Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

1. Preparação da solução Methocel (500 mL)

1. Autoclave g 6 de metilcelulose em uma garrafa de 500 ml contendo um agitador magnético.
2. Dissolver a metilcelulose em 250 ml de DMEM/F12 pré-aquecido sem soro (60 ° C) por 20 min.
3. Adicione 250 ml de DMEM/F12 (RT), contendo soro de cavalo 10%. Misturassem durante a noite (4 ° C).
4. Clara a solução por centrifugação (5000g, 2h, 4 ° C).
5. Tome a solução clara e altamente viscoso para um novo tubo (cerca de 90-95% da solução-mãe).
6. Armazenar a 4 ° C até o uso.

2. Cultura esferóide

1. Prepare uma solução de 20% Methocel (10 ml e 40 Methocel meio de crescimento ml).
2. Lave as células duas vezes com PBS, adicionar 0,1% de tripsina e células incubar a 37 ° C
3. Ressuspender as células em meio de crescimento e contagem das células.
4. Prepare uma suspensão de 10 000 células por ml em Methocel 20%.
5. Adicione a suspensão de células para o fundo s 96 bem rodadaplacas USPENSÃO (100 l por poço).
6. No dia seguinte, verificar a formação de esferóides nas placas de suspensão. Esferóides estará pronto para uso após 1-3 dias.

3. Preparação de colágeno

1. Prepare uma solução sobre o gelo, de 8 de colágeno ml, 1 ml PBS 10x, 1 ml NaOH 0,1 N e 3 gotas 0,1 N HCl. Verifique se o pH é de 7,4 por manchar um pouco da solução em tiras indicador de pH. Ajustar o pH se fora do intervalo.
2. Adicionar 50 ml de solução de colágeno neutralizado nos poços de uma placa de 96 poços
3. Incubar a 37 ° C até que o colágeno é solidificada (90 min).
4. Prepare-Methocel colágeno ligante soluções no gelo: para cada ligante parte 1 de pipeta de solução de colágeno. Adicionar 20 ml por ng de colágeno TGF-β. Após a diluição com Methocel e difusão sobre as diferentes camadas, a concentração final de TGF-β será de 5 ng / ml Mix em vortex. Adicionar 1 parte de Methocel solução. Misturar em vortex.

4. Esferóide incorporarding

1. Coloque uma ponta de 200 mL, que tem cerca de 5 mm da ponta cortada, em uma pipeta de 200 mL. Sugar um esferóide com a pipeta e cuidadosamente dispensar o meio em um prato vazio. Observe se o esferóide fica dentro da ponta. O esferóide é visível como um ponto branco. Sem soltar o êmbolo, sugar até 100 mistura de colágeno Methocel-L e dispensar o esferóide na mistura de colágeno em colágeno revestido-96 também. Faça isso por 12 esferóides para cada condição.
2. Deixe colágeno solidificar pelo menos 30 minutos a 37 ° C
3. Remover bolhas de ar com uma ponta de 200 mL.
4. Adicionar 50 ul de meio com soro 1,6% e inibidores dissolvido em DMSO. Para SB-431542 adicione 4 ml de solução estoque (10 mM) a 1 ml de meio. Depois de difusão, a concentração final do inibidor será de 10 mM. TGF-β e inibidores vai manter o curso do experimento. Tirar fotos dos esferóides sob o microscópio usando aumento de 40 vezes.
5. Depois de 48h de estimulação com TGF-β e / ou inibidores, tirar fotos dos esferóides sob o microscópio usando aumento de 40 vezes.
6. Medir a área dos esferóides invadindo após 2 dias e subtrair a área inicial. Medir a área de um esferóide: imagem do Aberto do esferóide em Adobe Photoshop Extended (figura 2A) e selecione a ferramenta de seleção rápida (figura 2B). O ponteiro do mouse se transforma em um círculo com um 'plus' (+) sinal (figura 2C). Enquanto arrasta o cursor sobre o esferóide, Photoshop irá reconhecer as fronteiras do esferóide. Se uma área fora do esferóide é selecionada, esta região pode ser excluído da seleção pressionando a tecla Alt ou usando a ferramenta de seleção negativa que é indicado por um sinal - na barra de ferramentas (). O cursor muda para um círculo com um "menos" (-) sinal e arrastando o cursor sobre a área selecionada erroneamente, esta área é removida da seleção (figura 2D). Se necessário, várias regiões podem ser selecionados pressionando o Shift botão. Para trabalhar com mais precisão, o tamanho do ponteiro do mouse pode ser ajustada alterando o diâmetro da escova na barra de ferramentas (Figura 2E). Quando o esferóide todo é selecionada, a área da seleção é calculada através da análise MEDIDA na barra de menu ou pressionando Ctrl + Shift + M (Figura 2F). A janela de gravação de medição aparecerá mostrando o nome do arquivo e da área da seleção em pixels, assim como outros dados (figura 2G). Se várias seleções são medidos, a primeira linha mostra a soma de todas as áreas. As medições das seleções individuais são apresentados nas linhas abaixo. Os dados de todas as medições podem ser exportados para um arquivo de texto e aberto em Excel.

5. Resultados representativos:

Um exemplo do ensaio esferóide com MCF10A1 (M1), as células epiteliais mamárias normais, H-RAS transformou MCF10AneoT (M2) e M2 células derivadas MCF10CA1a (M4) é dada na Figura 3. Células M1 apresentaram apenas invasão fracos semestimulação, mas invadiu significativamente melhor após estimulação por TGF-β. Em contraste, a RAS-transformado M1-M2 derivados já invadiu de forma eficiente, sem adição de estímulos, e isso aumentou ainda mais vezes 4-5 sobre TGF-β tratamento. Células M4 apresentou o maior invasão, com e sem TGF-β disso.

Em seguida, examinamos se poderíamos interferir com TGF-β induzida por invasão neste modelo esferóide uso de inibidores químicos. Para isso, usou SB-431542, um análogo de ATP e inibidor seletivo da atividade da quinase de TβRI, bem como ativina tipo IB receptor (ActRIB) e activina receptor-like kinase (ALK) 7 ^12. Como esperado, SB-431542 inibiu TGF-β induzida por invasão de M1, M2 e M4 células (Fig. 4), indicando que a invasão TGF-β-induzida é TβRI kinase-dependente. Além disso, a invasão dos esferóides basal também foi fortemente inibida, sugerindo que a invasão basal também é deindependentes em TGF-β.

Figura Fluxograma 1. Do ensaio 3D esferóide. Primeiro, as células são banhados sob condições não-aderentes em placas em forma de u suspensões. Células aggregrate em esferóides multcellular e pode ser incorporado em uma matriz de colágeno. Para esta matriz de colágeno, que são capazes de invadir.

Figura 2. Quantificação da área do esferóides usando o Adobe Photoshop Extended. (A) A imagem do esferóide é aberto no Adobe Photoshop Extendend Selection (B) da ferramenta de selecção rápida (C) Arrastar o cursor sobre o esferóide para selecionar a área da remoção (D) esferóide de uma área wongly incluído usando a negativos de selecção rápida ferramenta de ajuste (E) do tamanho do pincel da ferramenta de seleção rápida de forma mais precisa selecionar a área (F) Selecção domedição de comando para gravar (G) Exemplo de um registro de medição.

Figura 3. TGF-β induzida por invasão de esferóides de MCF10A1 espontaneamente imortalizado (M1) (A), RAS-transformado MCF10AneoT (M2 (B) e seus derivados MCF10CA1a metastático (M4) (C). M1, M2 e M4 esferóides embutidas em colágeno foram tratados com 5ng/ml de TGF-β por 48h, conforme indicado. AC Representante imagens tomadas no dia da incorporação e dois dias depois. D invasão relativa diferença foi quantificada como área no dia 2 de menos dia 0. Os resultados são expressos como média ± sd Adaptado de ^13.

Figura 4. Invasão esferóide Basal e TGF-β induzida é inibida by SB-431542. Esferóides M1, M2 e M4 foram incorporados em colágeno e tratados com TGF-β 5ng/ml e / ou 10 mM SB-431542, conforme indicado. Imagens representativas tomada após dois dias (A). Invasão relativa diferença foi quantificada como área no dia 2 de menos dia 0 (B). Os resultados são expressos como média ± sd Adaptado de ^13.

Nós estabelecemos um modelo esferóide em que MCF10A1 células e seus derivados malignos invadem em uma matriz de colágeno de uma forma TGF-β-dependente. Primeiro, esferóides são formados em placas redondas de 96 poços de fundo de suspensão na presença de metilcelulose. Naturalmente, também em forma de U poli-HEMA placas revestidas podem ser usados ​​para esta finalidade. Metilcelulose é absolutamente necessário nesta etapa, já que as células morrerão na ausência de metilcelulose. TGF-β é adicionado diretamente à mistura de colágeno-Methocel desde que descobriram que as células responderam tão bem ao TGF-β, quando este fator foi adicionado ao topo op meio do colágeno. No entanto, é aconselhável acrescentar inibidores químicos dissolvidos em DMSO não diretamente no colágeno, uma vez que o DMSO precipita na mistura de colágeno Methocel-icecold. Portanto, adicionar estes compostos no meio em cima do colágeno.

Posteriormente, as células são incorporados em um colágeno 3-Dimensional ambiente para permitir que eles invadem a matriz de colágeno. Ao comparar as propriedades invasivas das diferentes linhagens de células MCF10A1 descobrimos que a invasão basal, bem como TGF-β induzida pelo aumento da invasão das células relativamente benigno M1, a níveis mais elevados no derivado RAS-transformado M2, para níveis ainda mais elevados no metastático variante M4. Assim, as propriedades invasivas correlacionada com o estado relativo de agressividade dessas três linhas de células ^7,8,14.

A incorporação do esferóide para o colágeno é um passo crítico no ensaio. A detecção do esferóide na ponta da pipeta pode ser difícil quando a realização do teste para o primeiro poucas vezes. É possível evitar este coletando os esferóides em um tubo, girando-os para baixo, retirando o sobrenadante e ressuspender o esferóides em colágeno Methocel-mistura. Isto requer esferóides mais como entrada como cerca de 50% dos esferóides é perdida durante esse processo. Além disso, váriosesferóides pode acabar em um bem e poderia estar muito próximos uns dos outros para analisar. Além disso, é preferível ter não mais do que um esferóide por poço para evitar a possibilidade de que esferóides podem interferir uns com os outros (por exemplo, fatores de crescimento secretoras). Portanto, o passo a ressuspensão é um passo crítico usando este método.

Uma limitação deste ensaio é que analisamos um ensaio de três dimensões em um plano de 2 dimensões. Como pode ser visto nas Figuras 3 e 4, a maioria das células geralmente invadem no mesmo plano. No entanto, esferóides que estão localizados muito perto da borda do poço invadir geralmente mais em profundidade e são por isso excluídos da análise. É claro que seria possível realizar a análise em 3D, a fim de obter um resultado mais preciso. Mas isso requer hardware sofisticado e software e os benefícios de cálculo de volume em vez de usar a área não pode superar o problema. Especialmente desde que descobrimos que a variação no tamanho de partidados esferóides 3-dimensional, medida em 2D, é geralmente apenas 5-10%.

Outra desvantagem deste método é que a imagem é um passo demorado, uma vez que o esferóides estão localizados em diferentes alturas, o que dificulta imagem automatizado. Também a etapa de análise é demorado e requer imagens com bom contraste de esferóide à matriz, a fim de fazer uso da capacidade Photoshops para reconhecer automaticamente a fronteira do esferóide. No caso de o contraste é muito baixo, pode-se facilmente adaptar o brilho eo contraste usando a comandos Levels e Curves no Photoshop. Outra forma de aumentar o contraste seria o uso de um corante vital fluorescente.

Como uma forma alternativa de quantificação, pode-se chamar a área em torno do esferóide manualmente usando Image J. um adiantamento de Imagem J é que é freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/). No entanto, encontramos o desenho manual da forma irregular da esferóides invadido em Image Jum passo demorado comparado a ferramenta de seleção rápida Photoshop.

O protocolo pode ser adaptado para investigar invasão de outras linhagens celulares, desde que as células são capazes de formar spheroids.Furthermore, a concentração ótima de TGF-β de induzir a invasão da linha celular pode ser diferente. Em todas as nossas linhas de celular, TGF-β induz invasão a 5 ng / ml, embora M4 tem melhor desempenho quando se usa 2 ng / ml.

Além disso, este ensaio pode ser adaptado para medir as respostas invasiva para outros fatores de crescimento, como fator de crescimento epitelial (EGF) ou fator de crescimento de hepatócitos (HGF).

Em nossos ensaios a invasão basal e TGF-β induzida foi fortemente inibida pelo tratamento com SB-431542, um inibidor do receptor do tipo I para TGF-β. Esta é uma prova de princípio de que os inibidores químicos podem ser usados ​​neste ensaio. Inibidores químicos, tais como inibidores de MMP, também têm sido utilizados com sucesso em concentraçãoções recomendadas pelo fabricante para cultura de células em monocamada.

Após dominar esta técnica, pode-se testar o efeito de inibidores químicos knockdown, ou superexpressão de genes na invasão. Além disso, pela ampliação do ensaio para um formato de 24 poços, pode-se isolar RNA usando um método de fenol-clorofórmio-based (por exemplo Trizol ® ou Tripure) seguido por uma coluna de sílica baseada em clean-up. Este RNA pode ser usado para quantitativa PCR em tempo real.

Nosso ensaio invasão esferóide assemelha-se ao vivo no processo mais de perto do que os modelos 2D invasão, porque as células em esferóides estão em diferentes estados metabólicos e interagir de forma mais natural com os seus arredores ^10. Efetuamos iodeto de propídio e coloração de diacetato de fluoresceína para verificar se há células vivas e mortas, após teste de invasão e observou que, à semelhança da situação in vivo, as células no centro estão mortos e necróticas, enquanto as células em tele borda externa são metabolicamente ativo.

Nós usamos o colágeno tipo I em vez de Matrigel, porque vários relatórios têm mostrado que a composição da matriz extracelular no câncer de mama é frequentemente alteradas, resultando em fibrose focos dura com uma alta de colágeno I conteúdo. Tem sido demonstrado que o aumento do colágeno I conteúdo promove a formação de câncer de mama e invasão ¹⁵ e está associada a maior incidência de metástase ^16. Muitas células tumorais, assim, ter de invadir através de um ambiente rico de colágeno I, a fim de metástase.

Vários modelos 3D foram desenvolvidos ao longo das últimas décadas. As células podem ser totalmente incorporado dentro de uma matriz ou colocada em cima de uma matriz ou um andaime poliméricos ^17,18. Em um modelo 3D desenvolvido pela Bissell e colegas de trabalho, as células foram cultivadas em um porão de matriz de membrana reconstituído (RBM). Este modelo fornece um ensaio rápido para distinguir entre normais e malignasepitélio mamário, mas centra-se na morfologia celular ^19,20. Morfogênese e organização das linhas de células distintas MCF10A inversamente correlacionadas com malignidade ^21,22. Em outros modelos 3D esferóides multicelulares mostrou a mesma resistência a drogas citotóxicas como sua linha de células in vivo dos pais, enquanto que as células em monocamadas não conseguiu fazê-lo ^11. Também culturas de linhas celulares 3D MCF10A têm sido utilizados para avaliar a sensibilidade à quinase inibidores da ^23. Nosso modelo de esferóide complementa estes ensaios por focalizando especificamente invasão.