Una introducción a las avispas parasitarias de

Chiyedza Small*^1,2, Indira Paddibhatla*^1,2, Roma Rajwani¹, Shubha Govind^1,2

¹Biology Department, The City College of New York, CUNY, ²The Graduate Center, The City University of New York

* These authors contributed equally

El protocolo completo para el experimento se divide en cuatro etapas (Fig. 9). (1) El cultivo de las avispas en las larvas de mosca, (2) Configuración de las infecciones y la preparación de animales para la disección, (3) aislamiento y la fijación de huésped / parásito de las estructuras, (4) El análisis de los tejidos inmunes.

1. Avispas en el cultivo de larvas de Drosophila

Mantenimiento de las culturas de avispas requiere una planificación cuidadosa. Con relación a las moscas de cultivo, que es bastante laborioso. Mantenemos nuestras colonias de avispas en el laboratorio de larvas o pupas de la cepa yw de Drosophila a 24 ° C. El cultivo de las avispas se trata de mantener una fuente continua de los ejércitos en la etapa de derecho y la limpieza de los "infectados" viales de las moscas que surgen antes de que las avispas hacer. Las avispas siguen el método de determinación del sexo haplodiploid y por ello es importante que las hembras se aparean antes de que infecten a los anfitriones.

1. El día 1, añadir un pequeño toque de recién pre-levadura comparación pasta (preparada mezclando 1 ml de agua en aproximadamente 1 g de levadura seca activa en un vial de mosca alimentos frescos La receta del alimento mosca no es crítica;. que crecen en el medio de moscas corn-meal/sucrose/agar. Lugar 50-60 joven (2-4 días de edad) para adultos yw (o otra cepa de tipo salvaje en esencia) vuela a poner huevos durante 48 horas a 24 ° C.
2. El día 3, eliminar las moscas de los viales. Colocar un tapón de zumbido en el vial con una gota de miel en el lado interior del tapón zumbido. La miel se diluye 2:01 en agua destilada.
3. Uso de CO _2, anestesiar a las avispas y ordenar 6-8 y 6-8 hembras los machos que son aproximadamente 2-3 días. Añadir a la ampolla que contiene 0-48 ejércitos antiguos hora. Tenga en cuenta que las avispas son más sensibles al CO ₂ que las moscas, y puede que tenga que calibrar su exposición al gas. Investigadores de Drosophila no utiliza una anestesia estándar de Drosophila diseño de la estación. Un buen punto de partida para anestesiar a las avispas es establecer la presión de CO ₂que aproximadamente la mitad de lo que se necesita para las moscas anestesiar.
4. Vuelva a colocar el tapón de Buzz (con miel) en el vial. Con suavidad, coloque el frasco en su lado hasta que las avispas se despierta.
5. Coloque estos viales con larvas de mosca y las avispas en una incubadora de 24 ° C.
6. El éxito de las infecciones se retrasará pupariation ligeramente. Los hosts que han sufrido un ataque de avispa, pero son capaces de defenderse a sí mismos (o si no están infectados), continuar con el desarrollo siguiendo el horario normal y las moscas adultas emergen de estas pupas muy por delante de las avispas.
7. Dependiendo de la especie de avispa y la temperatura, las avispas Eclose en 25-30 días.
8. Quite las moscas adultas de los viales en los que las avispas se están desarrollando.

2. Configuración de las infecciones y preparación de animales infectados para Disección

Antes de empezar, tengo un par de vidrio limpio o platos de plástico Petri, un plato de Pyrex la disección con 9 depresiones, Kimwipes, agua destilada (en una botella con atomizador), El 70% de etanol (en una botella rociadora), 1X PBS (en una botella rociadora), portaobjetos, y una espátula pequeña, manejable limpio.

1. Para configurar las infecciones, siga los pasos 1-5 arriba. Dependiendo del experimento, puede ser necesario el uso de máquinas que están aproximadamente a la misma fase de desarrollo. Para esto, egglays de 2-6 horas se puede utilizar para la infección.
2. Para cosechar las larvas infectadas (para la disección de los tejidos inmunológicos o parásitos), retire el contenido de los viales de la mosca en un vaso pequeño de plástico o caja de Petri.
3. El uso de un microscopio estereoscópico y unas pinzas finas (pinzas), cuidadosamente recogida 6-10 larvas, uno por uno y colocarlos en una depresión bien con PBS 1X primero, y luego transferirlos en el agua, el 70% de etanol, agua y PBS 1X, sucesivamente. El propósito de estos pasos es liberar a los animales de la mosca de alimentos y limpie bien y esterilizar su superficie. El enjuague en agua diluye el etanol y el enjuague final en PBS elimina el etanol. Para el Paso 3 a continuación, lo mejor es no salir de laanimales en PBS durante más de 10 minutos.

3. El aislamiento y la fijación de Host / parásito Estructuras

Fondo

El ganglio linfático larval es un pequeño órgano hematopoyético ^7. En la tercera estadio larval, la glándula linfa contiene un gran par de lóbulos anterior que flanquean el vaso dorsal (Fig. 3A, 6B-C, 7A-D). Los lóbulos anteriores se dividen en regiones especializadas con propiedades de células únicas ^7. Progenitores de tres tipos de células, plasmatocitos, lamellocytes y células de cristal residen en los lóbulos anterior. Células pericárdicos separar los lóbulos anterior de los lóbulos más pequeños posteriores. El ganglio linfático de Drosophila es un modelo para la hematopoyesis de insectos y mamíferos ^8,9.

La grasa corporal es funcionalmente similar a la del hígado de mamíferos. La respuesta humoral se desencadena en el cuerpo de microbios siguiente de grasa o una infección de avispa ^1,4,10. ComoEn consecuencia, una combinación única de genes de péptidos antimicrobianos son activadas y los péptidos son secretados en la hemolinfa ^1. La grasa corporal es también el tejido primario para la producción de glucógeno y triglicéridos y almacenamiento ^11. El cuerpo de las larvas de grasa ocupa el volumen sustancial de la hemocele y, por lo que a diferencia de la glándula linfática, es fácil de localizar. Ahora vamos a demostrar cómo disecar el ganglio linfático y la grasa corporal de larvas de tercer estadio.

Antes de empezar

¿Necesitas unas pinzas finas (pinzas) y de etanol limpiar portaobjetos.

Linfático disección de la glándula de larvas

1. Con unas pinzas finas, seleccione una larva de tercer estadio mantuvo vagando en 1X PBS.
2. Coloque la larva en un portaobjetos de microscopio.
3. El uso de pinzas, la posición del animal con la cara ventral hacia arriba.
4. El uso de dos pares de pinzas, mantenga el animal a cada lado del extremo posterior (puntas de flecha 1, Fig. 3A) y gently tirar de la cutícula para introducir un pequeño desgarro, superficial en la cutícula.
5. La hemolinfa contiene hemocitos, el intestino y la grasa corporal comenzará a escapar de la cavidad del cuerpo. La hemolinfa se puede tomar con un 10 l "pipetteman" para hacer frotis, si es necesario.
6. Colocando ambas pinzas en el lado derecho del animal debajo de los ganchos boca (puntas de flecha 2, fig. 3A), suavemente rasgar la cutícula.
7. Mueva ambas pinzas hacia el lado izquierdo del animal debajo de los ganchos boca (puntas de flecha 2, fig. 3A) y cuidadosamente hacer otro pequeño desgarro.
8. Mientras mantiene la boca ganchos del animal, tire suavemente la cutícula hacia el extremo posterior del animal (como si pelar de nuevo).
9. A medida que la cutícula se retiró, el cerebro, la grasa corporal, los discos imaginales, las glándulas salivales, y se convertirá en proventrículo expuestos. La cutícula es ahora independiente en el extremo posterior, pero aún tendrá el vaso dorsal con el ganglio linfático que se le atribuye. </ Li>
10. Cortar el proventrículo y alejarlo de la zona de la glándula linfática. El ganglio linfático será debajo del cerebro, aunque puede que no sea capaz de verlo.
11. Con cuidado, se burlan de distancia de la grasa corporal, el intestino, las glándulas salivales y otras estructuras que pueden estar sentados en la glándula. Tenga cuidado de no separar el ganglio linfático de la glándula anillo y el vaso dorsal situado por detrás del cerebro. El ganglio linfático se colocará plana contra el portaobjetos del microscopio.
12. Retire con cuidado todos los tejidos adicionales fuera de la glándula linfática hasta que toda la glándula se desarrolla en los lóbulos anteriores de la serie final de las células del pericardio.

Nota: Un ganglio linfático disección adecuada tendrá un par de lóbulos anterior y dos pares de lóbulos posteriores a lo largo del vaso dorsal (Fig. 6B). Los lóbulos se pueden dañar fácilmente o se pueden caer desde el vaso dorsal. Las muestras por lo tanto, debe manejarse con mucho cuidado. La glándula también hcomo una tendencia a arrugarse o contrato. Suavemente enderezar el órgano en su extremo posterior, permite que todas las partes y las células que se presentará también. Esto es especialmente necesario para los protocolos de inmunotinción.

Fay la disección del cuerpo

1. En el escenario de la disección Zeiss 1000 microscopio de disección (cualquier equipo estéreo microscopio de disección se puede utilizar), coloque un cuadro de luz que permite que la luz incidente se transmite a través de la muestra. Coloque tercera larva de la Etapa 2 en un portaobjetos en 200 l de PBS 1X. Incline la fuente de luz fuera de la muestra, de modo que el organismo aparece transparente y por lo tanto es fácil de visualizar sus órganos internos.
2. El uso de pinzas, la posición del animal para que el extremo anterior está lejos de ti.
3. El uso de pinzas, mantenga la cutícula de la larva en el lado izquierdo de anzuelos de la boca (punta de flecha 1, fig. 3B). Utilizando las pinzas otros, suavemente rasgar la cutícula todo el camino hasta el extremo posterior (arrowhead 2, Fig. 3B). No rasgar la cutícula lejos del cuerpo en el extremo posterior.
4. Muy suavemente empezar a eliminar el intestino a un lado.
5. Suavemente retirar el cerebro, los discos imaginales, y la glándula anillo con el ganglio linfático ejecuta a través del vaso dorsal.
6. No quite las glándulas salivales ya que es el cuerpo de grasa adherida a estas glándulas.
7. Retire con cuidado la cutícula y dejar la grasa corporal en la diapositiva en 1X PBS.

Nota 1: La grasa corporal tiene sólo una capa de células y por tanto es importante tener todas las células aplanadas en el mismo plano en el portaobjetos de vidrio. Las células son endopolyploid y fácil de visualizar. Una muestra de cuerpo bien diseccionado grasa debe mantener contactos normales de las células, y deben tener un mínimo de glóbulos de grasa alrededor de la muestra de disección (Fig. 6i, J).

Nota 2: Si los huevos de avispa no se verán afectados por el sistema inmune del huésped, se iniciate el desarrollo casi de inmediato. Los primeros estadios de desarrollo del parásito (de la larva huésped) son fácilmente accesibles desde el hemocele disección (Fig. 8). Huevos de parásitos o larvas o bien se adhieren a la grasa corporal o de otros órganos, o simplemente se deslizan sobre el portaobjetos de vidrio durante la disección.

4. El análisis de tejidos inmunes

1. Aire ganglios linfáticos secos durante 5-10 minutos y quitar 1X PBS a partir de la diapositiva de grasa corporal antes de fijar durante 5-10 minutos con paraformaldehido 4% preparada en PBS. Cada diapositiva puede tener varios ganglios linfáticos disecados para la tinción. Mover diapositivas con las muestras fijadas en una cámara humidificada casera para los pasos subsiguientes. Esta cámara se prepara mediante la colocación de dos piezas de toallas de papel húmedas plegadas, en la parte inferior de una caja de punta de plástico vacío micropipeta. Uno o más diapositivas con muestras pueden ser colocados en la parte superior del divisor utilizado para sujetar las puntas.
2. Como tal, el análisis de los tejidos inmunes se realiza siguiendo métodos estándar quese combinan en el etiquetado de células in vivo y ⁴ inmunohistoquímica indirecta.

5. Los resultados representativos

1. Infección por Avispa activa la expresión del reportero vía de peaje Drosomycin-GFP (Fig. 6 G, J). En este experimento, el efecto de avispa-infestación sobre la expresión génica es visualizado en vivo utilizando un GFP-reportero unido al promotor Dres ^12. En los animales de control no infectadas, la expresión GFP no se detecta. La señal de GFP se detecta claramente en el citoplasma y el núcleo de las células de la grasa corporal, disecados de animales infectados con L. victoriae. Para obtener los mejores resultados, la relación de las avispas: las máquinas debería ser 1:10. La infección debe durar durante al menos 2 horas. Infestación de Correos, se intensifica la señal de los doctores-GFP y muchas células de grasa corporal son las buenas prácticas agrarias-positivas, incluso hasta 72 horas ^1,4.
2. Infección por Avispa induce la diferenciación de lamellocytes en la lglándula ymph (Fig. 6D). Lamellocytes rodear y bloquear el desarrollo de avispa (Fig. 6H). Los ganglios linfáticos son disecados para visualizar los cambios celulares inducidos en los lóbulos anteriores después de L. victoriae infección. Recientemente disociados lamellocytes están presentes en la periferia de los lóbulos disecados; lamellocytes están marcados con un transgén GFP que es impulsado por el deforme potenciador (MSNF9-GFP). Todas las células se visualizan con actina filamentosa utilizando rodamina marcado con faloidina. Nótese que la integridad de los lóbulos anterior se interrumpe en estas glándulas como la membrana basal que rodea normalmente el lóbulo de forma continua (Fig. 6C), es ahora discontinua (Fig. 6D). Desde las disecciones mismos, lamellocytes en la hemolinfa también puede ser visualizado en frotis (Fig. 6G); algunos de los cuales están asociados con la estructura cápsula formada para bloquear el desarrollo del parásito (Fig. 6H).
3. Sproteína pätzle se expresa en la mayoría de las células del ganglio linfático de larvas (fig. 7C, D). Para detectar SPz en los ganglios linfáticos disecados, hemos seguido un protocolo estándar para la tinción de las células del ganglio linfático con anticuerpos anti-SPZ anticuerpos ^4. In vivo, SPz aumento de los niveles en las células de las glándulas linfáticas después de la infección de avispa (compárese con los paneles de la figura. E 7C, con 7G, I, y 7D paneles, F con 7H, J).
4. Las etapas tempranas y tardías de desarrollo de las larvas de la avispa de acogida y pupas (Fig. 8). Para examinar las etapas de desarrollo de las avispas, larvas infectadas se diseccionan en diversos puntos temporales después de la oviposición. Aquí mostramos un ejemplo de estas etapas de la Leptopilina spp. De tipo salvaje infectado D. melanogaster instalados.

Figura 1. Las diferentes especies de avispas y de oviposición de huevos de avispa. Todas las imágenes se obtuvieron usando un microscopio estereoscópico Leica. Una avispa hembra oviposita Trichopria drosófilas huevo en un D. melanogaster pupa. Ampliación B de la postura de la mosca de la fruta en anfitriones Trichopria pupa. puntos C melanina indican curación de heridas en el sitio de oviposición. D L. boulardi masculino. E G. xanthopoda hembra. F L. mujer victoriae. G L. heterotoma masculino (izquierda) y el femenino.

Figura 2. Los ciclos de vida que muestran la carrera de marcha / avispa brazos. Los resultados de la oviposición en uno de dos resultados. Cualquiera de las reacciones inmunitarias del huésped éxito para bloquear el desarrollo de la avispa (izquierda), o la avispa frustra Respo inmune del huéspedNSES y tiene éxito (derecha). Modificado de Melk y Govind, 1999 ^18.

Figura 3. Larvas de tercer estadio mostrando los órganos de interés antes de la disección. Todas las imágenes se obtuvieron usando un microscopio estereoscópico Leica. Un hml> larva de buenas prácticas agrarias con las buenas prácticas agrarias (verde) de fluorescencia (flecha) en las células individuales de la glándula linfática indica la ubicación general de las glándulas linfáticas en un animal intacto. La larva fue fotografiada con la óptica de campo de fluorescencia y brillante. Puntas de flecha apuntan a los lugares importantes para el protocolo de Disección de ganglios linfáticos se describe en el texto. B Cg> larva de buenas prácticas agrarias con la expresión de GFP en la grasa corporal para indicar la ubicación del órgano en un anim intactacol. Puntas de flecha apuntan a los lugares importantes para el protocolo de disección de la grasa corporal descrita en el texto.

Figura 4. Inmuno-genética circuito de la respuesta inmune del huésped contra los componentes básicos de parasitoides ataque. De la vía de peaje se muestran. Spätzle (SPZ) es activado por la enzima proteasa de procesamiento Spätzle, SPE. Activado SPz sirve como ligando de peaje. Señalización intracelular conduce a la activación de factores de transcripción NF-kB, dorsales y el DIF. Cactus sirve como inhibidor IkB de la vía. La activación de Drosomycin, una vía canónica Línea gen diana, se puede controlar el uso de cepas transgénicas de mosca con el reportero GFP (ver fig. 6I, J).

Figura 5. La encapsulación en respuesta a L. victoriae infestación enSerpiente> GFP-dl anfitriones de Drosophila. Un potenciador en el gen de la serpiente se expresa en células de la sangre ^13. Cuando este potenciador impulsa la expresión de la proteína de fusión GFP-dorsal en un transgén, dorsal se detecta a través de la fluorescencia verde de GFP en algunos plasmatocitos y lamellocytes que componen las cápsulas y los agregados. Todas las imágenes fueron obtenidas con un microscopio confocal Zeiss LSM. Un huevo de L. aumentos victoriae. Lamellocytes BD (flechas blancas) en el extremo posterior de la autorización expresa de huevo GFP-Dorsal. CD más altos de la muestra en el panel B. EH Las muestras son contrastados con rodamina-phalloidin etiquetados para visualizar actina filamentosa (F-actina, rojo) y con Hoechst 33258 para visualizar el ADN (azul). E encapsulado huevo de L. victoriae. F melanized cápsula de L. victoriae. GH L. victoriae INFEcción induce a la célula de sangre (plasmatocyte y lamellocyte) la agregación.

Figura 6. La respuesta inmune contra la infección de avispa. Imágenes de los grupos A y B se obtuvieron utilizando un Zeiss Axio Scope. Las imágenes de los paneles de CJ se obtuvieron usando un microscopio confocal Zeiss LSM. Una larva que muestra huevos de avispa melanized encapsulado (punta de flecha) a través de la cutícula transparente. B Representante tercer estadio larval ganglio linfático se tiñeron con Hoechst 33258 revela células de todos los lóbulos y las células intercaladas del pericardio. Barra de escala representa 100 μ. CJ Todas las muestras se tiñeron con Hoechst 33258 (a los núcleos de la etiqueta) y rodamina phalloidin (para marcar la F-actina). CD Anterior lóbulos de las glándulas linfáticas del control (C) y L. victoriae-infectados (D) MSNF9-GFP animales. En los animales infectados, la expresión ESNG potenciador, específicos para lamellocytes ^14, se detecta con un reportero GFP nuclear. plasmatocitos E aisladas de animales infectados no expresan las buenas prácticas agrarias. Estos animales tienen muy pocas o ninguna. Lamellocytes F plasmatocitos (GFP-negativo, flecha corta) y recién diferenciados, lamellocytes más grandes (flechas largas) con expresión débil GFP nuclear de L. victoriae infectada MSNF9-GFP larvas. G libres y agregados plasmatocitos y lamellocytes del hemocele de una L. victoriae infectada Dres-GFP larvas. La expresión del reportero de los doctores-GFP se activa en algunos plasmatocitos (flecha corta), pero no en lamellocytes (flechas largas) después de la infección. H encapsulado y larva de avispa melanized de L. boulardi infectados MSNF9-GFP larva huésped. Numerosos MSNF9-GFP-positivas lamelloctyes rodean a la larva de avispa (estructura oscura; flecha gruesa) y muestran una fuerte expresión GFP nuclear (flechas largas). Esta bandejaEl previamente publicado en PLoS One ^15. IJ células de grasa corporal disecados de infectados (I) y L. victoriae-infectado (J) Dres-GFP larvas. GFP es nuclear y citoplasmática en las células de grasa corporal de los animales infectados. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 7. Spätzle expresión después de la infección avispa parasitoide. Las muestras AJ se counterstained con Hoechst 33258 para visualizar el ADN. Todas las imágenes fueron obtenidas con un microscopio confocal Zeiss LSM. Lóbulos AF Anterior disecados a partir de larvas yw no infectada. Las muestras fueron procesadas por inmunotinción indirecta sin anticuerpo primario (A y B) o con anticuerpos anti-spz anticuerpo (rojo; C, D, E, F) y counterstained con Alexa Harina-faloidina a etiqueta F-actina en las células (verde;. B, D, F) GJ Anterior lóbulos disecados a partir de larvas yw infectada y teñidas con anti-anticuerpos SPz (rojo, G, H, I, J) y Alexa Fluor-phalloidin (verde. Paneles H, J) EF mayores aumentos de muestras en C y D, respectivamente. aumentos IJ superior de las muestras en G y H, respectivamente. Las barras de escala en los grupos ad, G, H representan 50 micras.

Figura 8. Fases de larva y pupa de L. heterotoma y L. boulardi. etapas individuales se aislaron de infestación de la mosca después de larvas y adultos los ejércitos, como se indica. Todas las imágenes se obtuvieron utilizando un Zeiss Axio Scope. Fila superior AF L. etapas heterotoma, 1-6 días después de la infección. fila inferior AF postembrionario L. boulardi etapas, de 4 a 12 días después de la infección.

Figura 9. Diagrama de flujo del protocolo experimental.

El interés por las avispas parásitas de Drosophila está surgiendo como las técnicas moleculares para descifrar genomas completos se vuelven eficientes y rentables. Sin embargo, en relación con sus excepcionalmente bien estudiados los ejércitos, muchos aspectos fascinantes de la biología avispas siguen siendo oscuros. Estos incluyen temas relacionados con la gama de huéspedes, la inmunosupresión, superparasitismo, y el comportamiento. El objetivo de esta presentación fue demostrar los efectos de la infección en los tejidos inmunes de la mosca. Las técnicas de disección demostrado aquí pueden ser utilizados para el análisis de la expresión génica a nivel del ARN (hibridación in situ), o para la extracción del ácido nucleico para microarrays o PCR, o por análisis de Western de las proteínas. Una gran variedad de cepas de moscas se encuentran disponibles en los centros de acopio y laboratorios de investigación individuales para manipular y marcar a las células inmunes. La elección de las cepas de ventanas está dictada por las preguntas experimentales. Estas técnicas de disección también puede ser utilizado para el análisis de inmunetejidos de otras especies de Drosophila.