The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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1Saskatoon Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 2Department of Veterinary Microbiology, University of Saskatchewan, 3Plant Biotechnology Institute, National Research Council of Canada
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Dumonceaux, T. J., Town, J. R., Hill, J. E., Chaban, B. L., Hemmingsen, S. M. Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres. J. Vis. Exp. (56), e3344, doi:10.3791/3344 (2011).
इस विधि Dumonceaux एट अल की रिपोर्ट में अनुसंधान के क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया था. जे क्लीन. Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).
समग्र प्रक्रिया चित्रण एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में प्रस्तुत किया है.
1. मनका युग्मन
यह polystyrene Luminex मोती के लिए oligonucleotide जांच युग्मन (तालिका 2 देखें) के लिए इस्तेमाल किया जा तरीकों का वर्णन करता है. खंड थोड़ा नए कब्जा जांच के मूल्यांकन के लिए अनुकूलित कर रहे हैं एक परीक्षण के आधार पर, इन संस्करणों कोष्ठकों में संकेत कर रहे हैं.
2. Chaperonin सार्वभौमिक 60 (cpn60 यूटी) amplicon उत्पादन और एकल किस्में के उत्पादन लक्ष्य.
3. Oligonucleotide युग्मित polystyrene मोती के लिए एकल असहाय पीसीआर उत्पाद के संकरण.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
इस परख के विकास और कार्यान्वयन में हमारे लक्ष्यों में से एक के लिए यह सरल और संभव के रूप में सुव्यवस्थित रूप बनाने के लिए किया गया था. इसलिए हम महत्वपूर्ण बाद प्रवर्धन कदम अनुकूलित T7 exonuclease उपचार समय और संकरण समय सहित क्रम में करने के लिए एक परख है कि एक उचित समय सीमा में पूरा किया जा सकता है है विकसित. चित्रा 2A में दिखाया गया है, amplicon के T7 उपचार संकेत पीढ़ी के लिए आवश्यक है, के रूप में सबसे अधिक जांच कम या कोई T7 उपचार के साथ कम या कोई संकेत था. संकेत लगभग 40 मिनट तक रैखिक वृद्धि हुई है, जो समय पर संकेत वृद्धि धीमी हो गई. संकेत का कोई गिरावट भी T7 उपचार समय के 2 घंटे में मनाया गया, यह दर्शाता है कि प्राइमरों की phosphorothioate संशोधन अत्यधिक targe को रोकने में कारगर हैटी कतरा गिरावट के रूप में वर्णित 15. हम T7 उपचार समय के लिए 40 मिनट चुना करने के लिए समग्र प्रोटोकॉल समय कम से कम, लेकिन यह चित्रा 2A से स्पष्ट है कि T7 उपचार पर बहुत देर के लिए जा सकते हैं. हम भी संकेत पीढ़ी (चित्रा 2B) संकरण समय के प्रभाव को निर्धारित किया और पाया कि 10 मिनट अधिकतम संकेत के लिए पर्याप्त था, संकरण के 4 घंटे के बाद भी संकेत में कोई आगे बढ़ाने के रूप में मनाया गया. इसलिए, एक 10 मिनट संकरण कदम चुना था, फिर से समग्र परख समय कम से कम. मन में, और InstaGene (जैव रेड) के रूप में तेजी से डीएनए निष्कर्षण तकनीकों के साथ इन परिणामों के साथ, डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर, और Luminex विश्लेषण सहित समग्र परख 4-5 घंटे में पूरा किया जा सकता है.
एक सजग नोट पर, एक Luminex या BioPlex रन के दौरान polystyrene मोतियों की एकत्रीकरण का स्तर परख की दक्षता पर एक प्रमुख प्रभाव हो सकता है. BioPlex सॉफ्टवेयर मनका एकत्रीकरण का स्तर है, जो जब तब होता है प्रदर्शित करेगामनका एक से अधिक लेजर पथ और कुल से संकरण संकेत के अपवर्जन में परिणाम में पाया जाता है. मनका स्पष्ट एकत्रीकरण भी है कि एक एकल मनका के लिए उचित आकार नहीं है किसी भी बात कण द्वारा कारण किया जा सकता है, और भी हवाई बुलबुले की वजह से किया जा सकता है. इन घटनाओं से किसी में, मनका कुल, हवा बुलबुला, या कण से संकेत खारिज कर दिया है. ज्यादातर मामलों में, हम पाते हैं कि मनका एकत्रीकरण कम से कम है (चित्र 3A) और प्रत्येक मनका के लिए 100 की गिनती की घटनाओं के लक्षित स्तर को आसानी से प्राप्त है. कभी कभी, तथापि, मोती (3B चित्रा) उदारवादी या गंभीर एकत्रीकरण के स्तर (चित्रा 3C) दिखा. इन मामलों में, के बाद से डेटा की सबसे खारिज कर दिया है, साधन हो सकता है मुसीबत मनका प्रकार प्रति 100 घटनाओं और परिणाम तक पहुँचने संदिग्ध हो सकता है. sonication कदम (3.2 कदम) मनका एकत्रीकरण कम से कम का मतलब है. इसके अलावा, एक पतला microsphere मास्टर मिश्रण (1.20 कदम) के रूप में मोती का भंडारण मदद मिल सकती है. हम hybri से देखा है कि को छोड़कर TMACdization बफर SA पीई बजाय मंदक (3.5 कदम) को जोड़ने मनका एकत्रीकरण कम से कम करने में मदद करता है. इसके अलावा, जब तक हम इस परीक्षण नहीं किया है, नए चुंबकीय मोती Luminex या BioRad से उपलब्ध करने के लिए एक प्रवृत्ति की कुल के लिए कम प्रदर्शन लगा रहे हैं.
एक 5-plex Luminex जी लक्ष्यीकरण सरणी के आवेदन के परिणाम vaginalis ए, vaginae एल, iners, एल. crispatus, और एल इसी ग्राम दाग योनि स्मीयरों झाड़ू के साथ साथ gasseri चित्रा 4 में दिखाया जाता है. इन नमूनों कई बिंदुओं पर समय एक ही व्यक्ति से ले जाया गया. 0 समय, व्यक्ति ग्राम दाग पर आधारित BV के साथ का निदान किया गया (चित्रा -4 ए) और इस एक ही नमूना (4B चित्रा) से Luminex परिणाम है कि सरणी, जी में प्रतिनिधित्व जीवों के शो vaginalis सबसे अधिक प्रचलित था, जबकि ए vaginae और एल. iners भी सकारात्मक थे. नौ दिन बाद, व्यक्ति अभी भी था BV सकारात्मक और एसजी के लिए ignal vaginalis काफी वृद्धि हुई है, जबकि ए vaginae और एल. iners अभी भी सकारात्मक थे. महत्वपूर्ण बात, इस समय के बाद व्यक्ति एक सामान्य microbiota संक्रमण के रूप में शुरू किया ग्राम सकारात्मक बेसिली स्मीयरों में detectable बन गया (4A चित्रा) जी के लिए संकेत है जबकि vaginalis कम हो और एल के लिए संकेत iners वृद्धि हुई है (4B चित्रा). हमारे इस विधि 13 (जी vaginalis और / या ए vaginae के लिए सकारात्मक नमूने थे BV सकारात्मक माना) के साथ BV के मूल परिभाषा के अनुसार, इस व्यक्ति सभी समय बिंदुओं पर सकारात्मक BV था, हालांकि ग्राम जी का पता लगाने में विफल रहा दाग बाद के दो समय अंक में vaginalis. साथ Luminex विधि यहाँ वर्णित है, रुझान आसानी से अनुक्रमण आधारित विधियों के तुलना में किया जा सकता है, और Luminex परख के परिणाम आम तौर पर ग्राम दाग 13 परिपुष्ट करना, जबकि जीव पहचान और बहुतायत पर अतिरिक्त जानकारी प्रदान.
चित्रा 1 Luminex एक जटिल नैदानिक या पर्यावरणीय नमूने के microbiota प्रोफ़ाइल का निर्धारण करने के लिए प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध आरेख. प्रोटोकॉल है कि ब्याज के नमूने से निकाला गया है टेम्पलेट डीएनए के साथ शुरू होता है. (1) टेम्पलेट डीएनए से पीसीआर उत्पाद का उपयोग उत्पन्न कतरा - विशिष्ट biotinylated, phosphorothioate संशोधित cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों पीसीआर असंशोधित cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों पीसीआर प्राइमरों (तालिका 1) के साथ मिलकर प्राइमरों, (2) यह एक पीसीआर उत्पाद के साथ microbiota का प्रतिनिधित्व पूल उत्पन्न बायोटिन एक कतरा पर संशोधन phosphorothioate, (3) T7 exonuclease, जो संशोधित कतरा phosphorothioate नीचा नहीं है और इसलिए एकल असहाय डीएनए कि बायोटिन के साथ 5 'अंत में संशोधित किया गया है उत्पन्न कर सकते हैं के साथ डबल असहाय पीसीआर उत्पाद डाइजेस्ट, (4) युगल प्रजातियों विशिष्ट cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों के जांच के लिए polystyrene मोती - प्रत्येक मनका एक अनूठा वर्णक्रमीय (मनका रंग से इंगित) पता है कि मैंLuminex या जैव - Plex साधन द्वारा discernable, (5) एकल असहाय पीसीआर प्रजातियों विशिष्ट oligonucleotide युग्मित मोतियों के सूट करने के लिए ब्याज के नमूने से उत्पन्न उत्पाद संकरण, (6) streptavidin phycoerythrin संयुग्म है कि बांध जोड़ें biotinylated एकल असहाय पीसीआर उत्पाद और संकरण का एक संकेतक के रूप में कार्य करता है, (7) वर्णक्रमीय पता (मनका पहचान) और संकरण संकेत तीव्रता एक Luminex या जैव - Plex साधन का उपयोग करते हुए निर्धारित. प्रत्येक मनका पहचान के लिए कम से कम 100 मोती गिने जाते हैं और phycoerythrin संकेत के बीच का प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) आउटपुट के रूप में सूचना दी है. को 100 विभिन्न मनका प्रकार के एक साथ मूल्यांकन किया जा सकता है लेकिन एक मनका तीन प्रकार के भेदभाव दिखा परख सचित्र है. (8) जब पीसीआर के एमएफआई ही नमूना से उत्पन्न प्रतिकृति मनका के लिए एक दिया नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में काफी अधिक है (एक पूंछ छात्र टी परीक्षण, पी <0.05), नमूना उस जीव के लिए सकारात्मक माना जाता है.
चित्रा 2 Luminex परख मापदंडों का अनुकूलन. पांच अलग Peptostreptococcus anaerobius लक्षित जांच एक मिश्रित टेम्पलेट से उत्पन्न amplicons के साथ प्रयोग किया गया क्लोन के cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों के 20 योनि के साथ जुड़े होने ज्ञात बैक्टीरिया युक्त पी. सहित plasmids शामिल anaerobius. (ए). T7 exonuclease उपचार समय का प्रभाव. ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल पीछा किया गया था लेकिन T7 exonuclease के साथ उपचार के समय संकरण और मंझला प्रतिदीप्ति (एमएफआई) तीव्रता सारे जांच के लिए निर्धारित किया गया था से पहले विभिन्न था. (बी). संकरण समय के प्रभाव. ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल संकरण समय की एक किस्म के साथ पीछा किया गया था. जांच का एक ही सेट एक ही टेम्पलेट से उत्पन्न के रूप में एक और मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) सारे जांच के लिए निर्धारित किया गया था amplicon के साथ प्रयोग किया गया.
चित्रा 4 5-plex Luminex BV अनुक्रमिक एक ही व्यक्ति से ली गई नमूनों में निदान करने के लिए सरणी के आवेदन. (ए). ग्राम दाग पारंपरिक BV के लिए प्रत्येक नमूने का आकलन किया नैदानिक दिखा स्लाइड्स. (बी). एक 5-plex Luminex सरणी के आवेदन तैयार है और इस प्रोटोकॉल के रूप में एक ही चार (ए) में दिखाया गया नमूनों को वर्णित मार डाला. बैक्टीरियल लक्ष्य एमएफआई जिसका संकेत हमारी परिभाषा (एक पूंछ छात्र के टी - परीक्षण, पी <0.05) एक तारांकन (*) द्वारा संकेत कर रहे हैं द्वारा काफी सकारात्मक था .
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संकेत पीढ़ी की विशिष्टता के महत्व का है, आप विश्वास होना चाहिए कि संकेत मनाया वास्तव में है कि जीव से उत्पन्न amplicon का पता लगाने के को दर्शाता है. PrimerPlex (प्रीमियर Biosoft) के रूप में सॉफ्टवेयर के लिए जांच है कि कुशलतापूर्वक संकरण जाएगा डिजाइन करने में मदद कर सकते हैं, लेकिन वे या गैर लक्ष्य प्रजातियों के लिए हो सकता है नहीं पार संकरण. जब सार्वभौमिक पीसीआर प्राइमरों उपयोग किया जाता है के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, यह महत्वपूर्ण है को ध्यान में रखना है कि उत्पन्न amplicon नमूने में मौजूद जीवों के सभी का प्रतिनिधित्व करता है है. यह महत्वपूर्ण है, इसलिए जांच डिजाइन सॉफ्टवेयर द्वारा cpnDB, cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों के दृश्यों के एक डेटाबेस 16 सुझाव दृश्यों की तुलना द्वारा पार संकरण की संभावना के लिए संभावित जांच का विश्लेषण, जांच जो कई जीवों मैच बचा जा रहे हैं यदि संभव हो तो . इसके अलावा, जब संभावित विशिष्ट जांच की पहचान कर रहे हैं, हम एक दृष्टिकोण ले लिया है मान्यता की जांच में जो एक जटिल, कृत्रिम तेmplate क्लोन cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों के 13 ब्याज की microbiota के साथ जुड़े जीवों की एक संख्या के संगत तैयार है. Amplicon तो पूरा "मिश्रित पैनल" लक्ष्य टेम्पलेट सहित, से उत्पन्न है, और संकेत है कि एक दूसरे मिश्रित पैनल है कि लक्ष्य जीव cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों को शामिल नहीं करता है के शामिल टेम्पलेट से उत्पन्न तुलना में है. जांच है कि एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात (जहां संकेत पूरा पैनल से उत्पन्न होता है और शोर लक्ष्य टेम्पलेट बिना पैनल से उत्पन्न होता है) उत्पन्न अंतिम परख में शामिल करने के लिए चयन कर रहे हैं. हम आम तौर पर अंतिम Luminex सरणी में शामिल करने के लिए एक का चयन करने से पहले प्रत्येक लक्ष्य जीव के लिए 4-5 संभव जांच का विश्लेषण किया है.
एक सकारात्मक परिणाम की परिभाषा एक मुद्दे पर विचार किया जाना है. हमने पाया है कि अलग - अलग जांच स्वाभाविक अलग संकेत करने वाली शोर अनुपात है, तो हम एक दृष्टिकोण पर फैसला किया है जिससे एक सकारात्मक परिणाम defin हैछात्र परीक्षा टी (पूंछ): एक बहुत ही सरल सांख्यिकीय परीक्षण द्वारा एड. एक सकारात्मक परिणाम "कोई टेम्पलेट" नियंत्रण के लिए नमूने के एमएफआई की तुलना द्वारा परिभाषित किया गया है, और जब एमएफआई <0.05 पी पर नियंत्रण की तुलना में काफी अधिक है, परिणाम है कि जीव के लिए सकारात्मक माना जाता है. आम तौर पर दो स्वतंत्र रूप से उत्पन्न amplicons प्रत्येक दो प्रतियों में परीक्षण कर रहे हैं. हालांकि पीसीआर और T7 exonuclease कदम एकल असहाय पीसीआर उत्पाद के बारे में 64.5 μl (2.3 कदम) बनाने और इस का केवल 17 μl संकरण (3.2 कदम), 3 संकरण assays के लिए पर्याप्त के लिए प्रयोग किया जाता है, हम आम तौर पर दो amplifications से डुप्लिकेट विश्लेषण करने के लिए कुओं की एक अत्यधिक संख्या का उपयोग कर के बिना एक अंतर्निहित तकनीकी को दोहराने के दे.
की जांच की है कि हम इस परख का एक पहलू अपनी अर्द्ध मात्रात्मक प्रकृति है. एमएफआई किसी दिए गए जांच से संकेत किसी भी जीव के qPCR निर्धारित बहुतायत (भाला धारण करनेवाला सिपाही रैंक सहसंबंध गुणांक आर एंड को अच्छी तरह से संबद्धहो; = ०.४,६८६ <.०,००१ पी 13), लेकिन गतिशील रेंज सीमित है, संकेत करने के लिए उच्च लक्ष्य जीव के स्तर पर तर, के रूप में की उम्मीद के बाद amplicon 40 चक्र का अंत बिंदु पीसीआर के बाद विश्लेषण किया है जाता है. क्योंकि यह अर्द्ध मात्रात्मक है, जीव बहुतायत में प्रवृत्तियों और निगरानी जा सकता है पैटर्न मनाया (उच्च abundances पर संकेत संतृप्ति के बारे में मन में चेतावनी रखने). उदाहरण के लिए, चित्रा 4 सामान्य करने के लिए यह बी.वी. से परिवर्तन के रूप में समय पर एक व्यक्ति की योनि microbiota के एक प्रोफ़ाइल से पता चलता है. के रूप में यह होता है, संकेत जी को इसी vaginalis (BV-जुड़े 17 जीव) बढ़ जाती है और फिर क्षीण हो जाती है, जबकि एल के लिए संकेत पर निगरानी समय के पाठ्यक्रम iners बढ़ जाती है. अनुरूप ग्राम दाग, बी.वी. निदान के लिए वर्तमान "सोने के मानक ', एक पैटर्न है जिससे ग्राम सकारात्मक बेसिली शुरू में अनुपस्थित रहे हैं, लेकिन बाद में समय बिंदुओं पर detectable हैं दिखाने के लिए. Luminex विधि दोनों नमूने में मौजूद जीवों को पहचानती है और देता हैउनके रिश्तेदार abundances रूप ome जानकारी. इस प्रकार की जानकारी के लिए संभावित विशेष रूप से जीवों के abundances में अवांछनीय रुझान के लिए किसी भी प्रकार के नमूने की निगरानी के लिए और एक साथ जीवों की एक बड़ी संख्या के लिए इस डेटा प्रदान कर सकते हैं करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
महत्वपूर्ण बात, इस विधि योनि microbiota की रूपरेखा के लिए सीमित नहीं है और यथोचित किसी भी वातावरण में लक्ष्य जीवों की एक श्रृंखला का पता लगाने और आंशिक मात्रा का ठहराव वांछनीय है के लिए लागू किया जा सकता है. जब अन्य वातावरण के लिए विधि लागू करने, यह महत्वपूर्ण है पीसीआर निषेध घटनेवाला की संभावना पर विचार पीसीआर के inhibitors के रूप में आमतौर पर कई 18 वातावरण से डीएनए के साथ सह - शुद्ध है. कहाँ पीसीआर निषेध एक मुद्दा है, नमूना या पतला किया जा सकता है क्रम में करने के लिए इस परख के लिए पर्याप्त संकेत उत्पन्न आगे शुद्ध.
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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
हम परख विकास और इस पांडुलिपि पर महत्वपूर्ण टिप्पणी के साथ मदद के लिए अल्बर्टो Severini और वैनेसा Goleski धन्यवाद. इस काम कनाडा के जन स्वास्थ्य एजेंसी और औद्योगिक अनुसंधान सहायता कार्यक्रम (कनाडा के राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. Saskatchewan प्रकाशन फंड के विश्वविद्यालय से अतिरिक्त सहायता प्राप्त हुई थी.
