Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

이 방법은 Dumonceaux 외에 보고된 연구에 사용되었습니다. J. Clin. . Microbiol 47 4067-4077, 간접 : 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

전체 절차를 묘사한 도식 다이어그램 그림 1에 표시됩니다.

1. 비드 커플링

이것은 (표 2 참조) 폴리스티렌 Luminex 비즈에 oligonucleotide 프로브를 연결에 사용할 방법을 설명합니다. 볼륨은 시험 기준에 대한 새로운 캡처 프로브의 평가를위한 약간 적응되며 이러한 볼륨은 괄호 안에 표시됩니다.

1. -20 ° C의 dessicator에서 1 - 에​​틸 -3 - (3 - dimethylamiopropyl) carbodiimide HCL (EDC) 분말을 제거하고 실내 온도로 따뜻하게.
2. 그리고 약 20 초 vortexing 20 초 동안 waterbath sonicator에서 sonciation하여 microspheres를 Resuspend.
3. (이것은 5x10 ⁶ 또는 1.25x에 해당 Eppendorf 튜브에 microspheres 400 μl (100 μl)를 전송10 ⁶ microspheres). Luminex는 튜브에 고집과 구슬 복구를 방해에서 uncoupled 구슬을 방지하기 위해 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 튜브 (예 : Eppendorf 단백질 LoBind 튜브, 카탈로그 번호 0030 108.094)의 사용을 제안합니다. 우리는 우리가 일반적으로 사용하는 표준 폴리 프로필렌의 microcentrifuge 튜브를 (예 : VWR 카탈로그 번호 87003-298)을 사용하여 문제를 발견하지 않았습니다.
4. 1 분 14,000 XG에 펠릿. 제거하고 뜨는 폐기하십시오.
5. (N - Morpholino) ethanesulfonic 산성 (MES) 산도 4.5 - 방 - 온도가 0.1 M이 50 μl의 microspheres (12.5 μl)를 Resuspend.
6. 10 MG / 물 속에 ML에서 EDC의 새로운 솔루션을 준비합니다.
   1. 다음 10 MG / ML 물을 추가 분석 규모 EDC의 50-10 MG 무게하여이 솔루션의보다 한 ML을 준비합니다.
7. 5' - 아미노 C12 - 수정한 캡처 microspheres에 oligonucleotide (표 2)와 vortexing으로 섞어 1 nmol을 추가합니다. 1 nmol 200 μm의 oligo 5 μl입니다뉴클레오 티드.
8. 5 초 동안 vortexing하여 microspheres과 혼합 신선한 EDC 솔루션 2.5 μl를 추가합니다.
9. 어둠 속에서 30 분 동안 상온에서 부화.
10. EDC 솔루션 (단계 1.6) 취소하고 (단계 1.6) 위와 같이 물 10 밀리그램 / ML EDC의 새로운 샘플을 준비합니다.
11. 5 초 동안 microspheres과 와동 신선한 EDC 솔루션의 또 다른 2.5 μl를 추가합니다.
12. 어둠 속에서 30 분 동안 상온에서 부화.
13. 십대 초반 0.02 % 20 일 ML을 추가하여 비즈 씻으십시오. 구슬을 resuspend하는 소용돌이 (선택뿐만 아니라 20 초 동안 sonicate).
14. 14,000 XG 1 분 원심 분리기. 제거하고 뜨는 폐기하십시오.
15. 0.1 %의 나트륨 dodecyl 황산 (SDS) 1 ML를 추가하여 다시 비즈 씻으십시오. 구슬을 resuspend하는 소용돌이 (선택뿐만 아니라 20 초 동안 sonicate).
16. 14,000 XG 1 분 원심 분리기. 제거하고 뜨는 폐기하십시오.
17. 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 100 μl (25 μl) (TE) 버퍼 [10m에 비즈를 ResuspendM 트리스 - CL 산도 8.0, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0].
18. 주식 농도를 결정하는 혈구계이나 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운터에서 구슬을 열거합니다.
19. 100 구슬 / TE 버퍼에 μl의 최종 농도 각 비드를 diluting하여 Microsphere 마스터 믹스를 준비합니다. 수영장은 분석의 원하는 플렉스 (예 : 10 - 플렉스 분석에 대한 각 비드의 100/μl의 최종 농도 10 가지 결합 구슬을 혼합)에 해당하는 구슬을 결합.
20. 4 Microsphere 마스터 믹스를 저장 ° C를 어둠 속이라서. 이러한 조건 하에서 보관하면 혼합물은 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.

2. Chaperonin 60 보편적인 대상 (cpn60 UT) 단일 가닥의 amplicon 생산 및 생성.

1. 각 샘플에 대한 중합 효소 사슬 반응 (PCR) 제품를 생성합니다. phosphorothioate과 비오틴 - 수정 5 '프라이머 세트 (표 1) 포함합니다. 믹스에 볼륨과 농도에 대한 표 3을 참조하십시오.
2. PCR이 완료 직후, T7 전 2 μl를 (20 세대) 추가각 PCR 튜브 (PCR 버퍼는 T7 반응으로 충분)로 onuclease. 상온에서 반응 품어 (를 ~ 22-25 ° C) 40 분.
3. 이 부화의 끝에서, 0.5 M의 에틸렌의 12.5 μl를 추가 tetraacetic 산성 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 산도 8.0 믹스를 디아민. 이것은 단일 좌초 PCR 제품의 ~ 64.5μl 총을 제공합니다.

3. oligonucleotide 결합 폴리스티렌 비즈로 단일 좌초 PCR 제품의 하이브 리다이 제이션.

1. 60 Prewarm 악기 ° C 분석 중에 하이브 리다이 제이션 온도를 유지합니다. 악기의 소프트웨어를 사용하여 플랫폼 히터 전원을 켜고 hybridized 비드 혼합을 포함하는 PCR 스타일의 번호판을 맞는 황동 가열 블록을 사용해야합니다.
2. 피펫과 Resuspend Microsphere 마스터 믹스 (단계 1.20)는, Eppendorf 튜브에 해당하는 금액을 분배 캡 튜브, 2 분 waterbath sonicator에 sonicate. 양자 택일로, 비드 resuspe에서 절대 일관성을 보장하기 위해nsion은 microsphere 마스터 믹스는 다음 폴리 프로필렌 Eppendorf 튜브에 원하는 금액을 분배, 위와 같이 sonication을 vortexing 후, pipetting하여 resuspended 수 있습니다.
3. 로우 프로파일 96 - 웰 플레이트 Thermowell PCR (표 2)의 적절한 우물에 단일 좌초 PCR 제품 17 μl (단계 2.2) 분배. 각 자에게 resuspended, sonciated 비드 혼합 33 μl를 추가합니다. 실리콘 커버 (표 2)와 커버하고 부드럽게 누릅니다.
4. 의 프로그램 thermocycler에 접시를 넣고 10 분, 5 분, 60 ° C에 대해 95 ° C 60 ° C 잠깐 만요, 60 ° C 5 분, 끝. 프로그램을 시작합니다.
5. streptavidin - phycoerythrin (SA - PE) 솔루션 신선하게, 당신은 (여러 우물이 추가 확인) 물론 당 25 μl가 필요합니다. 0.1 %의 Sarkosyl,, 50 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0 주식 SA - PE (1 MG / ML) 1X tetramethylammonium 염화 (TMAC) 버퍼 (3 M TMAC와 1시 50분 20 μg / ML을 diluting하여 SA - PE 솔루션을 확인하십시오 , 4 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0).
6. thermocycler가 60 ° C 대기 단계에 도달하면,, 뚜껑을 열고 실리콘 커버와 (thermocycler의 접시를 잡아 당기지 말라) 각 잘 직접 SA - PE 솔루션을 추가, 제거. , 실리콘 커버를 교체 thermocycler의 뚜껑을 닫고 프로그램을 재개한다.
7. 프로그램이 완료되면, 접시를 꺼내 빠르게 읽을 수 BioPlex 컴퓨터로 전송할 수 있습니다. 플레이트는 10 분 이내에 읽을 수 있어야합니다. 60 ° C에서 읽기, BioPlex이 온도 prewarmed되었는지 확인하십시오. 프로브 높이로 사용 악기에 대한 사용자 설명서에 설명된 활용 접시를 수용할 수 있도록 조정되었음을 확신한다.
8. 정확한 비드 및 신호 감지, BioPlex에있는 게이트 설정은 사용중인 microspheres의 종류에 따라 설정해야합니다. 자기 microspheres는 5,000-25,000의 설정을 요구하면서 BioRad의 폴리스티렌 구슬은 4,335-10,000의 게이트 설정을 필요로합니다. 기자 게인 값을 증가 고등 PMT 설정을 사용하여 번호판을 실행하는 옵션도 있습니다. 이것이 내가 할 수배경 신호도 증가 될 것이다 ncrease 낮은 신호의 강도 그러나 그것이 중요하다고는 적절한 대조군을 포함합니다.

4. 대표 결과 :

이 분석을 개발하고 구현하는 우리의 목표 중 하나는 가능한 한 간단하고 유선형으로 만드는 것이었다. 따라서 합리적인 기간에 완료할 수 분석을 개발하기 위해 T7의 exonuclease 처리 시간과 하이브 리다이 제이션 시간을 포함하여, 중요한 포스트 증폭 단계를 최적화. 그림 2A에 나타난 amplicon의 T7 처리는 대부분의 프로브이 짧은 또는 전혀 T7 치료로 거의 신호를했다 등, 신호 생성을 위해 필수적입니다. 신호는 신호 증가 둔화되는 시간에, 약 40 분까지 선형적으로 증가했다. 신호의 저하는 primers의 phosphorothioate 수정이 targe을 방지하는 매우 효과적인 것을 나타내는 T7 처리 시간이 2 시간에서 심지어는 관찰되지 않았습니다t 스트랜드의 저하는 ¹⁵ 설명했다. 우리는 전체 프로토콜 시간을 최소화하기 위해 T7 처리 시간 40 분 선택,하지만 T7 치료가 훨씬 오래 갈 수있는 그림 2A에서 분명하다. 우리는 또한 신호 생성 (그림 2B)에 하이브 리다이 제이션 시간의 효과를 결정하고 10 분 최대 신호에 대한 충분한 것을 발견, 신호에 아니 더 증가로 심지어 하이브 리다이 제이션 4 시간 후에 관찰되었다. 따라서 10 분 하이브 리다이 제이션 단계는 전반적인 분석 시간을 최소화하기 위해 다시 선정되었습니다. 마음에와 같은 InstaGene (바이오 - RAD)로 신속한 DNA 추출 기술과 함께 이러한 결과로, DNA 추출, PCR, 그리고 Luminex 분석을 포함한 전반적인 분석은 4-5시간에 완료하실 수 있습니다.

경계의 메모에서 Luminex 또는 BioPlex 실행하는 동안 폴리스티렌 구슬 집합의 수준은 분석의 효율성에 큰 영향을 줄 수 있습니다. BioPlex 소프트웨어는 발생 비즈 집합의 수준을 표시합니다하나 이상의 구슬이 레이저 경로와 집계에서 하이브 리다이 제이션 신호의 배제의 결과에 감지됩니다. 명백한 비드 집계는 하나의 구슬에 맞는 크기를하지 않은 미립 물질로 인해 수 있으며, 심지어는 공기 방울로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 이벤트 중 하나에서 비드 집계, 공기 방울, 또는 입자의 신호가 삭제됩니다. 대부분의 경우, 우리는 그 구슬 집합이 최소한의 것입니다 (그림 3A)와 각 구슬 100 집계 이벤트의 타겟 레벨이 쉽게 달성됩니다 찾습니다. 때때로, 그러나, 구슬은 집합의 중간 (그림 3B) 또는 심각한 (그림 3C) 수준을 보여줍니다. 이러한 경우에는 데이터의 대부분은 무시되기 때문에, 악기는 100 종류의 구슬 당 행사와 그 결과를 도달 문제가 의심 수 있습니다. sonication 단계 (단계 3.2) 비드 집계를 최소화하기위한 것입니다. 또한, 희석 microsphere 마스터 믹스 (단계 1.20)로 비즈를 저장하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 우리는 hybri로부터 제외 TMAC을 알고있다dization 버퍼는 - 대신 SA - PE의 희석제 (3.5 단계)에 추가하면 - 비드 집계를 최소화하는 데 도움이됩니다. 더욱이, 우리는 이것을 테스트하지 않은 반면, Luminex 또는 BioRad에서 사용할 수있는 최신 자기 비즈가 집계하는 경향이보다 적게 표시 것으로 생각되고 있습니다.

G.을 대상으로 5 플렉스 Luminex 배열의 응용 프로그램의 결과 vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, 그리고 L. 해당 그람 스테인드 질 면봉은 얼룩과 함께 gasseri는 그림 4에 표시됩니다. 이 샘플은 여러 시간 지점에서 한 개인에서 찍은. 시간 0에서, 개인은 그램 얼룩에 따라 BV 진단 (그림 4A)과 배열, G.의 대표 생물의 같은 샘플에서 Luminex 결과 (그림 4B)가 표시되었습니다 vaginalis은 가장 널리 동안 A. vaginae와 L. iners도 긍정했다. 9 일 후, 개인은 여전히​​ BV 긍정과 S되었다G.위한 ignal vaginalis가 대폭 증가가 있었을 때, A. vaginae와 L. iners은 여전히 긍정했다. 그람 양성 bacilli가 뭉개진에서 감지되기로 G.에 대한 신호를하면서 중요한 것은,이 시간 이후에 개인은 (그림 4A) 정상 microbiota로 전환 시작 vaginalis은 감소하고 L.위한 신호 iners (그림 4B) 증가했다. 그램이 G.을 감지하는 데 실패 얼룩 있지만,이 방법 (G.의 vaginalis 및 / 또는 A. vaginae에 대한 긍정적인 샘플 BV는 긍정적인 것으로 간주되었다) ¹³ BV 우리의 원래 정의에 의해,이 개인은 모든 시간 지점에서 긍정적인 BV되었습니다 후자의 두 시간 포인트에서 vaginalis. Luminex 방법은 여기서 설명으로 동향에 쉽게 시퀀싱 기반 방법에 비해 수 있으며, 유기체의 정체성과 풍부한에 대한 추가 정보를 제공하면서 Luminex 분석의 결과는 일반적으로 그램 얼룩 ¹³ 증명할.

그림 1. 복잡한 임상이나 환경 시료의 microbiota 프로필을 결정하기위한 Luminex 프로토콜의 도식 다이어그램. 프로토콜은 관심의 샘플에서 추출되었습니다 템플릿 DNA와 함께 시작합니다. (1)을 사용하여 템플릿 DNA에서 PCR 제품을 생성 스트랜드 특정 biotinylated, 수정되지 않은 cpn60 UT PCR primers (표 1)과 함께 phosphorothioate - 수정 cpn60 UT PCR의 primers, (2)이있는 microbiota 대표하는 PCR 제품 풀을 생성 비오틴을 한 가닥의 수정을 phosphorothioate (3) phosphorothioate - 수정 가닥을 저하되므로 비오틴과 5 '끝에 수정 단일 좌초된 DNA를 생성 수 없습니다 T7의 exonuclease와 이중 좌초 PCR 제품을 다이제스트 (4) 커플 종 특정 cpn60 UT 프로브로 폴리스티렌 비즈 - 각 구슬은 고유한 스펙트럼 주소 (구슬 색깔로 표시)를 갖는다는 것 ILuminex 또는 바이오 플렉스 계기로 뚜렷한 S는 (5) 관심이 샘플에서 종 특정 oligonucleotide 결합 구슬의 제품군에 생성된 단일 좌초 PCR 제품을 잡종 (6)에 바인딩 streptavidin - phycoerythrin 공액 추가 biotinylated 단일 좌초 PCR 제품 및 하이브 리다이 제이션의 지표 역할을하고 있지만, (7) Luminex 또는 바이오 플렉스 악기를 사용하여 스펙트럼 주소 (구슬 정체성)와 하이브리드화 신호 강도를 확인합니다. 최소한 100 구슬은 각 구슬 정체성에 대한 집계되고 phycoerythrin 신호의 평균 형광 강도 (MFI)은 출력으로보고됩니다. 최대 100 개의 서로 다른 종류의 구슬을 동시에 평가할 수 있지만 세 비드 종류의 차별을 보여주는 분석이 그림입니다. (8) PCR의 MFI가 동일한 예제에서 생성된 복제하는 경우는 (1 꼬리 학생의 T - 테스트, P <0.05) 주어진 구슬에 대한 부정적인 컨트롤보다 훨씬 큰, 예제는 그 생물에 대해 긍정적인 것으로 간주됩니다.

그림 2. Luminex 분석 매개 변수의 최적화. Peptostreptococcus의 anaerobius을 타겟으로하는 다섯 가지 프로브는 P. 포함하여 질과 연관된 것으로 알려진 20 박테리아의 복제된 cpn60 UT를 포함 plasmids를 구성된 혼합 템플릿에서 생성된 amplicons과 함께 사용되었다 anaerobius. (A). T7의 exonuclease 처리 시간의 효과. 위에서 설명한 프로토콜은 다음했지만 T7의 exonuclease과 치료 시간 전에 하이브 리다이 제이션 및 평균 형광 강도 (MFI) 모든 프로브에 대한 결정되었습니다하기 위해 다양한되었습니다. (B). 하이브 리다이 제이션 시간의 효과. 위에서 설명한 프로토콜은 하이브 리다이 제이션 시대의 다양한 이어했다. 프로브의 동일한 세트 및 평균 형광 강도 (MFI)가 모든 프로브에 대한 결정되었다에서 같은 템플릿에서 생성된 amplicon와 함께 사용되었습니다.

그림 4. 동일한 개인에서 가져온 샘플에서 순차 BV 진단에 5 플렉스 Luminex 배열의 응용. (A). BV 각 샘플을 평가하는 데 사용되는 전통적인 진단을 보여주는 그람 스테인드 슬라이드. (B). 5 플렉스 Luminex 배열의 응용 프로그램 준비하고 (A)에 표시된 동일한 사 샘플이 프로토콜에 설명된대로 실행. 그의 MFI 신호 박테리아 타겟은 우리의 정의 (1 꼬리 학생의 T - 테스트, P <0.05)이 별표 (*)로 표시됩니다에 의해 상당히 긍정했다.

신호 생성의 특이성은 매우 중요합니다, 당신은 신호가 진정되는 유기체에서 발생 amplicon의 검출을 반영 관찰 확신해야합니다. 이러한 PrimerPlex (프리미어 Biosoft)와 같은 소프트웨어는 효율적으로 잡종을 것입니다 프로브를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다,하지만 그들은 나 이외의 대상 종에 간 잡종 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다. 범용 PCR primers의이 프로토콜에 설명된대로 사용하면 생성된 amplicon이 예제에있는 생물을 모두 나타내는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 그것은 cpnDB, cpn60 UT 시퀀스의 데이터베이스 ¹⁶ 프로브 설계 소프트웨어에 의해 제안 시퀀스를 비교하여 상호 하이브 리다이 제이션의 가능성에 대한 잠재적인 프로브를 분석 그러므로 중요하다, 여러 생물과 일치하는 프로브는 피할 수있을 수도있다면 . 또한, 잠재적으로 특정 프로브가 확인되면, 우리는 유효성 검사를 탐사하는 방식을 데리고있는 복잡한 인공 테mplate는 관심 ¹³ microbiota와 관련된 생물의 다수의 복제된 cpn60 UT에 해당하는 준비가되어 있습니다. Amplicon은 다음 대상 템플릿을 포함한 전체 "혼합 패널"에서 생성된이며, 신호는 대상 유기체의 cpn60 UT를 포함하지 않는 혼합 패널로 구성된 두 번째 템플릿에서 생성된 것을 비교합니다. 높은 신호 대 잡음 비율 (신호가 전체 패널에서 생성되며 소음이 대상 서식없이 패널에서 생성된 어디)를 생성하는 프로브가 최종 분석에 포함 선택됩니다. 우리는 일반적으로 최종 Luminex 배열에 포함 하나를 선택하기 전에 각 대상 생물에 대해 4-5 가능한 프로브를 분석했습니다.

긍정적인 결과의 정의는 고려해야 할 문제입니다. 우리는 다른 프로브는 본질적으로 다른 신호 대 잡음 비율을 가지고 것을 발견했습니다, 그래서 긍정적인 결과가 defin이다 의하여 우리는 접근 방식 결정학생의 T - 테스트 (1 꼬리) : 매우 간단한 통계 검사로 에드. 긍정적인 결과는 "아니오 템플릿"컨트롤 샘플의 MFI를 비교에 의해 정의되며, MFI는 P <0.05에서 컨트롤보다 훨씬 높은 경우, 결과는 그 생물에 대해 긍정적인 것으로 간주됩니다. 일반적으로이 독립적으로 생성 amplicons 중복으로 테스트 각각 있습니다. PCR과 T7의 exonuclease 단계는 단일 좌초 PCR 제품의 64.5에 대한 μl (단계 2.3)을 만들고이 겨우 17 μl가 3 하이브 리다이 제이션 assays에 대한 충분한 하이브 리다이 제이션 (단계 3.2)에 사용되지만, 우리는 일반적으로 두 가지 amplifications에서 중복을 분석 웰스의 과도한 번호를 사용하지 않고 고유의 기술 복제를 제공합니다.

우리가 조사도이 분석의 측면은 세미 양적 성격이다. 주어진 프로브에서 MFI 신호가 주어진 유기체의 qPCR 정해진 풍부 (창병 순위 상관 계수 & R에 잘 연결합니다호, = 0.4686, P <0.0001) ^13하지만, 동적 범위가 제한되고 신호가 amplicon은 40 사이클의 엔드 포인트 PCR 후 분석이기 때문에 예상대로 높은 대상 유기체 수준에서 포화하는 경향이있다. 그것이 세미 양적이기 때문에, 유기체 풍부 동향을 모니터링 할 수 있습니다 패턴 (높은 abundances에서 신호 채도에 관한 마음에 경고를 유지) 관찰했다. 예를 들어, 그림 4는 정상으로 BV에서 변경으로 시간이 지남에 따라 개인의 질 microbiota의 프로필을 보여줍니다. 이런 일이 발생으로 G.하는 신호가 해당 다음 vaginalis (BV - 관련 생물 ¹⁷⁾ 증가하고, 기울면 사랑하는 동안 모니터링 시간의 과정 L.에 대한 신호를 통해 iners이 증가합니다. 대응 그램 얼룩, BV 진단에 대한 현재 "황금 표준", 그람 양성 bacilli 처음 결석 있지만 나중 포인트에서 감지 아르 의하여 패턴을 보여줍니다. Luminex 메서드는 샘플에있는 생물을 식별하고 s를 제공합니다 모두그들의 친척 abundances에 대해서 ome 정보를 제공합니다. 이러한 유형의 정보는 잠재적으로 특정 생물의 abundances에 바람직하지 않은 경향에 대한 모든 종류의 샘플을 모니터하고, 동시에 생물의 많은이 데이터를 제공할 수있는 데 사용할 수 있습니다.

중요한 것은,이 방법은 질 microbiota의 프로 파일링 제한되지 않고 합리적으로 대상 생물의 범위의 탐지 및 부분 부량이 바람직 어느 환경에 적용할 수 있습니다. 다른 환경에 방법을 적용하면 일반적으로 많은 환경 ¹⁸ DNA와 공동 정화 PCR의 억제제로서, PCR 억제가 발생의 가능성을 고려하는 것이 중요합니다. PCR 억제가 문제가 어디에, 샘플이 분석에 대한 충분한 신호를 생성하기 위해 중 희석하거나 더 깨끗하게하실 수 있습니다.