En allmän metod för att utvärdera Inkubation av Sackaros Craving på råttor

1. Djurförsök

1. Man Lång-Evans råttor är 3 månader gamla i början av en studie. Råttor är Simonsen-derived (Gilroy, Kalifornien, USA) som föds upp i Western Washington University vivarium och förvaras separat på en 12-h bakåt dag / natt cykel (belysningen på 0700) med Purina Mills Inc. Mazuri gnagare pellets (Gray Summit , MO, USA) och vatten finns tillgängliga ad lib.
2. All träning och testning sker mellan 0900-1300 med kohorter av råttor alltid utbildade och testade på samma gång dagligen.
3. Råttor vägs varje måndag, onsdag och fredag ​​under hela studien.
4. Omedelbart före utbildningen fasen råttor berövas vatten i ca 20 timmar för att uppmuntra sackaros självstyre på den första dagen av utbildning.

2. Behavioral Rutiner

Alla operant beteende procedurer använda standard operant betingning kamrar (Med Associates Inc., St Albans, VT, USA) med en infusionspump (Razel vetenskapliga instrument, St Albans, VT, USA) ligger på toppen av varje operant betingning kammare. Operant betingning kamrarna är inneslutna i ljud-dämpning skåp med ventilationsfläktar (Western Washington University, USA). Alla experimentella förhållanden och datainsamling styrs Med PC IV-programmet (Med Associates Inc., St Albans, VT, USA).

Operant betingning kamrarna (30 x 20 x 24 cm) innehåller två spakar (en stationär och en infällbar), en tongenerator, en vit stimulans lampan ovanför infällbara spaken och ett rött hus ljus på den motsatta väggen. Den infusionspump levererar sackaros till en belöning behållare till höger om den aktiva spaken. Spakarna är 10 cm från nätet golvet. Fyra infraröda photobeams crisscross varje kammare. De främre balkar är var 10,5 cm från sidoväggarna och den sida balkar respektive 6 cm från sidoväggarna. Varje balk är 4,5 cm ovanför rostfritt stål golvet. Balkarna enre in för att räkna antalet kompletta raster. Det totala antalet balk pauser registreras under träning och begäret Testing.

Med undantag av vatten restriktioner före första träningspasset, är råttor som mat och vatten ad libitum både i hemmet burar och i operant betingning kamrarna. Chambers är i en särskild testrum att, som med vivarium, är på en omvänd ljus cykel. Råttor transporteras i hemmet burar mellan rummen på en vagn som är täckt med ljus blockerar tyg. Vid slutet av varje session är råttor tillbaka till hem burar.

Det finns tre faser att den typiska experiment: Utbildning, Forced avhållsamhet, och testning. Testning är sessionen där begäret bedöms. Vi bedömer begäret i två allmänna testmetoderna, beroende på studien. Dessa två förfaranden beskrivs i avsnitt 2.3.1 och 2.3.2.

1. Utbildning
   1. I det typiska experimentet råttor spendera 2 timmar / dag10 dagar i följd i operant betingning kammare där de får trycka på indragbara (aktiv) hävstång för en 0,2 ml leverans av 10% sackaroslösning i uttaget till höger om spaken.
   2. Detta svar aktiverar även en förening stimulans som består av en ton (2 kHz, 15 dB över omgivande buller) och det vita ljuset. Substansen stimulans varar i 5 sekunder och följs av en 40-s time-out, då pressar på aktiva spaken är inspelade men har ingen programmerad följd.
   3. Ett svar på den inaktiva (stationär) spaken har ingen programmerad följd, men pressar registreras. Antalet balk pauser registreras under utbildning och testning. Alla svar och rörelseapparaten åtgärder redovisas som tidsförlopp (2 minuter fack), men är ofta redovisas som uppgår per session.
2. Tvingad avhållsamhet. Råttor kvar i hemmet burar för den tid tvingades avhållsamhet. Den typiska tvingades avhållsamhet perioder som vi använder är att ha råttor testat the dagen omedelbart efter den sista dagen av utbildning (dag 1 av påtvingad avhållsamhet) eller 30 dagar efter den sista dagen av Training (Dag 30 av påtvingad avhållsamhet).
3. Testa
   1. Utrotning utan ledtrådar. I det här testproceduren är råttor first får trycka på aktiva spaken under förhållanden identiska Träning med undantag för att svaret har inga konsekvenser och sessionen är 1 h. Råttor erfarenhet minst sex av dessa utdöende sessioner på testdagen. Varje utrotning session är åtskilda av en 5 minuters period där den aktiva spaken dras tillbaka och huset ljuset är avstängd. "Utrotning" är indicerat om aktiv spak svara har minskat till mindre än 20 pressar / h. Vissa råttor kräver en sjunde möte. Nästa session (efter ytterligare fem minuters fördröjning) är det Testing session där råttor kan sedan trycka på ton + ljus kö som ursprungligen kopplades ihop med varje leverans av sackaros under träning.
   2. Utrotning med ledtrådar. I detta förkortad Provningsförfarande, råttor är tillåtna att trycka på aktiva spaken under förhållanden identiska med träning förutom att sackaros inte levereras.
4. Inaktiva spaken trycka används som ett mått på spak diskriminering. Det är också, tillsammans med photobeam raster, används som ett mått på icke-specifik motor aktivering. Motoriska vs motiverande förändringar försvårar tolkningen av begäret beteende. Den inaktiva spaken svara och photobeam uppgifter bryta är användbara för att klargöra motorn kontra motivation bidrag till begäret, liksom jämförelsen grupper i farmakologiska studier där råttor svarar på en hög skattesats för sackaros eller annan mat utmanas med en potentiell begäret drabbar förening (t.ex. ^{7 , 8).}

3. Representant manipulationer för att Affekt Sackaros Craving efter olika varaktighet Forcerad Avhållsamhet

Den allmänna metod som beskrivs här är ett sätt att söka av beteendemässiga och neurobiologiska bestämningnätter av begär efter varierande perioder av påtvingad avhållsamhet. Som beskrivs här är metoder relaterade till representativa resultat som anges i avsnitt 4.

1. Mättnadskänsla. Vissa råttor fick flaskor 10% sackaros i deras hem burar för 17 timmar omedelbart före provningen 8. Råttor i denna studie testades med Extinction utan ledtrådar förfarande.
2. Miljöberikning. Under forcerad avhållsamhet perioden förblev några råttor i enskilda bostäder (kontroller) medan andra har flyttat in i en stor (36 "bredd x 20" djup x 40 "height; Kvalitet Cage Products, Portland, OR, USA) bur med tre kohorter (Enriched). anrikat djuren hade flera leksaker i sin omgivning, inklusive PVC-slangar och fick även nya leksaker varje M, W, F ^10. Råttor i denna studie testades med Extinction utan ledtrådar förfarande.
3. Farmakologisk utmaning. På Test dagen, råttor förbehandlas med en dos av dopamin D1 antagonisten SCH 23.390. Råttor i denna studie Were testats med Extinction med signaler förfarande.

4. Representativa resultat:

Figur 1 representant Utbildning och data Test för en inkubationstid av sackaros begäret experiment.

Datapunkter indikerar betyder ± SEM. Gruppstorlek för Figur 1a är 77 råttor och Figur 1b gruppstorlekar varierade från 11-12 per grupp. * Signifikant skillnad från dag 1, p <0,05. Denna siffra är anpassad från data i ⁸ med tillstånd av Springer.

Figur 2 Effekt av sackaros mättnadskänsla om sackaros sug efter 1 eller 30 dagar av påtvingad avhållsamhet. Gruppstorlekar är 8-9 per grupp. * Signifikant skillnad från Dag 1 grupp, † signifikant skillnad från kontrollgruppen, p <0,05. Denna siffra är anpassadfrån ⁹ med tillstånd av Elsevier.

Figur 3 En månad av miljöberikning minskat sackaros begäret. Gruppstorlekar är var 8 råttor. * Signifikant skillnad från dag 1, † signifikant skillnad från kontrollgruppen, p <0,05. Denna siffra är anpassad från ¹⁰ med tillstånd av Wolters Kluwer Health.

Figur 4 Systemisk SCH 23.390 minskat sackaros begäret mer effektivt efter en dag av påtvingad avhållsamhet. Gruppstorlekar är 8-12 per grupp. * Signifikant skillnad från Dag 1 grupp, † signifikant skillnad mellan 0 dos-gruppen, p <0,05. Denna siffra är anpassad från ⁸ med tillstånd av Springer.

1. Figur 1 visar representativa utbildning och prov data för råttor själv administrera sackaros (Figur1 TOP) och sedan svara i Extinction med sackaros-parade Cue finns (Figur 1 botten). Som framgår, råttor reagerar selektivt på aktiva spaken under träning och under testningen. Intressant inaktiva svara och rörelseaktivitet visa lite inkubation, även om effekten är mest robusta på aktiva spaken svara.
2. Figur 2 visar effekten av mättnadskänsla med sackaros om sackaros sug efter 1 eller 30 dagar av påtvingad avhållsamhet. Mättnadskänsla minskas Extinction utan ledtrådar svara efter någon period av påtvingad avhållsamhet, men bara minskat svarar för sackaros kö ensam i råttor som bara hade en dag av påtvingad avhållsamhet.
3. Som framgår av Figur 3, minskad miljöberikning inkuberas Extinction utan kö svarar och svarar för sackaros kö ensam beteenden till nivåer som hittas efter bara en dag av påtvingad avhållsamhet.
4. Figur 4 visar ett abstinens-beroende effekten av SCH 23.390 på Extinction med signaler svara. SCH 23.390 var mest eftiva till att minska sackaros begäret efter 1, jämfört med 30, dagar av påtvingad avhållsamhet.

De förfaranden som vi beskriver här kunde identifieras som återanställning förfaranden, även om det är tekniskt korrekt, eftersom hävstång trycka på den vita inte är släckt innan begäret testsession. I en typisk återanställning förfarande, svarar med belöning-parade ledtrådar släckas och sedan "återinföras" med administrering av en icke-kontingent presentation av belöning (priming-inducerad återanställning) eller en stressfaktor som footshock (stress-induced återanställning) ^11. Utrotning av spaken trycka ensam följt av tillgång till kön (punkt 2.3.1) är det närmaste approximation till återanställning. Trots de förfaranden som vi beskriver möjliggör mätning av målinriktat svarar för en sackaros-parade kö. Operativt är detta beteende kö-enhanced "suget" beteende som kan vara relevanta för återfall beteenden ^4,12-14.

Det finns vissa praktiska fördelar med Extinction med ledtrådar förfarande (ITEm 2.3.2) över utrotning utan ledtrådar följt av tillgång till kön förfarande (punkt 2.3.1). Med den senare metoden, inte släcka några råttor inte kriteriet i sex sessioner och detta kräver en extra utrotning session. Däremot ger den 2 h Extinction med köer förfarande en förutsägbar tidsram för bedömning av begär och är därför mer mottaglig för konstruktioner där exponering för självstyre sammanhang bör hållas konsekvent mellan ämnen och förhållanden. Ett exempel på en sådan studie skulle vara en där hjärnvävnaden samlas omedelbart vid slutet av en längtan session för senare bedömning av omedelbara och början av genuttryck.

En begränsning av Extinction med ledtrådar förfarande är att kontextuella och diskreta ledtrådar presenteras tillsammans. Därför tolkning av bidrag kontextuella vs diskreta ledtrådar till begäret beteende och hjärnan molekylära förändringar kommer att komma på skam. Detta kan vara särskilt viktigt i molecular studier som bevis finns för en dissociation mellan neurala substrat av sammanhang jämfört med diskreta cue-medierade lärandet ^15,16.

Slutligen är en allmän begränsning av en påtvingad avhållsamhet förfarande när det gäller upprepade tester mönster som "avhållsamhet" frågor. Som svar på den vita ökar med tiden. Därför tillåter inte denna modell inte meningsfullt upprepad testning av ämnen, om inte tiden mellan proven tas i beaktande.

Sammanfattningsvis ger inkubering av sackaros begäret förfarande en modell av tidsberoende ökning suget beteenden som kan bidra till den känsliga naturen av missbruk. Generellt sett har modellen rimlig prediktiv validitet, delvis på grund av att ha väl validerade återanställning modell som kärna ^4,17,18. Använda inkubering av sackaros begäret modell för att söka av beteendemässiga och neurobiologiska faktorer inkubationstiden kan ge inblick i novel behandlingsmetoder för beroende.