierto con cera) mientras trabajaba en la 60 ° C la placa caliente. Orientar las muestras con pinzas calientes. Al final, apague la placa. Cuando la cera se solidifica, la placa de Petri se pueden mover a la banca y luego se almacena a 4 ° C. Cuando esté listo para el corte, pequeños bloques que contienen una muestra de tejido se puede cortar de la placa de Petri con una hoja caliente y montado sobre un soporte de la muestra microtomo con un descenso adicional de la cera fundida. Permita que la muestra se endurezca durante unos minutos antes de cortar.

Nota: Los bloques puedense almacena a 4 º C durante 1 año o más. Para más consejos útiles sobre la fijación del tejido y la inclusión, ver ref. 16

2. Sonda de preparación

1. La clonación
   Las sondas se generan normalmente a una o más regiones específicas del gen de interés. Secuencias altamente repetitivas deben ser excluidos de la sonda, pero las secuencias que corresponden a dominios de la proteína conservada, como el ADN motivos de unión de los factores de transcripción, por lo general producirá patrones de genes específicos de la expresión ^8,9,12,15 (Fig. 1). Esto debido a que la RNasa A de tratamiento en las etapas post-hibridación (ver más abajo) reduce el nivel de la sonda de hibridación cruzada entre los miembros de la familia de genes. RNasa A se unirá a los desajustes en el dúplex ARN, sondas de hibridación fragmentar a las transcripciones de complementariedad imperfecta, que se lava en los pasos posteriores.
   En general, varias sondas posible que tenga que hacerse la prueba de cada gen de interés. Las sondas pueden ser tan cortos como 150 bases de longitud. Although no hay límite a la longitud de la sonda, los fragmentos más corta de 1,5 kb por lo general transcribir mejor. Fragmentos de ADN que se transcribe se clonan en un vector que contiene T3, T7, o SP6 promotores (por ejemplo, pCRII-TOPO, Invitrogen). Por otra parte, T3, T7 o SP6 secuencias del promotor puede ser incluido como una 5'-cola en el primer inversa utilizado para amplificar la región de la sonda.
   En cada experimento de hibridación in situ, se incluye una sonda de control positivo de lo que se conoce el patrón de hibridación y que trabaja constantemente, así como un control negativo (Figura 1D y H). Este último podría ser una sonda de ARN al azar que se sabe que no hibridan con las transcripciones en el tejido de interés. Aunque es común el uso de la sonda sentido del gen en estudio, esto no es necesario y cualquier ARN no-hibridación se adapte a la finalidad. Si está disponible, los tejidos de un alelo nulo de la transcripción del gen de interés que sirven como un excelente control negativo.
   
En la transcripción in vitro
1. Linealizar el plásmido por digestión de aproximadamente 5 mg de ADN con una enzima de restricción que digiere al final de la pieza frente a la sede de la promotora. No utilizar las enzimas de restricción que dejan un 3 'saliente. Esto puede llevar a la transcripción de los artefactos debido a que la polimerasa se puede utilizar la proyección de la 3 'como un sustrato para continuar la transcripción. Por otra parte, la región de sonda con la T3, T7 o SP6 promotor puede ser amplificado por PCR para generar la plantilla de ADN para la reacción de transcripción in vitro.
2. Compruebe una alícuota en un gel para verificar que la reacción se ha ido hasta el final.
3. Extraer el ADN con fenol / cloroformo, precipitado con etanol y resuspender el precipitado de ADN en milliQ H ₂ O a una concentración de 1μg/μl. Por otra parte, el ADN se puede limpiar con columnas estándar de purificación de ADN.
4. Establecido en la reacción de transcripción in vitro mediante la mezcla de:
   • 1μl purified ADN (1μg/μl)
   • Buffer 2μl transcripción 10x
   • 2 l de 10x DIG RNA etiquetado mezcla
   • 1μl de RNasa A PARTIR
   • 2μl T3, T7 o SP6 RNA polimerasa (20 U / l)
   • H ₂ O hasta 20μl.
   
   Se incuba a 37 ° C durante 1 a 2 horas. Mantenga 1μl para analizar en un gel más tarde.
   Nota: las sondas de fluorescencia con etiqueta son las preferidas en los sistemas de los animales, pero debido a la alta autofluorescencia de los tejidos mayoría de las plantas, en los protocolos de hibridación in situ de las plantas utilizan sondas radiomarcada ^{de 17} o más comúnmente la etiqueta DIG-sondas que se detectan mediante técnicas de inmunohistoquímica.
5. Retire el molde de ADN mediante la adición de 75 l MilliQ H ₂ O y 5 l DNAsa RQ1 (1 U / l) para la reacción de transcripción e incubando la reacción a 37 ° C durante 10 min.
6. Purificar la reacción de transcripción in vitro para eliminar los nucleótidos no incorporados y transcripciones pequeños. Una posibilidad es utilizar un tamaño de exclusión Sephadex ® columna, como el mini paseo rápido columnas RNA (Roche). Por otra parte, la reacción de transcripción puede ser purificado por un convencional LiCl / etanol precipitación (ver ref. 14). Mantenga 1μl de comprobar en un gel más tarde.
7. Sondas de más de 250 bases de longitud suelen ser parcialmente hidrolizada para obtener moléculas de ARN de aproximadamente 150 nt y por lo tanto, lo suficientemente pequeño como para penetrar eficientemente los cortes de tejido. Añadir un volumen igual de tampón de carbonato de 2x (80 mM NaHCO _3, 120 mM Na ₂ CO ₃₎ a la reacción de transcripción purificada y se incuba a 60 ° C. El tiempo de incubación debe ser calculado por la siguiente fórmula:
   = tiempo (Li - Lf) / (K x Li x Lf)
   donde Li = longitud de la sonda inicial (en kb); longitud Lf = final de la sonda (0.150 kb), K = 0,11 kb / minuto. Mantener 2 l de comprobar en un gel.
8. Neutralizar la reacción de hidrólisis por adición de volumen de 1 / 20 del 10% de ácido acético.
9. La sonda es entonces puriFIED añadiendo 1μl de tRNA (100mg/ml), 1 / 10 volumen de 3M NaAc pH 5.2, además de los volúmenes de 2,5 etanol frío al 100%, e incubando a -80 ° C durante 30 min. Precipitar el ARN por centrifugación a 13.500 rpm durante 20 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante y lavar el pellet de ARN con 500μl etanol al 70%. Se centrifuga de nuevo, dejar que el pellet de aire seco (por lo general unos 15 minutos), y volver a suspender el ARN en 50μl formamida desionizada 50%. La sonda debe ser almacenado a -80 ° C hasta su uso.
10. Compruebe de forma regular el 1% TAE-gel de agarosa al producto final, así como los productos intermedios de las secciones 2.2.4, 2.2.6 y 2.2.7 (Figura 2A). Esto permite el seguimiento de la eficacia de la reacción de transcripción in vitro.
    Nota: La reacción de transcripción in vitro debería producir aproximadamente 1 g de ARN por 1 g de plantilla.
2. Dot Blot análisis
   La concentración de la sonda y la incorporación de DIG-UTP puede ser evaluada por dot blot análisis (Figura 2B). Serie RDiluciones NA se colocan sobre una membrana de hibridación estándar junto con un ARN de control de etiquetado de concentración conocida. Por ejemplo, podemos utilizar el DIG-UTP etiquetados ARN sonda de control incluidos en la transcripción in vitro kit (Roche). Lo mejor es probar varias diluciones para cada sonda para establecer una concentración exacta.
   1. Prepare el tampón de bloqueo mediante la disolución de 0,5% del reactivo de bloqueo en 1x tampón TBS (100 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM) a 70 ° C, y luego dejar que la solución se enfríe a temperatura ambiente.
   2. 1μl punto de diluciones en serie (por lo general 10 ^-1 a 10 ^-5) de las sondas in vitro transcrito y el control de un N + membrana de nylon. Fijar el RNA por UV cross-linking.
      Nota: La superficie mínima de la membrana se debe utilizar para reducir el volumen de buffers necesarios más adelante.
   3. Equilibre la membrana en 1x TBS por 5 min a temperatura ambiente (TA) en una plataforma de agitación.
   4. Bloquear la membrana con el bloqueotampón durante 30 min a temperatura ambiente en una plataforma de agitación.
   5. Enjuague la membrana en 1x TBS por 5 min.
   6. Incubar la membrana con el anticuerpo anti-DIG, diluyendo 1μl de anti-digoxigenina-AP en 10 ml de TBS 1x, durante 45 min a temperatura ambiente.
   7. Lavar la membrana dos veces en 1x TBS durante 15 minutos cada uno.
   8. Equilibre la membrana en tampón 1x TN (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl) durante 5 min.
   9. Tinción de la membrana mediante la incubación con NBT / BCIP 1 / 50 (v / v) en tampón 1x TN. Tinción puede tomar 5-10 minutos. Luego enjuague con agua de la membrana, que puede ser seca y se mantiene como un registro.
      Nota: NBT / BCIP es un sustrato para la fosfatasa alcalina conjugada con el anticuerpo anti-DIG que por hidrólisis produce un tinte de color azul oscuro.

3. Seccionamiento

1. Caliente los bloques a la temperatura ambiente. Si los bloques son muy fríos, las secciones individuales pueden darse la vuelta sin la formación de "cinta" de cera. Recorte el bloque en un trapeforma zoid dejando alrededor de 1 mm de cera alrededor de la muestra.
2. Calentar un gran tobogán más caliente a 35-37 ° C.
   Nota: Muchos protocolos de hacer este paso a 42 ° C sin embargo la reducción de la temperatura a 35-37 º C previene la formación de burbujas en las secciones.
3. Colocar el bloque en el microtomo de tal manera que el más largo de las dos caras paralelas se encuentra en la parte inferior. Con cuidado, llevar adelante el bloque de la hoja y asegúrese de que la superficie del bloque es paralela a la hoja. Sección con un grosor de 8 - 10μm. Las cintas de cera pueden ser alineados en una superficie no pegajosa, como papel de aluminio o papel de filtro, para seleccionar las secciones de interés. Esto se puede evaluar utilizando un microscopio de disección cercana.
   Nota: La eosina del tejido proporciona una indicación de si los tejidos han sido debidamente infiltrado durante la inmersión. Si el centro de la manzana no se tiñe con eosina esto generalmente indica que el tejido no está bien fijada.
4. Marca de la sonda-en Plus SLides con un lápiz (la mayoría de los lápices o marcadores se borran durante el protocolo de hibridación in situ) y distribuir 1 ml de agua limpia milliQ H ₂ O en la misma. Cuidadosamente las secciones de interés flotante en la superficie del agua a temperatura ambiente (que es más fácil de manipular las secciones sobre el agua cuando se trabaja a temperatura ambiente). Asegúrese de que el lado brillante (la parte inferior de la cinta sale de la microtomo) se enfrenta al agua. A continuación, traslado de la diapositiva en la diapositiva poco a poco más cálido. Calefacción ayuda a las secciones para difundir en la superficie del agua. Después de 5 minutos, se vierte el agua con cuidado, pero en un movimiento suave, por lo que la cinta se baja hacia abajo en la diapositiva. Deje que los portaobjetos se seque por lo menos varias horas o toda la noche a 37 ° C, por lo que el tejido se adhiere.
   Nota: los tejidos seccionados pueden ser almacenados en una caja con un desecante de sílice durante unos días o semanas a 4 ° C, sin embargo, lo mejor es usar las diapositivas tan pronto como sea posible.

4. In Hybrid situzación

1. Sección de pre-tratamiento
   El volumen requerido para cada solución, obviamente, dependerá del número de diapositivas a tratar y utilizar el tamaño del contenedor. Las secciones deben ser siempre totalmente sumergida. Para un rack de 25 diapositivas y un recipiente perfectamente ajustada, 200-250 ml es suficiente. Debido a que muchos de los pasos de incubación es muy corto, por lo general preparan todas las soluciones posibles y luego iniciar la presentación de pre-tratamientos. Sin embargo, la solución de anhídrido acético tendrá que ser preparada inmediatamente antes de su uso y la proteasa, se añade en el momento de su uso. Todos los pasos se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Además, todos los buffers se puede preparar a una concentración 10 veces como una solución de reserva.
   1. Caliente el buffer de la proteasa (100 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA) en el recipiente a 37 ° C.
   2. Desparafinar y rehidratar las secciones de tejido de la siguiente manera:
      
      • histoclear - 10 min (use un recipiente de vidrio)
      • histoclear - 10 min (utilice unplato de cristal)
      • Etanol al 100% - 1 min
      • Etanol al 100% - 30 seg
      • Etanol al 95% - 30 seg
      • 85% de etanol - 30 seg
      • Etanol al 70% - 30 seg
      • Etanol al 50% - 30 seg
      • 30% de etanol - 30 seg
      • 10% de etanol - 30 seg
      • milliQ H ₂ O - 1 min
   3. Incubar en 1x PBS durante 2 min.
   4. Mezclar 625μl de la proteasa 50mg/ml en 250 ml de buffer de la proteasa del pre-calentado a 37 ° C e incubar los portaobjetos durante 20 minutos a 37 º C.
      Nota: La proteasa es necesaria para digerir las proteínas fijos y aumentar el acceso de la sonda de ARN celular. Es muy importante controlar el tiempo de incubación para maximizar la señal de hibridación, sin ruptura de los tejidos, por lo tanto una optimización puede ser requerido para cada muestra de tejido.
   5. Neutralizar la actividad de la proteasa en el 0,2% de glicina en 1x PBS durante 2 min.
   6. Enjuague los portaobjetos de vez en 1x PBS durante 2 min.
   7. El tratamiento de las diapositivas in solución al 4% PFA durante 10 minutos para volver a fijar el ARN que pueden ser dañados por el tratamiento de la proteasa.
   8. Enjuague los portaobjetos en dos ocasiones en 1x PBS durante 2 minutos cada uno.
   9. Mientras que las diapositivas están en el PBS se lava, representan 250 ml de 0,1 M pH de la solución de trietanolamina 8,0 mediante la mezcla de 12,5 ml de trietanolamina 2M (29.8g en 100 ml milliQ H ₂ O, pH 8,0 con HCl) en 236,25 ml milliQ H ₂ O en un recipiente de vidrio. Añadir 1,25 ml de anhídrido acético en el buffer de trietanolamina inmediatamente antes de poner las diapositivas, y revuelva bien. Después de añadir las diapositivas, seguir removiendo lentamente durante 10 minutos.
      Esto requiere que el bastidor de diapositivas se eleva en el recipiente de trietanolamina / anhídrido acético. Utilizamos un sistema de sujeción con el soporte de apoyo.
      Nota: En este paso, cargado positivamente, grupos amino que puede conducir a la unión no específica de la sonda están acetilados. Además, el anhídrido acético es tóxico, por lo tanto, esta solución debe prepararse en una campana de extracción y desechado apropiadamente <./ Li>
   10. Enjuague los portaobjetos en dos ocasiones en 1x PBS durante 2 min.
   11. Deshidratar los cortes de tejido nuevo:
       
       • H ₂ O - 1 min
       • 10% de etanol - 30 seg
       • 30% de etanol - 30 seg
       • Etanol al 50% - 30 seg
       • Etanol al 70% - 30 seg
       • 85% de etanol - 30 seg
       • Etanol al 95% - 30 seg
       • Etanol al 100% - 30 seg
       • Etanol al 100% - 30 seg
       Nota: Las diapositivas se pueden almacenar en un recipiente con una pequeña cantidad de etanol al 100% en la parte inferior hasta por varias horas a 4 ° C.
2. Hibridación
   1. Calentar un bloque de calentamiento a 85 ° C.
   2. Prepare el tampón de hibridación. De 10 ml, mezclar en un tubo Falcon 1,25 ml de sales de hibridación in situ (3M NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM de fosfato Na pH6.8, 50 mM EDTA), 5 ml de formamida desionizada, 2,5 ml de 50% de sulfato de dextrano, 250 l Denhardt 50x, 125 l tRNA 100mg/ml, y 875 l H ₂ O. <br /> Nota: sulfato de dextrano es muy viscoso, así que lo mejor es precalentar la solución a 60 ° C para el pipeteado fácil. Tampón de hibridación se puede almacenar a -20 ° C.
   3. Prepare las sondas diferentes. Para cada diapositiva, mezcle 1 ml con sonda de 9 l milliQ H ₂ O y 10 l formamida desionizada. El calor de la sonda a 85 ° C durante 2-3 minutos, inmediatamente se enfría en hielo, una breve centrifugación y añadir la sonda de hibridación de amortiguación 80μl por diapositiva. Mezclar bien con la pipeta, pero no hacer burbujas.
      Nota: La cantidad de sonda que se añade en cada diapositiva debe ser probada empíricamente. En general, las sondas se utilizaron a una concentración final de 0,5 complejidad sonda ng / kb / l. Desde hibridaciones se llevan a cabo con 100 l por diapositivas, de aproximadamente 25 ng de la sonda que se necesita en cada diapositiva para las sondas que son de 0,5 kb de longitud y 50 ng de la sonda por diapositiva para las sondas que son de 1 kb de largo. Para simplificar, a menudo tratan de 0,5, 1 y 4 l por sonda de diapositivas.
   4. Colocar los portaobjetos en unlimpiar la superficie y dejar que se seque completamente durante 5-10 minutos. Pipeta de la sonda / buffer de hibridación mezcla en el borde derecho de la diapositiva. Poco a poco, bajar un cubreobjetos sobre el portaobjetos, asegurando que la solución de hibridación cubre todas las secciones sin burbujas. Toque el cubre ligeramente con el dedo donde se forman burbujas para desplazarlos de todas las secciones de tejido. No tire de la cubierta resbale, ya que podría dañar las secciones.
      Nota: Un método alternativo de uso general para este paso es preparar a los "bocadillos" de dos diapositivas que se incuban con la misma sonda. Para más detalles sobre este método, ver ref. 14.
   5. Preparar una cámara de humedad en una caja de plástico perfectamente plano. Cubrir el fondo de la caja con papel Whatman humedecido con agua milliQ, cubrió el papel con parafilm dejando las esquinas descubierto, el lugar de las diapositivas de la caja de plástico y selle la caja fuerte.
   6. Incubación los portaobjetos en la temperatura de hibridación deseada, normalmente 50 - 55 ° C, fo 16 a 20 horas.
   7. Para su uso a la mañana siguiente, preparar 1 litro 0,2 x SSC y almacenar esta a 55 ° C. Además, preparar un tampón NTE litros (0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0) y se almacena a 37 ° C.
3. Post-tratamiento de la hibridación
   1. Quitar los cubreobjetos con cuidado para no dañar las secciones. Colocar los portaobjetos en un estante y lavar dos veces en 0,2 x SSC a 55 ° C durante una hora.
      Nota: Cubreobjetos a menudo se caen fácilmente cuando las láminas se colocan en posición vertical. Si el cubreobjetos permanece unido, sumerja el portaobjetos en caliente SSC 0,2 x para 1 o 2 min para lavar el cubre apagado. Evite tirar el cubre de la diapositiva, ya que esto puede causar daños a las secciones.
   2. Mientras tanto, preparar 500 ml de buffer de lavado (BSA al 1%, 0,3% Tritón en tampón TBS) y 100 ml de solución de bloqueo (un 0,5% en el bloqueo de reactivo tampón TBS). Mezcle el polvo de bloqueo en TBS que se calienta lentamente a 70 º C y dejar enfriar a temperatura ambiente una vez dissolved.
      Nota: Los volúmenes de tampón de lavado y la solución de bloqueo necesario variará dependiendo del tamaño de la caja plana de plástico utilizados en los pasos 4.3.8 -11. Tomará algún tiempo que se disuelva completamente Triton, por lo que preparar la solución con suficiente antelación.
   3. Equilibrar las diapositivas de la NTE 1x por 2 min.
   4. Proceder a la RNasa un tratamiento mediante la transferencia de las diapositivas en el buffer de 1x a NTE que 20μg/ml RNasa A se añade justo antes de su uso, se incuba a 37 ° C durante 30 min.
      Nota: RNasa A se unirá sin una sola cadena de ARN, así como a los desajustes en el dúplex ARN. Este paso ayuda a reducir el nivel de la unión no específica de la sonda, como se escinde fragmentos investigado se lavan en el último lavado de 0,2 x SSC (ver 4.3.6).
   5. Enjuague los portaobjetos en dos ocasiones en 1x NTE durante 2 minutos cada uno.
   6. Se lavan los portas en agua dulce SSC 0,2 x a 55 ° C durante una hora.
   7. Equilibrar las diapositivas en 1x PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   8. La transferencia de las diapositivas de la parrilla en the inferior de una caja plana de plástico y cubrirlos con un volumen mínimo de solución de bloqueo. Bloquear las diapositivas durante 45 minutos en una plataforma moviendo lentamente.
   9. La transferencia de las diapositivas de una segunda caja limpia de plástico plana y lavarlos durante 45 minutos con tampón de lavado en una plataforma de agitación.
   10. Proceder a la incubación del anticuerpo. Diluir el anticuerpo anti-digoxigenina en tampón de lavado (1:05 ​​v / v) y, o bien aplicar un volumen mínimo directamente en cada diapositiva o colocar la placa en una caja plana de plástico y cubrirlos con un volumen mínimo de solución de anticuerpos. Incubar el portaobjetos en la oscuridad durante 2-3 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
   11. Este lavado 4 veces durante 15 minutos cada uno con tampón de lavado en sacudir la plataforma. Use un volumen mínimo de tampón de lavado y una caja de plástico plana. Limpie la caja de plástico entre cada uno de los lavados.
       Nota: La limpieza de la caja entre los mismos se redujo el contexto general de la diapositiva. Para simplificar esto, se utilizan dos cajas planas idénticasy la transferencia de las diapositivas en una caja limpia después de cada lavado.
   12. La transferencia de las diapositivas en 1x TBS durante 2 min.
   13. Equilibrar las diapositivas de la TN búfer dos veces durante 2 minutos cada uno.
   14. Prepare la solución de tinción inmediatamente antes de su uso mediante la adición de 20 l NBT / BCIP por 1 ml de tampón TN. Vierta la solución de tinción en una placa de plástico de peso. Sandwich dos portaobjetos con las secciones uno frente al otro. Sumerja un lado largo del sándwich en la solución, permitiendo que la acción capilar para tirar de la solución. Drenaje de las diapositivas en una Kimwipe y llenar las diapositivas con la solución de anticuerpos de nuevo. Es posible que necesite para aprovechar las diapositivas como la solución fluye hacia abajo para evitar las burbujas. Colocar los portaobjetos en una caja de plástico y almacenar a temperatura ambiente en la oscuridad.
   15. Día 10 a Día 15: Actualizar la solución de tinción dos veces al día durante 1-5 días por aclarar los portaobjetos en tampón TN y la preparación de nuevos sándwiches que contienen solución de tinción fresco.
       Nota: la sustitución de la solución de tinción int regulareservals mejorará la relación señal a fondo. Desarrollo de la señal pueden ser monitoreados en un compuesto o en el estereomicroscopio. Es posible fotografiar las secciones mientras se encuentran en tampón TN entre rondas de manchas o una vez que se transfieren al agua justo antes de montaje permanente.
4. Montaje
   1. Una vez que la señal es obvio, lavar los portaobjetos en milliQ H ₂ O y se deshidratan de forma rápida a través de una serie de etanol:
      
      • 10% de etanol - 10 s
      • 30% de etanol - 10 s
      • Etanol al 50% - 10 s
      • Etanol al 70% - 5 s
      • Etanol al 80% - 5 s
      • Etanol al 95% - 5 s
      • Etanol al 100% - 5 s
      • histoclear - 2 minutos
      • histoclear - 2 minutos
      Nota: Asegúrese de mantener cada uno de estos tiempos de incubación corto, ya que la señal es el etanol soluble.
   2. Montar las diapositivas mediante la colocación de una o dos gotas de base de tolueno medio de montaje en cada deslizóe y bajando lentamente el cubreobjetos sobre el portaobjetos evitando la formación de burbujas. Deje que el medio de montaje endurecer toda la noche antes de analizar el resultado obtenido en un microscopio compuesto. Una vez montado, las diapositivas se pueden almacenar durante años a temperatura ambiente.

5. Los resultados representativos:

Después de 1-5 días, una señal de color rojo púrpura se desarrollará en las celdas en las que la sonda se ha hibridado con las transcripciones complementarios (Figura 1). La señal de color por lo tanto proporciona una visualización directa en resolución celular del patrón de expresión del gen de interés. Una tinción de fondo más débil también puede desarrollarse como resultado de la unión no específica de la sonda o la tinción de los tejidos de la planta (Figura 3). La señal de fondo, puede ser relativamente más pronunciado en las celdas pequeñas, menos decidido de los tejidos, pero la tinción de fondo también se observa en las secciones hibridó con las sondas de control positivo y negativo y noser reproducible entre los experimentos.

Figura 1. Los resultados representativos obtenidos con las sondas de diferentes tejidos de Arabidopsis y el maíz. Hibridaciones in situ de Arabidopsis (AD) y el maíz los tejidos (EH) con distintos genes específicos de las sondas que ilustra el tipo de resultados que puede esperar a la finalización con éxito del protocolo descrito. (A) La localización de SHOOTMERISTEMLESS1 (STM) en el ápice del brote vegetativo de Arabidopsis, tenga en cuenta la presencia de la señal azul púrpura en las células indeterminadas del meristema y la falta de señal en las hojas de los alrededores. (BD) Las secciones de embriones Arabidopsis etapa torpedo mostrando CLAVATA3 (B) expresión en las células madre embrionarias pocos, AtML1 (C) de expresión en la capa epidérmica, y la falta de señal en las secciones probaron con una muestra aleatoria de control negativo de ARN (D). (E) La localización de la knotted1 homólogo STM en el embrión del maíz en desarrollo, tenga en cuenta la fuerte señal específica en el meristemo embrionario y la raíz. (FH) secciones longitudinales a través del ápice vegetativo disparar a partir de maíz que muestran distintos patrones de hibridación in situ para arf3a (F) y ocl4 (G) y no hay señal de hibridación de la sonda de control negativo (H). arf3a se expresa en la superficie foliar abaxial / abajo, mientras que el homólogo ocl4 AtML1 se expresa específicamente en la epidermis.

Los fragmentos de genes se utilizaron los siguientes como sonda: STM: la región del cDNA que abarca los aminoácidos 81 a 382, que incluye el homeodominio conserva; CLV3: el cDNA de longitud completa; AtML1: el tercer exón; kn1: todo el marco abierto de lectura; arf3a: nucleótidos 9 a 225 de clon de ADNc HM004539; ocl4: 3 'de 1,7 kb del ADNc de longitud completa, que incluye varios dominios de la proteína conservada.

Figura 2. Verificación de los puntos al tiempo que en las sondas de transcripción in vitro. (A) En las sondas de hibridación in situ se comprueba en un estándar en gel de agarosa después de la transcripción in vitro (a), después del tratamiento con DNasa y posterior purificación de la reacción de transcripción in vitro (b), después de carbonato de hidrólisis, si es necesario-(c) y cuando listo para su uso (d). Para las sondas de más de 250 pb de longitud, como una sonda, la hidrólisis de carbonato dará lugar a una serie de fragmentos de la sonda más pequeña (el soporte). (B) la cuantificación colorimétrica de las sondas de análisis de transferencia de puntos. Diluciones que van desde 10 ^-1 a 10 ^-5 de una sonda de control de 100 ng / l (1) y de tres nuevas sondas marcadas con DIG (2-4) se vio en una membrana de transferencia, incubadas con anticuerpos anti-DIG, y se analizaron usando el ensayo colorimétrico descrito en el apartado 2.3 del protocolo. El análisis sugierelas siguientes concentraciones estimadas: la sonda 2, ~ 100 ng / l, la sonda 3, ~ 10 ng / l sonda 4, ~ 1 ng / l. La sonda 4 es poco probable que un buen rendimiento en la señal de hibridación in situ.

Figura 3. La comparación de una sonda no específica a una sonda que funcione bien. Secciones longitudinales a través del ápice vegetativo disparar a partir de maíz que muestra una señal de fondo no específica (A) y uno específico en la señal de hibridación in situ para la sonda OCL5 en la capa celular externa (B).

Figura 4. Diagrama que muestra la cronología de los pasos en el protocolo de hibridación in situ. Pasos tejido incrustación se indican en verde, la preparación de la sonda, los pasos de color naranja, y la hibridación in situ en los pasos en azul. Esta línea de tiempo considera que la templa ADNte para la transcripción in vitro de la sonda está disponible. Parafina-incrustados bloques de tejido y la etiqueta DIG-sondas pueden ser preparados de antemano y se almacena a 4 º C y -80 ° C, respectivamente, hasta el momento de su uso. El protocolo de hibridación in situ se puede completar en tan sólo cuatro días.

El método de hibridación in situ descrito aquí permite la visualización directa del patrón de expresión espacio-temporal de cualquier gen de interés con gran resolución celular, alta sensibilidad y especificidad. El protocolo no permite una comparación cuantitativa de los niveles de expresión entre los genes. Sin embargo, la alta sensibilidad del método y la resolución puede revelar los gradientes de expresión de los genes dentro de un tejido ^{8, 18,} ​​que no es posible con la mayoría de los otros métodos de análisis de expresión génica.

El protocolo incluye varios pasos, que pueden hacer que la solución de problemas problemática. Los pasos más críticos del protocolo son la fijación de los tejidos y la selección y el etiquetado de la sonda. Tejidos poco infiltrada y las sondas con la incorporación de DIG baja dará señales muy débiles que podrían ser difíciles de detectar por encima del fondo. Para cada nuevo gen de interés, es recomendable intentar unas cuantas sondas diferentes derivados de difealquiler regiones de la transcripción. Ocasionalmente, dos o tres sondas dirigidas a diferentes regiones más pequeñas del gen puede ser necesario combinar para obtener una señal de hibridación fuerte y específica. Además, las condiciones de hibridación, tales como la temperatura y la composición del tampón de hibridación, se puede optimizar para cada gen o tejidos para disminuir o aumentar el rigor de la hibridación. También la etapa de tratamiento de la proteasa es una variable y se puede cambiar para adaptar el protocolo de diferentes especies de plantas o para la detección de las transcripciones con muy escasa. La inclusión de las dos sondas de control positivo y negativo será útil para identificar los puntos problemáticos del protocolo.

El procedimiento ha sido optimizado para parafina secciones de tejidos de plantas, pero con pequeñas modificaciones se puede utilizar también para todo el montaje hibridación in situ. Aunque se utiliza mucho en la investigación con animales, ^{19 de} monte se hibridación in situ se limited a los tejidos vegetales que pueden ser fácilmente infiltrados, como los embriones, las raíces o los jóvenes tejidos meristemáticos ^20,21. El protocolo también se puede modificar fácilmente para detectar simultáneamente dos ARNm diferentes transcripciones o localizar junto a las proteínas ^15,22,23. Finalmente, es posible extender la aplicación de este método para la visualización de patrones de expresión de ARN pequeños en plantas. los patrones de expresión de miRNA se han determinado utilizando este protocolo, tanto en maíz y Arabidopsis ^8,14. Más recientemente, el de las sondas in vitro transcritas han sido sustituidos por comercialmente disponibles marcada con DIG ácido nucleico cerrado (LNA) sondas oligo que aumentan la sensibilidad de la señal ^{18, 24.}

No hay conflictos de interés declarado.

Investigación en el laboratorio de MT es apoyado por becas de la National Science Foundation (DBI-0820610 y IOS 1022102) y el Departamento de Salud de Nueva York (NYSTEM-C024308). CM recibió becas postdoctorales del Ministerio español de Educación y Ciencia (2007-0937) y la Fundación Rafael del Pino, España.

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