Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in Dumonceaux et al.. J. Clin. . Microbiol 47, 4067 tot 4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Een schematisch diagram dat de totale procedure is weergegeven in figuur 1.

1. Bead koppeling

Dit beschrijft de methoden die moeten worden gebruikt voor het koppelen van oligonucleotide probes om polystyreen Luminex kralen (zie tabel 2). Volumes zijn licht aangepast voor de evaluatie van nieuwe vangprobes op proef, deze volumes zijn tussen haakjes vermeld.

1. Verwijder een-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) poeder van -20 ° C exsiccator en warm op kamertemperatuur.
2. Resuspendeer de microsferen door sonciation in een waterbad ultrasoonapparaat gedurende 20 seconden, dan te vortexen ongeveer 20 seconden.
3. Transfer 400 ul (100 pi) van microsferen aan een Eppendorf buis (dit komt overeen met 5x10 ⁶ of 1,25 x10 ⁶ microsferen). Luminex suggereert het gebruik van een lage eiwitbinding microcentrifugebuizen (bijv. Eppendorf Protein LoBind buizen, catalogus nummer 0030 108.094) om het afgekoppeld kralen te voorkomen dat het vasthouden aan de buizen en bemoeien met kraal herstel. We hebben niet gemerkt dat dit een probleem is met behulp van standaard polypropyleen microcentrifuge buizen, die meestal gebruiken we (bijv. VWR catalogus nummer 87003-298) zijn.
4. Pellet bij 14.000 xg gedurende 1 minuut. Verwijder de supernatant.
5. Resuspendeer de microsferen in 50 ul (12,5 ul) van de ruimte-temperatuur 0,1 M 2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur zuur (MES) pH 4,5.
6. Bereid een verse oplossing van EDC bij 10 mg / ml in water.
   1. Bereid minder dan 1 ml van deze oplossing door het wegen 5-10 mg van EDC op een analytische schaal, dan is het toevoegen van water tot 10 mg / ml.
7. Voeg 1 nmol van 5'-amino C12-gemodificeerde oligonucleotide capture (tabel 2) aan microsferen en door vortexen gemengd. 1 nmol is 5 pi van 200 uM oligonucleotide.
8. Voeg 2,5 ul van verse EDC oplossing voor de microsferen en door vortexen gemengd gedurende 5 seconden.
9. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker.
10. Gooi de EDC-oplossing (stap 1.6) en bereiden een nieuw monster van 10 mg / ml EDC in het water, zoals hierboven (stap 1.6).
11. Voeg nog een 2,5 ul van verse EDC oplossing voor de microsferen en vortex gedurende 5 seconden.
12. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker.
13. Was de kralen door het toevoegen van 1 ml van 0,02% Tween 20. Vortex (optioneel ultrasone trillingen gedurende 20 seconden ook) om de kralen resuspenderen.
14. Centrifugeer 14.000 xg 1 minuut. Verwijder de supernatant.
15. Was weer de kralen door het toevoegen van 1 ml van 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS). Vortex (optioneel ultrasone trillingen gedurende 20 seconden ook) om de kralen resuspenderen.
16. Centrifugeer 14.000 xg 1 minuut. Verwijder de supernatant.
17. Resuspendeer de kralen in 100 pi (25 ul) van Tris-EDTA (TE) buffer [10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0].
18. Inventariseer de kralen in een hemocytometer of Coulter strijd zijn met de voorraad concentratie te bepalen.
19. Bereid een Microsphere Master Mix door verdunning van elke kraal tot een uiteindelijke concentratie van 100 kralen / ul in TE buffer. Pool gekoppeld kralen die overeenkomt met de gewenste samenstelling van de test (bijv. voor een 10-plex test, 10 verschillende gekoppeld kralen mix bij een uiteindelijke concentratie van 100/μl van elke kraal).
20. Bewaar de Microsphere Master Mix bij 4 ° C in het donker. Het mengsel kan worden opgeslagen voor de maanden indien bewaard onder deze omstandigheden.

2. Chaperonine 60 universele target (cpn60 UT) amplicon de productie en de generatie van enkele strengen.

1. Het genereren van polymerase chain reaction (PCR) product voor elk monster. Neem de fosforothioaat-en biotine-gemodificeerde 5 'primer set (tabel 1). Zie tabel 3 voor volumes te mengen en concentraties.
2. Direct na de PCR is voltooid, voeg 2 pl (20 eenheden) van de T7 exonuclease aan elke PCR-buis (de PCR-buffer zal volstaan ​​voor de T7-reactie). Incubeer de reactie bij kamertemperatuur (~ 22-25 ° C) gedurende 40 minuten.
3. Aan het einde van deze incubatie toe te voegen 12,5 pl van 0,5 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 en meng. Dit geeft een totaal van ~ 64.5μl van enkelstrengs PCR-product.

3. Hybridisatie van enkelstrengs PCR-product aan oligonucleotide-gekoppelde polystyreen parels.

1. Voorverwarmen van het instrument tot 60 ° C tot hybridisatie temperatuur te handhaven tijdens de analyse. Zet op het platform verwarming met behulp van het instrument software en zorg ervoor dat de koperen verwarmingsblok dat de PCR-stijl plaat die de gehybridiseerd kraal mengsel bevat past gebruiken.
2. Resuspendeer Microsphere Master Mix (stap 1.20) met een pipet, afzien van een passend bedrag in een eppendorfbuisje, cap de buis, en ultrasone trillingen in een waterbad ultrasoonapparaat gedurende 2 minuten. U kunt ook de absolute consistentie in de kraal resuspe zorgennsion, kan de microsfeer master mix worden geresuspendeerd en door vortexen en pipetteren, dan sonicatie zoals hierboven, dan is het afgeven van de gewenste hoeveelheid in een polypropyleen Eppendorf buis.
3. Doseer 17 ul van enkelstrengs PCR-product (stap 2.2) in de juiste wells van een low-profile 96-well Beschermbuis PCR-plaat (tabel 2). Voeg 33 ul van de geresuspendeerde, sonciated kraal mengsel aan elke well. Bedek met siliconen cover (tabel 2) en tik voorzichtig.
4. Zet de plaat in de thermocycler met een programma van: 95 ° C gedurende 5 min, 60 ° C gedurende 10 min, 60 ° C te houden, 60 ° C gedurende 5 minuten, te beëindigen. Start het programma.
5. Het maken van verse streptavidine-phycoerythrin (SA-PE)-oplossing, je wordt 25 ul per putje nodig (maak meerdere putten extra). Maak SA-PE-oplossing door verdunnen voorraad SA-PE (1 mg / ml) 01u50 tot 20 pg / ml met 1x tetramethylammoniumchloride (TMAC) buffer (3 M TMAC; 0,1% Sarkosyl; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 4 mM EDTA, pH 8,0).
6. Wanneer de thermocycler krijgt om de 60 ° C te houden stap,Open het deksel, verwijder de siliconen cover en direct toe te voegen SA-PE-oplossing aan elk putje (NIET neem de plaat uit de thermocycler). Vervang de siliconen cover, sluit het deksel en thermocycler hervatten van het programma.
7. Wanneer het programma klaar is, nemen de plaat uit en snel over te dragen aan de Bioplex machine om te lezen. Plaat moet worden gelezen binnen 10 minuten. Lees bij 60 ° C; ervoor te zorgen dat de Bioplex is voorverwarmd tot deze temperatuur. Zeker te zijn dat de sonde hoogte is aangepast aan gebruik gemaakt van de plaat, zoals beschreven in de handleiding voor het gebruikte instrument tegemoet te komen.
8. Voor nauwkeurige parel en signaal-detectie, moet de poort instellingen op de Bioplex worden ingesteld afhankelijk van het soort van de microsferen wordt gebruikt. BioRad polystyreen parels vereisen een poort instelling van 4,335-10,000 terwijl de magnetische microsferen vereisen een instelling van 5,000-25,000. Er is ook de mogelijkheid van het uitvoeren van de plaat met behulp van de High PMT instelling die de verslaggever gain-waarde toeneemt. Dit kan ikncrease de intensiteit van de lagere signalen echter is het van belang ook een passende negatieve controle als achtergrond signaal zal ook worden verhoogd.

4. Representatieve resultaten:

Een van onze doelen in de ontwikkeling en uitvoering van deze test was om het zo eenvoudig en gestroomlijnd mogelijk te maken. Wij zijn dan ook optimaal de kritische post-versterking stappen, waaronder T7 exonuclease behandeling tijd en hybridisatie tijd om een ​​test waarmee kan worden voltooid binnen een redelijke termijn te ontwikkelen. Zoals getoond in Figuur 2A, T7 behandeling van de amplicon is essentieel voor het signaal generatie, zoals de meeste sondes weinig of geen signaal met korte of geen T7 behandeling was. Het signaal lineair toe tot ongeveer 40 minuten, op welk moment het signaal te verhogen vertraagd. Geen degradatie van het signaal werd zelfs waargenomen 2 uur van T7 de behandeling de tijd, wat aangeeft dat de fosforothioaat wijziging van de primers is zeer effectief in het voorkomen van target streng degradatie, zoals beschreven ^15. We hebben gekozen voor 40 minuten voor T7 behandeling de tijd om de totale protocol te minimaliseren, maar het is duidelijk uit figuur 2A dat T7 behandeling door kan gaan veel langer. We hebben ook het effect van hybridisatie tijd op het signaal generatie (figuur 2B) bepaald en vond dat 10 minuten was voldoende voor een maximale signaal, was geen verdere toename van het signaal waargenomen, zelfs na vier uur van hybridisatie. Daarom werd een 10 minuten hybridisatie stap gekozen, weer aan de algemene test te minimaliseren. Met deze resultaten in het achterhoofd, en met een snelle DNA-extractie technieken zoals InstaGene (Bio-Rad), kan de totale test met inbegrip van DNA-extractie, PCR, en Luminex analyse worden afgerond in 4-5 uur.

Op een kritische noot, kan het niveau van aggregatie van de polystyreen parels tijdens een Luminex of Bioplex lopen een grote impact hebben op de efficiëntie van de test. De Bioplex software zal geven het niveau van de kraal aggregatie, die optreedt wanneermeer dan een kraal wordt gedetecteerd in de laser pad en resulteert in de uitsluiting van de hybridisatie signaal van de aggregaat. Schijnbare kraal aggregatie kan ook worden veroorzaakt door een fijn stof dat is niet de juiste maat voor een kraal, en kan zelfs worden veroorzaakt door luchtbellen. In elk van deze gebeurtenissen, is het signaal van de kraal aggregaat, luchtbel, of deeltje weggegooid. In de meeste gevallen vinden we dat kraal aggregatie minimaal is (Figuur 3A) en het beoogde niveau van 100 tellen van evenementen voor elke kraal is gemakkelijk haalbaar. Soms, echter, de kralen geven een matige (Figuur 3B) of ernstige (Figuur 3C) niveau van aggregatie. In deze gevallen, aangezien de meeste van de data wordt verwijderd, kan het instrument moeite hebben met het bereiken van 100 evenementen per kraal type en de resultaten kunnen twijfelachtig zijn. De ultrasoonapparaat stap (stap 3.2) is bedoeld om kraal aggregatie te minimaliseren. Daarnaast kan het opslaan van de kralen als een verdunde microsfeer master mix (stap 1.20) te helpen. We hebben gemerkt dat de uitsluiting van TMAC van de hybridization buffer - toe te voegen aan de SA-PE oplosmiddel in plaats daarvan (stap 3.5) - helpt bij het minimaliseren kraal aggregatie. Bovendien, terwijl wij niet over deze getest, zijn de nieuwere magnetische korrels die beschikbaar zijn vanaf Luminex of BioRad gedacht dat minder de neiging te aggregeren weer te geven.

De resultaten van de toepassing van een 5-plex Luminex reeks gericht op G. vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, en L. gasseri samen met de bijbehorende Gram gekleurde vaginaal uitstrijkje uitstrijkjes zijn weergegeven in figuur 4. Deze monsters werden genomen van een enkel individu op verschillende tijdstippen. Op tijdstip 0, was de persoon met de diagnose BV op basis van Gramkleuring (Figuur 4A) en de Luminex resultaten van deze hetzelfde monster (Figuur 4B) tonen aan dat van de organismen vertegenwoordigd in de array, G. vaginalis was het meest voor, terwijl A. vaginae en L. iners waren ook positief. Negen dagen later, het individu nog steeds BV positief en de signal voor G. vaginalis aanzienlijk waren toegenomen, terwijl A. vaginae en L. iners waren nog steeds positief. Belangrijk is dat na deze tijd de individuele begon de overgang naar een normale microbiota als Gram-positieve bacillen werd detecteerbaar in de uitstrijkjes (Figuur 4A), terwijl het signaal voor G. vaginalis afnam en het signaal voor L. iners toegenomen (Figuur 4B). Door onze oorspronkelijke definitie van BV met deze methode (monsters positief voor G. vaginalis en / of A. vaginae werden beschouwd BV positief) ^13, deze persoon was BV positief op alle tijdstippen, hoewel de Gramkleuring niet aan G. te detecteren vaginalis in de laatste twee tijdstippen. Met de Luminex hier beschreven methode, kunnen trends eenvoudig worden vergeleken met sequentie-gebaseerde methoden, en de resultaten van de Luminex assay typisch bevestigen Gramkleuringen ^13, terwijl het verstrekken van aanvullende informatie over organisme identiteit en overvloed.

Figuur 1. Schematische weergave van de Luminex protocol voor het bepalen van de microbiota profiel van een complexe klinische of milieu-monster. Het protocol begint met template-DNA dat is geëxtraheerd uit het monster van belang. (1) Genereer PCR-product van template DNA met behulp van streng-specifieke gebiotinyleerde, fosforothioaat gemodificeerde cpn60 UT PCR-primers in combinatie met niet-gemodificeerde cpn60 UT PCR-primers (Tabel 1), (2) Dit genereert een PCR-product pool die de microbiota met de biotine- fosforothioaat wijziging op een streng, (3) de double-stranded PCR-product Digest met T7 exonuclease, die niet kan degraderen de fosforothioaat-gemodificeerde streng en daarom genereert enkelstrengs DNA dat is gewijzigd op het 5'-uiteinde met biotine, (4) Koppel polystyreen bolletjes aan soortspecifieke cpn60 UT probes - Elke kraal heeft een unieke spectrale adres (aangegeven door kraal kleur) dat is te onderscheiden door de Luminex of Bio-Plex instrument; (5) hybridiseren het enkelstrengs PCR-product gegenereerd uit de steekproef van belang zijn voor de suite van soort-specifieke oligonucleotide-gekoppelde beads, (6) Add-streptavidine conjugaat phycoerythrin dat zich bindt aan de gebiotinyleerde enkelstrengs PCR-product en fungeert als een indicator van hybridisatie, (7) Bepaal de spectrale adres (kraal identiteit) en hybridisatie intensiteit van het signaal met behulp van een Luminex of Bio-Plex instrument. Ten minste 100 kralen zijn geteld voor elke kraal identiteit en de mediaan fluorescentie-intensiteit (MFI) van de phycoerythrin signaal wordt gerapporteerd als de output. Tot 100 verschillende soorten kralen tegelijkertijd kunnen worden geëvalueerd, maar een test met de discriminatie van de drie types kraal is geïllustreerd. (8) Wanneer de MFI van PCR repliceert gegenereerd op basis van hetzelfde monster is significant groter dan de negatieve controle voor een bepaalde kraal (eenzijdige Student's t-test, p <0,05), wordt het monster als positief voor dat organisme.

Figuur 2. Optimalisatie van Luminex test parameters. Vijf verschillende probes gericht op Peptostreptococcus anaerobius werden gebruikt met amplicons gegenereerd op basis van een gemengd model, bestaande uit plasmiden die de gekloonde cpn60 UT van 20 bacteriën bekend dat zij samenhangen met de vagina, waaronder P. anaerobius. (A). Effect van de T7 exonuclease de behandeling de tijd. Het protocol hierboven beschreven werd gevolgd, maar de tijd van de behandeling met T7 exonuclease was voorafgaand aan hybridisatie en de mediaan fluorescentie-intensiteit (MFI) werd bepaald voor alle sondes gevarieerd. (B). Effect van hybridisatie tijd. Het protocol hierboven beschreven werd gevolgd met een verscheidenheid van hybridisatie tijden. Dezelfde sets van probes werden gebruikt met een amplicon gegenereerd op basis van dezelfde sjabloon als in A en de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) werd bepaald voor alle sondes.

Figuur 4. Toepassing van een 5-plex Luminex array om BV diagnose in opeenvolgende monsters van hetzelfde individu. (A). Gram-gekleurde dia's met de traditionele diagnose gebruikt worden om elk monster te beoordelen voor de BV. (B). Toepassing van een 5-plex Luminex reeks voorbereid en uitgevoerd zoals beschreven in dit protocol om dezelfde vier monsters getoond in (A). Bacteriële van doelstellingen waarvan de MFI-signaal werd significant positief door onze definitie (eenzijdige Student's t-test, p <0,05) zijn aangegeven met een asterisk (*).

De specificiteit van het signaal generatie is van cruciaal belang, je moet erop kunnen vertrouwen dat het signaal waargenomen werkelijk weerspiegelt de detectie van amplicon gegenereerd op basis van dat organisme. Software zoals PrimerPlex (Premier Biosoft) kan helpen om probes die efficiënt zal hybridiseren het ontwerp, maar ze kunnen wel of niet cross-hybridiseren niet-doelsoorten. Indien een universele PCR-primers worden gebruikt zoals beschreven in dit protocol, is het belangrijk om in gedachten te houden dat de gegenereerde amplicon alle organismen in het monster aanwezig is. Het is daarom belangrijk om potentiële probes voor de mogelijkheid van cross-hybridisatie geanalyseerd door het vergelijken van de sequenties zoals voorgesteld door de sonde ontwerp van software om de cpnDB, een database van cpn60 UT sequenties ^16; probes dat meerdere organismen overeenkomen dienen te worden vermeden indien mogelijk . Bovendien, wanneer mogelijk specifieke probes zijn geïdentificeerd, hebben we een benadering van de validatie sonde, waarin een complexe, kunstmatig template is bereid die overeenkomt met de gekloonde cpn60 UT van een aantal organismen geassocieerd met de microbiota van belang ^13. Amplicon wordt dan gegenereerd uit de complete "gemengd panel", inclusief het doel template, en het signaal wordt vergeleken met dat gegenereerd op basis van een tweede model bestaat uit de gemengde paneel dat niet bevat het doelwit organisme cpn60 UT. Probes die een hoge signaal-ruis-verhouding (waar het signaal wordt gegenereerd uit het volledige paneel en het geluid is gegenereerd op basis van het paneel, zonder het doelwit template) te genereren zijn geselecteerd voor opname in de finale test. We hebben meestal geanalyseerd 4-5 mogelijk probes voor elke doelgroep organisme voor het kiezen van een voor opname in de finale Luminex array.

De definitie van een positief resultaat is een probleem dat moet worden overwogen. Wij hebben geconstateerd dat verschillende sondes inherent verschillende signaal-ruis verhoudingen hebben, dus hebben we besloten tot een aanpak waarbij een positief resultaat wordt defined door een zeer eenvoudige statistische test: de student t-test (eenzijdig). Een positief resultaat wordt bepaald door vergelijking van de MFI van het monster op de "geen template" controle, en als de MFI is aanzienlijk hoger dan de controle op p <0,05, het resultaat wordt als positief te zijn voor dat organisme. Normaal gesproken twee onafhankelijk van elkaar gegenereerd amplicons zijn elk in tweevoud getest. Hoewel de PCR en T7 exonuclease stappen maken over 64,5 pi van enkelstrengs PCR-product (stap 2.3) en slechts 17 ul van dit wordt gebruikt voor hybridisatie (stap 3.2), voldoende voor 3 hybridisatie testen, analyseren we normaal gesproken duplicaten van twee amplificaties naar geven een inherente technische repliceren zonder een te groot aantal putten.

Een aspect van deze test die we hebben onderzocht is de semi-kwantitatieve aard zijn. De MFI signaal van een bepaalde sonde correleert goed met de qPCR vastgestelde overvloed van een bepaald organisme (Spearman rang correlatie coëfficiënt & rho, = 0.4686, p <0,0001) ^13, maar het dynamisch bereik is beperkt; het signaal de neiging om te verzadigen op hogere doelorganisme niveaus, zoals verwacht, omdat amplicon wordt geanalyseerd na eindpunt PCR van 40 cycli. Want het is semi-kwantitatief, kunnen trends in overvloed organisme worden gecontroleerd en waargenomen patronen (het bijhouden van de waarschuwing in het achterhoofd met betrekking tot verzadiging van het signaal bij hogere abundanties). Bijvoorbeeld, Figuur 4 toont een profiel van de vaginale microbiota van een individu in de tijd als het verandert van BV naar normaal. Als dit gebeurt, wordt het signaal dat overeenkomt met G. vaginalis (een BV-geassocieerd organisme ¹⁷⁾ toeneemt en vervolgens afneemt, terwijl in de loop van de monitoring tijd het signaal voor L. iners toeneemt. Overeenkomstige Gramkleuringen, de huidige "gouden standaard" voor de BV diagnose, vertonen een patroon waarbij de Gram-positieve bacillen worden in eerste instantie afwezig, maar worden aantoonbaar op latere tijdstippen. De Luminex methode identificeert zowel de organismen in het monster aanwezig en geeft some informatie over hun relatieve abundanties. Dit soort informatie zou kunnen worden gebruikt om monsters van welk type ook voor ongewenste ontwikkelingen in de abundanties van bepaalde organismen monitor en kan deze gegevens te verstrekken voor een groot aantal organismen tegelijk.

Belangrijker is, is deze methode niet beperkt tot de profilering van vaginale microbiota en redelijkerwijs kan worden toegepast op elke omgeving waarin de detectie en gedeeltelijke kwantificering van een aantal doelsoorten is wenselijk. Bij toepassing van de methode om andere omgevingen, is het belangrijk om de mogelijkheid van PCR remming optreden, als remmers van de PCR vaak co-zuiveren met DNA van vele omgevingen ^18. Waar de PCR inhibitie een probleem is, kan het monster ofwel verdund of verder gezuiverd in om voldoende signaal voor deze test te genereren.