Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Diese Methode wurde in der Forschung in Dumonceaux et al verwendet. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Eine schematische Darstellung des gesamten Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Bead-Kopplung

Dies beschreibt die Methoden zur Kopplung Oligonukleotid-Sonden für Polystyrol Luminex-Beads (siehe Tabelle 2) verwendet werden. Volumes sind etwas für die Evaluierung neuer Fängersonden probeweise angepasst; diese Bände sind in Klammern angegeben.

1. Nehmen Sie 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimid HCl (EDC)-Pulver von -20 ° C Exsikkator und warm es auf Raumtemperatur.
2. Resuspendieren Mikrokugeln durch sonciation in einem Wasserbad Sonicator für 20 Sekunden, dann Vortexen etwa 20 Sekunden.
3. Transfer-400 ul (100 ul) von Mikrosphären in ein Eppendorf-Röhrchen (das entspricht 5x10 ⁶ oder 1,2510 ⁶ Mikrosphären). Luminex empfiehlt die Verwendung von geringer Proteinbindung Mikrozentrifugenröhrchen (zB Eppendorf Protein LoBind Röhrchen, Katalog 0030 108,094), die abgekoppelt Perlen vom Kleben an den Rohren und stören bead Erholung verhindern. Wir haben nicht gefunden, daß dieses Problem mit Standard-Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen, die wir verwenden in der Regel (zB VWR Katalog-Nummer 87003-298) werden.
4. Pellet bei 14000 xg für 1 Minute. Entfernen und den Überstand verwerfen.
5. Resuspendieren der Mikrosphären in 50 ul (12,5 ul) bei Raumtemperatur 0,1 M 2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES) pH 4,5.
6. Bereiten Sie eine frische Lösung von EDC bei 10 mg / ml in Wasser.
   1. Bereiten Sie weniger als 1 ml dieser Lösung durch Wiegen 5-10 mg EDC im analytischen Maßstab, dann Zugabe von Wasser bis 10 mg / ml.
7. Add 1 nmol von 5'-Amino C12-modifizierte Fänger-Oligonukleotid (Tabelle 2) zu Mikrosphären und vortexen. 1 nmol ist 5 ul 200 uM OligoNukleotid.
8. Fügen Sie 2,5 ml frisches EDC-Lösung, um die Mikrosphären und vortexen für 5 Sekunden.
9. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln.
10. Entsorgen Sie die EDC-Lösung (Schritt 1,6) und bereiten eine frische Probe von 10 mg / ml EDC in Wasser wie oben beschrieben (Schritt 1.6).
11. Fügen Sie weitere 2,5 ml frisches EDC-Lösung, um die Mikrosphären und Vortex für 5 Sekunden.
12. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln.
13. Waschen Sie die Beads durch Zugabe von 1 ml 0,02% Tween 20. Vortex (optional für 20 Sekunden sowie beschallen), um die Perlen zu resuspendieren.
14. Centrifuge 14000 xg 1 Minute. Entfernen und den Überstand verwerfen.
15. Waschen Sie die Kugeln wieder durch Zugabe von 1 ml 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS). Vortex (optional für 20 Sekunden sowie beschallen), um die Perlen zu resuspendieren.
16. Centrifuge 14000 xg 1 Minute. Entfernen und den Überstand verwerfen.
17. Resuspendieren der Beads in 100 ul (25 ul) Tris-EDTA (TE)-Puffer [10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0].
18. Zählen Sie die Perlen in einer Zählkammer oder Coulter-Zähler auf die Lager-Konzentration zu bestimmen.
19. Bereiten Sie eine Microsphere Master Mix durch Verdünnen jede Perle, um eine Endkonzentration von 100 Perlen / ul in TE-Puffer. Pool gekoppelt Perlen entsprechend der gewünschten plex des Tests (zB für eine 10-plex-Assay-Mix 10 verschiedene gekoppelt Perlen an einer Endkonzentration von 100/μl der jede Perle).
20. Bewahren Sie die Microsphere Master Mix bei 4 ° C im Dunkeln. Die Mischung kann über Monate gelagert werden, wenn unter diesen Bedingungen gehalten.

2. Chaperonin 60 Universal-Ziel (cpn60 UT) Amplikon Produktion und Erzeugung von Einzelsträngen.

1. Generieren Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Produkt für jede Probe. Fügen Sie die Phosphorothioat-und Biotin-modifizierten 5 'Primer (Tabelle 1). Siehe Tabelle 3 für Volumina zu mischen und Konzentrationen.
2. Unmittelbar nach der PCR abgeschlossen ist, fügen Sie 2 ul (20 Einheiten) von T7 abonuclease jedem PCR-Röhrchen (die PCR-Puffer wird für die T7 Reaktion genügt). Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur (~ 22-25 ° C) für 40 Minuten.
3. Am Ende dieser Inkubation add 12,5 ul 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 8,0 und mischen. Dies ergibt eine Gesamtsumme von ~ 64.5μl einzelner PCR-Produkt.

3. Die Hybridisierung der einzelsträngigen PCR-Produkt auf Oligonukleotid-coupled Polystyrol-Kügelchen.

1. Vorwärmen das Gerät bis 60 ° C bis Hybridisierungstemperatur während der Analyse zu erhalten. Biegen Sie auf der Plattform Heizer mit dem Instrument der Software und achten Sie darauf, die Messing-Heizblock, dass die PCR-Stil Platte, die die hybridisierten bead Mischung enthält passt zu verwenden.
2. Resuspendieren Microsphere Master Mix (Schritt 1,20) mit einer Pipette, verzichten entsprechende Menge in ein Eppendorf-Röhrchen, Kappe der Röhre, und beschallen in einem Wasserbad Sonicator für 2 Minuten. Alternativ zu gewährleisten absolute Konsistenz in bead resuspension, kann das Mikrokügelchen Master-Mix durch Vortexen und Pipettieren, dann Ultraschallbehandlung wie oben resuspendiert werden, dann Dosieren der gewünschten Menge in ein Eppendorf-Röhrchen aus Polypropylen.
3. Dispense 17 ul der einzelnen PCR-Produkt (Schritt 2,2) in die entsprechenden Vertiefungen einer Low-Profile-96-well PCR-Platte Schutzrohr (Tabelle 2). Add 33 ul resuspendiert, sonciated bead Mischung in jede Vertiefung. Deckel mit Silikon-Deckel (Tabelle 2) und tippen Sie vorsichtig.
4. Legen Sie die Platte in den Thermocycler mit einem Programm von: 95 ° C für 5 min, 60 ° C für 10 min, 60 ° C zu halten, 60 ° C für 5 min, zu beenden. Starten Sie das Programm.
5. Machen Sie frische Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE)-Lösung, Sie werden 25 ul pro Well müssen (make mehrere Brunnen extra). Machen Sie SA-PE-Lösung durch Verdünnung Lager SA-PE (1 mg / ml) 1:50 bis 20 pg / ml mit 1x Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) Puffer (3 M TMAC, 0,1% Sarkosyl; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 4 mM EDTA, pH 8,0).
6. Wenn der Thermocycler die 60 ° C zu halten Schritt erhält,öffnen Sie den Deckel, entfernen Sie die Schutzhülle aus Silikon und fügen SA-PE-Lösung direkt in jede Vertiefung (nehmen Sie nicht die Platte aus dem Thermocycler). Ersetzen Sie die Silikonhülle, schließen Sie den Thermocycler Deckel und der Wiederaufnahme des Programms.
7. Wenn das Programm abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platte aus und schnell zu übertragen, um die BioPlex Maschine zu lesen. Platte muss innerhalb von 10 Minuten abgelesen werden. Lesen Sie bei 60 ° C; sicherzustellen, dass die BioPlex zu dieser Temperatur wurde vorgewärmt. Seien Sie sicher, dass die Sonde Höhe eingestellt ist, die Platte verwendet, wie in der Bedienungsanleitung für das Gerät verwendet werden, beschrieben unterzubringen.
8. Für eine genaue Wulst und Signalerfassung, muss die Gate-Einstellungen auf dem BioPlex nach der Art der Mikrosphären verwendet eingestellt werden. BioRad Polystyrol-Kügelchen erfordern ein Tor Einstellung 4,335-10,000 während magnetische Mikrosphären eine Einstellung von 5.000-25.000 erfordern. Es besteht auch die Möglichkeit, den Teller mit dem High PMT-Einstellung, die der Reporter Gain-Wert erhöht. Dies kann increase die Intensität der unteren Signale jedoch ist es wichtig, auch eine negative Kontrolle als Hintergrund-Signal auch erhöht werden.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Eines unserer Ziele bei der Entwicklung und Umsetzung dieses Tests war es so einfach und einheitlich wie möglich zu machen. Deshalb optimiert den kritischen Nachverstärkung Schritte, einschließlich T7 Exonuklease-Behandlung Zeit und Hybridisierung Zeit, um einen Test, der in einer angemessenen Frist abgeschlossen werden kann entwickeln. Wie in Abbildung 2A gezeigt, ist T7 Behandlung des Amplikons wichtig für die Signalerzeugung, da die meisten Sonden wenig oder gar kein Signal mit kurzen oder gar keinen T7 Behandlung hatte. Das Signal stieg linear bis ca. 40 Minuten, zu welchem ​​Zeitpunkt das Signal zu erhöhen verlangsamt. Keine Verschlechterung des Signals war auch bei 2 Stunden T7 Behandlung beobachtet, was darauf hinweist, dass die Phosphorothioat Modifikation der Primer sehr wirksam bei der Verhinderung targe istt-Strang Abbau, wie beschrieben ^15. Wir haben 40 Minuten für T7 Behandlung Zeit, um die Gesamt-Protokoll zu minimieren, aber es ist klar, 2A, dass T7 Behandlung kann sich über viel länger. Wir haben auch den Effekt der Hybridisierung Zeit auf Signalerzeugung (Abbildung 2B) bestimmt und festgestellt, dass 10 Minuten reichen für maximale Signal war, war da kein weiterer Anstieg der Signal auch nach 4 Stunden der Hybridisierung beobachtet. Daher wurde eine 10 Minuten Hybridisierung gewählt, erneut, um den gesamten Test zu minimieren. Mit diesen Ergebnissen im Hinterkopf, und mit schnellen DNA-Extraktion Techniken wie InstaGene (Bio-Rad), kann der gesamte Test einschließlich DNA-Extraktion, PCR, und Luminex-Analyse in 4-5 Stunden abgeschlossen sein.

Auf einem Warnhinweis, kann der Grad der Aggregation der Polystyrol-Kügelchen in einem Luminex oder BioPlex ausgeführt haben einen großen Einfluss auf die Effizienz des Assays. Die BioPlex Software zeigt das Niveau der Bead-Aggregation, die der auftritt, wennmehr als eine Perle ist in der Laser-Pfad und führt zum Ausschluss des Hybridisierungssignal aus dem Aggregat erkannt. Scheinbare Bead-Aggregation kann auch durch jede Feinstaub, der nicht die richtige Größe für eine einzelne Perle verursacht werden, und kann sogar durch Luftblasen verursacht werden. In jedem dieser Ereignisse wird das Signal von der Perle Aggregat, Luftblase, oder Partikel verworfen. In den meisten Fällen finden wir, dass Bead-Aggregation ist minimal (Abbildung 3A) und dem angestrebten Niveau von 100 Zählen von Ereignissen für jede Perle ist leicht erreichbar. Gelegentlich zeigen jedoch, die Perlen einer moderaten (Abbildung 3B) oder schwerer (Abbildung 3C) Aggregationsebene. In diesen Fällen, da die meisten Daten verworfen wird, kann das Gerät Probleme haben, erreichen 100 Veranstaltungen pro Bead Art und die Ergebnisse fraglich sein kann. Die Beschallung (Schritt 3.2) soll Bead-Aggregation zu minimieren. Darüber hinaus können die Speicherung der Kügelchen als eine verdünnte Mikrosphäre Master-Mix (Schritt 1.20) zu helfen. Wir haben, dass der Ausschluss TMAC aus dem Hy bemerktdization Puffer - Zugabe zu den SA-PE Verdünnungsmittel statt (Schritt 3,5) - hilft bei der Bead-Aggregation zu minimieren. Darüber hinaus, während wir noch nicht getestet, sind die neueren magnetischen Beads sind aus Luminex oder BioRad gedacht, eine geringere Tendenz zur Aggregation anzuzeigen.

Die Ergebnisse der Anwendung eines 5-plex Luminex Array Targeting G. vaginalis, A. vaginae, L. iner, L. crispatus und L. gasseri zusammen mit den entsprechenden Gram gefärbt vaginalen Abstrich Abstriche sind in Abbildung 4 dargestellt. Diese Proben wurden aus einer einzigen Person zu mehreren Zeitpunkten entnommen. Zum Zeitpunkt 0 wurde die Person mit BV basierend auf Gram-Färbung diagnostiziert (Abbildung 4A) und der Luminex Ergebnisse aus dieser gleichen Probe (Abbildung 4B) zeigen, dass der Organismen in dem Array, G. vertreten vaginalis wurde am häufigsten, während A. vaginae und L. iner waren ebenfalls positiv. Neun Tage später war das Individuum noch BV positiv und die signal für G. vaginalis habe deutlich zugenommen, während A. vaginae und L. iner noch positiv. Wichtig ist, dass nach dieser Zeit die einzelnen begann Übergang zu einer normalen Mikroflora als Gram-positive Bazillen wurden in den Abstrichen nachweisbar (Abbildung 4A), während das Signal für G. vaginalis nachgelassen und das Signal für L. iner erhöht (Abbildung 4B). Durch unsere ursprüngliche Definition von BV mit dieser Methode (Proben positiv für G. vaginalis und / oder A. vaginae wurden als positive BV) ^13, wurde dieser individuellen BV positive zu allen Zeitpunkten, obwohl die Gram-Färbung nicht zu erkennen G. vaginalis in den letzten beiden Zeitpunkten. Mit dem Luminex hier beschriebenen Verfahren können Trends schnell zu Sequenzierung-basierte Methoden verglichen werden, und die Ergebnisse der Luminex-Assay in der Regel bestätigen Gramfärbung ^13, während die Bereitstellung zusätzlicher Informationen auf den Organismus Identität und Fülle.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Luminex-Protokoll für die Bestimmung der Mikroflora Profil eines komplexen klinischen oder Umwelt-Probe. Das Protokoll beginnt mit Template-DNA, die aus der Probe von Interesse extrahiert wurde. (1) generieren PCR-Produkt von Template-DNA-Strang mit spezifischen biotinylierten, Phosphorothioat-modifizierte cpn60 UT PCR-Primer mit unmodifizierten cpn60 UT PCR-Primer (Tabelle 1) gekoppelt ist; (2) Dies erzeugt eine PCR-Produkt-Pool, die die Mikroflora mit dem Biotin- Phosphorothioat Modifikation auf einem Strang, (3) Digest die doppelsträngige PCR-Produkt mit T7 Exonuklease, die nicht abbauen können die Phosphorothioat-modifizierten Strang und erzeugt somit Einzelstrang-DNA, die am 5'-Ende mit Biotin modifiziert wird, (4) Paar Polystyrol-Kügelchen auf artspezifische cpn60 UT-Sonden - jede Perle hat einen einzigartigen spektralen Adresse (angezeigt durch bead Farbe), die is erkennbar durch die Luminex oder Bio-Plex Gerät, (5) hybridisieren die einzelnen PCR-Produkt erzeugt aus der Probe von Interesse, die Sammlung von artspezifischen Oligonukleotid-gekoppelten Kügelchen, (6) Add Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugat, das bindet das biotinylierte Einzelstrang-PCR-Produkt und dient als Indikator für die Hybridisierung; (7) Bestimmen Sie die spektrale Adresse (bead Identität) und Hybridisierung Signalintensität mit einem Luminex oder Bio-Plex Gerät. Mindestens 100 Perlen sind für jede Perle Identität gezählt und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Phycoerythrin-Signal als Ausgang berichtet. Bis zu 100 verschiedene Bead-Typen können gleichzeitig ausgewertet werden, sondern ein Test, welche die Diskriminierung von drei Kügelchen Typen dargestellt. (8) Wenn die MFI PCR aus der gleichen Probe repliziert erzeugt wird, deutlich größer als die negative Kontrolle für eine bestimmte Perle (one-tailed Student t-Test, p <0,05), wird die Probe als für den Organismus positiv.

Abbildung 2. Optimierung der Luminex-Assay-Parameter. Fünf verschiedene Sonden gezielt zu Peptostreptococcus anaerobius wurden mit Amplikons aus einer gemischten Vorlage generiert verwendet mit Plasmiden, die die geklonten cpn60 UT von 20 Bakterien bekannt, mit der Vagina in Verbindung gebracht werden, einschließlich P. anaerobius. (A). Wirkung von T7 Exonuklease-Behandlung Zeit. Die oben beschriebenen Protokoll folgte aber die Zeit der Behandlung mit T7 Exonuklease wurde vor der Hybridisierung und das mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) wurde für alle Sonden bestimmt abwechslungsreich. (B). Einfluss der Hybridisierung Zeit. Die oben beschriebenen Protokoll wurde mit einer Vielzahl von Hybridisierung Zeiten folgten. Das gleiche Sätze von Sonden wurden mit einem Amplikon aus derselben Vorlage erzeugt, wie in A und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für alle Sonden ermittelt wurde.

Abbildung 4. Die Anwendung eines 5-plex Luminex Array BV Diagnose in sequentiellen Proben von der gleichen Person übernommen. (A). Gram-gefärbten Objektträger, welche die traditionellen Diagnose verwendet werden, um jede Probe für BV zu beurteilen. (B). Die Anwendung eines 5-plex Luminex Array vorbereitet und durchgeführt, wie in diesem Protokoll, um die gleichen vier Proben in (A) gezeigt, beschrieben. Bakterielle Ziele, deren MFI-Signal war deutlich positiv von unserer Definition (one-tailed Student t-Test, p <0,05) sind mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet.

Die Spezifität des Signals Generation von entscheidender Bedeutung ist, Sie müssen sicher sein, dass das Signal beobachtet reflektiert wirklich den Nachweis von Amplikon aus diesem Organismus erzeugt. Software wie PrimerPlex (Premier Biosoft) kann helfen, Sonden, die effizient hybridisieren Design, aber sie kann oder auch nicht, um Nicht-Zielarten cross-Hybridisierung. Als universelle PCR-Primer verwendet werden, wie in diesem Protokoll beschrieben, ist es wichtig zu bedenken, dass das Amplifikat generiert alle Organismen in der Probe vorhanden ist. Es ist daher wichtig, um mögliche Sonden für die Möglichkeit des Cross-Hybridisierung durch Vergleich der Sequenzen von der Sonde Design-Software, die cpnDB, eine Datenbank mit cpn60 UT-Sequenzen ^{16 nahegelegt} zu analysieren; Sonden, die mehrere Organismen entsprechen, sind zu vermeiden, wenn möglich . Wenn darüber hinaus potentiell spezifischen Sonden identifiziert werden, haben wir einen Ansatz zur Validierung Sonde in die eine komplexe, künstliche template bereit ist, entsprechend der geklonten cpn60 UT einer Reihe von Organismen mit der Mikroflora des Interesses ¹³ zugeordnet. Amplicon wird dann aus dem kompletten "gemischte Platte", einschließlich des Ziels Vorlage erzeugt und das Signal an, dass aus einer zweiten Vorlage der gemischten Platte, die nicht enthalten die Zielorganismen ist cpn60 UT umfasst erzeugten verglichen. Sonden, die ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis (wo das Signal aus dem gesamten Panel erzeugt und das Rauschen aus dem Panel ohne dass die Zielseite Vorlage generiert) generiert werden für die Aufnahme in den endgültigen Test ausgewählt. Wir haben typisch 4-5 möglich Sonden für jedes Ziel Organismus vor der Auswahl eines für die Aufnahme in die endgültige Luminex Array analysiert.

Die Definition eines positiven Ergebnisses ist ein Thema, zu berücksichtigen. Wir haben festgestellt, dass verschiedene Sonden naturgemäß unterschiedliche Signal-Rausch-Verhältnis haben, so entschieden wir uns für einen Ansatz, wobei ein positives Ergebnis defined durch eine sehr einfache statistische Test: der Student t-Test (one-tailed). Ein positives Ergebnis wird durch den Vergleich der MFI der Probe auf der "no template"-Steuerelement definiert, und wenn der MFI deutlich höher als in der Kontrollgruppe bei p <0,05 ist, das Ergebnis gilt als für den Organismus positiv. Normalerweise zwei unabhängig generierten Amplikons sind jeweils in Doppelbestimmung getestet. Obwohl die PCR und T7 Exonuklease Schritten erstellen zu 64,5 ul der einzelnen PCR-Produkt (Schritt 2.3) und nur 17 l dieser ist für die Hybridisierung (Schritt 3,2), ausreichend für 3 Hybridisierungsassays verwendet, die wir normalerweise zu analysieren Duplikate aus zwei Amplifikationen geben einen inhärenten technischen replizieren, ohne eine übermäßige Anzahl von Brunnen.

Ein Aspekt dieses Tests, die wir untersucht haben, ist die semi-quantitative Natur. Die MFI-Signal aus einer gegebenen Probe korreliert gut mit der qPCR-bestimmt Häufigkeit eines bestimmten Organismus (Spearman Rangkorrelationskoeffizient & rho; = 0,4686, p <0,0001) ^13, aber die Dynamik ist begrenzt, das Signal dazu neigt, bei höheren Zielorganismus Ebenen zu sättigen, wie erwartet, da Amplikon nach Endpunkt PCR von 40 Zyklen analysiert wird. Weil es semi-quantitative ist, können Trends im Organismus reichlich überwacht und Muster zu beobachten (wobei der Vorbehalt im Hinterkopf bezüglich Sättigung bei höheren Häufigkeiten). Zum Beispiel zeigt Abbildung 4 ein Profil der vaginale Mikroflora eines Individuums über die Zeit, wie es ändert sich von BV zu normal. Wenn dies geschieht, entspricht das Signal an G. vaginalis (a BV-assoziierten Organismus ¹⁷⁾ erhöht und dann schwindet, während sich im Laufe der Überwachungszeit das Signal für L. iner erhöht. Entsprechende Gramfärbung, die aktuelle "Goldstandard" für BV Diagnose, zeigen eine Struktur, bei Gram-positiven Bacillen sind zunächst fehlen, sind aber zu späteren Zeitpunkten nachweisbar. Die Luminex-Methode sowohl identifiziert die Organismen in der Probe vorhanden und gibt some Angaben zu ihrer relativen Häufigkeiten. Diese Art von Informationen könnte verwendet werden, um Proben von jeder Art für Fehlentwicklungen in der Häufigkeit von bestimmten Organismen zu überwachen und kann diese Daten für eine große Zahl von Organismen gleichzeitig zu liefern.

Wichtig ist, dass diese Methode nicht zur Profilierung der vaginalen Mikroflora begrenzt und kann vernünftigerweise an jede Umgebung, in der die Erkennung und Quantifizierung von teilweise eine Reihe von Ziel-Organismen ist wünschenswert, angewendet werden. Bei der Anwendung der Methode auf andere Umgebungen ist es wichtig, die Möglichkeit der PCR-Hemmung auftreten zu betrachten, als Inhibitoren der PCR häufig Co-Reinigung mit DNA aus vielen Umgebungen ^18. Wo PCR-Hemmung ein Thema ist, kann die Probe entweder verdünnt oder weiter gereinigt werden, um ein ausreichendes Signal für diesen Test zu generieren.