Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro

Gabriela Oana Bodea, Sandra Blaess

Institute of Reconstructive Neurobiology, University of Bonn

Certaines parties du présent protocole sont modifiées de Daza et al., 2007 ^7.

1. Préparatifs

1. Peut être préparé un jour à l'avance
   1. Préparer 1X tampon de Krebs (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH ₂ PO _4: H ₂ O, 1,2 _mM de MgCl2, 2,5 _mM de CaCl2, 11 mM de glucose, 25 mM NaHCO _3; ajuster le pH à 7,4. Stériliser par filtration (0,22 um taille des pores) et conserver à 4 ° C.
   2. Préparer le milieu de culture (20 ml): 5 ml de HBSS, 9 ml de DMEM glucose élevé, 850 ul de glucose à 30%, 5 ml de sérum de cheval (25%). Ajouter 200 uL Penicllin 100X / streptomycine. Conserver à 4 ° C.
2. Préparer avant de commencer la dissection
   1. Préparer 100 ml de 4% de fusion bas agarose (agarose LMP) en 1X tampon de Krebs: micro-ondes la solution jusqu'à ce que l'agarose est complètement dissous, puis placer l'agarose dans un bain d'eau à 45 ° C.
   2. Remplissez le vibreurBac tampon Tomé avec tampon glacé 1X Krebs et commencer à l'élément de refroidissement (conserver à 4 ° C). Fixer une lame de rasoir dans le porte-lame et mettre en place la zone vibratome avec un scalpel, un pinceau fin et une cuillère perforée mini de ramasser les morceaux. Préparer des boîtes de Petri stériles (35 x 10 mm) avec 1x tampon de Krebs pour la collecte des tranches. Restez sur la glace.
   3. Mise en place de la zone de dissection avec des plats de Pétri (100 x 15 mm) pour la dissection et les petits boîtes de Petri stériles (35 x 10 mm) pour l'intégration, de petits ciseaux, deux pinces fines (Dumont 5), une cuillère perforée mini, un verre pipette Pasteur polies au feu avec une ronde fermée pointe et 1 L de 1X tampon de Krebs sur la glace. Essuyez tous les outils de dissection à l'éthanol 70%.
   4. Ajouter milieu de culture pour les puits d'une plaque de six puits (1,5 ml / puits) et le placer dans un incubateur à 37 ° C.
   5. Préparer une plaque de six puits avec 1,5 ml / puits stériles 1X tampon de Krebs et 15 uL Penicillium / streptomycine (100X) / puits. Dans des conditions stériles, placer Milinserts de culture cellulaire licell dans les puits. Placer la plaque de six puits à côté de la vibratome afin que les tranches de cerveau peuvent être transférées sur des membranes de filtre immédiatement après la coupe.

2. Dissection et enrobage de cerveaux d'embryons

1. Anesthetize une souris femelles gravides en utilisant l'isoflurane et le sacrifice de la souris par dislocation cervicale (embryons doivent être au stade E12.5). Disséquer l'utérus de la souris en tirant vers le haut de l'utérus avec une pince. Utilisez une pince d'autres pour séparer les mésométrium loin de l'utérus. Placez l'utérus dans glacée 1X tampon de Krebs. Utilisez une pince fine pour séparer la paroi musculaire de l'utérus, de la membrane de Reichert et le viscéral du sac vitellin de l'embryon. Retirez les embryons dans l'utérus. Placer les embryons disséqué dans un plat séparé de Petri avec tampons stériles 1X Krebs.
2. Disséquer le cerveau sous un stéréomicroscope. Pour disséquer le cerveau, d'abord couper la tête de l'embryon. Fixez la têteen perçant une pince fine à travers la tête (au niveau des yeux). Utilisez une autre paire de pinces pour enlever soigneusement la peau et le crâne. Utilisez une pince pour soulever délicatement la cervelle et le transférer dans une boîte de Pétri stériles avec tampon 1X Krebs. Il est très important que l'intégrité de l'ensemble du cerveau est maintenu lors de la dissection, puisque les dommages aux tissus du cerveau va créer des problèmes (comme le déchiquetage des tissus) pendant la coupe sur le vibratome.
3. Laver le cerveau une fois dans 4% à faible point de fusion (LMP) agarose. Intégrer 2-3 cerveaux à un moment dans l'eau douce de 4% d'agarose LMP. Placez les plats intégrant sur la glace aussi uniforme que possible. Utiliser une pipette Pasteur avec une pointe polie au feu rond pour soulever le cerveau jusqu'à ce que le fond de l'agarose est solidifié. Le cerveau doit s'installer dans une position horizontale plane au fond du bloc d'agarose.
4. Après l'agarose a entièrement solidifié (après environ 3 min), coupez l'agarose entourant le cerveau et de la colle le bloc d'agarose sur la scène éprouvettede l'vibratome. Lorsque le collage des blocs, assurez-vous que la face ventrale du cerveau est parallèle à la plate-forme, puisque le cerveau doit être coupé dans un plan de coupe horizontale.

3. Sectionnement Vibratome

1. Utilisez une lame de rasoir pour la coupe. Pour obtenir des tranches intactes, il est très important de maintenir la température à 4 ° C pendant la coupe.
2. L'article 300 um d'épaisseur des tranches horizontales à une fréquence de 50 Hz, amplitude de lame de 1,1 mm et une vitesse de 25 mm / sec.
3. Utilisez le pinceau fin pour pousser la tranche dans une cuillère perforée mini pour recueillir les tranches de cerveau et de les transférer dans un plat avec le tampon glacée stériles 1X Krebs. Choisissez la tranche qui contient le tissu du mésencéphale ventral (voir Figure 1). Dans un cerveau de souris E12.5 il ya juste une tranche de 300 um horizontale qui contient des tissus du mésencéphale ventral, y compris les neurones dopaminergiques.

4. Trancher la culture

Étapes 4.2 à 4.5 doit être effectuée dans des conditions stériles.

1. Transférer les tranches de cerveau sur un insert de cellules Millicell la membrane de la culture dans une plaque de six puits avec 1x tampon Krebs (voir point 1.2.5). Pour transférer la tranche utiliser la cuillère mini perforé (Fine Science Tools) et un pinceau fin. Jusqu'à 3 tranches peut être placé sur une membrane.
2. Transférer la membrane avec la tranche de la plaque de six puits de milieu de culture (voir point 1.2.5). Le sommet de la membrane ne doit pas être couvert par médium. La tranche de cerveau reçoit moyennes de l'air par le bas et en haut.
3. Placer la plaque de six puits dans un incubateur avec 5% de CO ₂ à 37 ° C. Il est très important que les tranches sont placées dans l'incubateur dans les 2 heures après l'étape initiale de la dissection. Un temps de préparation plus étendue peut entraîner une faible survie des tranches.
4. Tranches peuvent être maintenues in vitro jusqu'à 3 jours. Changement de 50% du milieu de culture sur le 2 ^ème jour.

1. Laissez les tranches de récupérer dans l'incubateur pendant 4-5 heures avant de commencer imagerie time-lapse.
2. Pour imagerie time-lapse, garder les tranches sur l'insert membrane et le transfert de l'insérer dans un 35 mm ibidi μ-vaisselle (le fond du plat se compose du matériel avec une qualité optique de haut).
3. Ajouter 1 mL de milieu de culture, plus 1,5 uL d'acide ascorbique (200 mM) pour le plat. L'acide ascorbique protège les tranches contre la phototoxicité.
4. Incuber tranches dans un caisson climatique à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant imagerie time-lapse.

6. Les résultats représentatifs

La figure 1 illustre la préparation de cultures organotypique de E12.5 cerveau de souris. La figure 2 montre les tranches organotypiques horizontale (aiguë et après plusieurs jours de culture) a obtenu le cerveau de souris sous forme E12.5. A titre de comparaison, des sections de cerveau congelé à des étapes équivalentes de développementsont affichés. Neurones dopaminergiques du mésencéphale sont visualisées par immunohistochimie de la tyrosine hydroxylase (TH). Mésencéphale projet dopaminergiques neurones cibles dans le cerveau antérieur. Ces projections commencent à se former à E12.5 et s'étendent vers le prosencéphale pendant les jours suivants. Nous considérons que le développement des projections du cerveau antérieur comme une bonne indication pour le développement normal des neurones dopaminergiques dans la culture. Dans le mésencéphale horizontale tranches neurones dopaminergiques d'étendre les projections vers leur zone de prosencéphale cible appropriée. Après 3 DIV (jours in vitro) ou lorsque les zones cibles du cerveau antérieur sont endommagés, des projections aberrantes s'étendent vers le mésencéphale dorsal. Exemples de coupes coronales du mésencéphale E12.5 sont présentés dans la figure 3. Les neurones dopaminergiques visualisées avec immunomarquage pour TH prolonger les projections aberrantes à l'mésencéphale dorsal. La figure 4 montre une analyse de la prolifération, les cellules nécrotiques et apoptotiques dans les cultures organotypique. BrdU immunostaining de visualiser les cellules en prolifération démontre que les cellules prolifèrent dans des conditions de culture après une DIV. La prolifération est réduite après 4 DIV. Après 3 DIV, de nombreuses cellules dans le mésencéphale ventral subissent une nécrose (coloration iodure de propidium) et apoptose (immunomarquage de la caspase-3 clivée). La figure 5 montre les chemins de migration des neurones marqués YFP surveillée dans une expérience d'imagerie time-lapse dans une tranche aiguë .

Figure 1. Schéma illustrant la préparation de cultures organotypique. 300 um tranches de cerveau horizontale sont préparés par sectionnement d'un cerveau en utilisant un vibratome E12.5. (A) vue sagittale schématique d'un cerveau de souris E12.5. Niveaux des sections sont indiquées. La zone contenant les neurones dopaminergiques est représenté en rose, les projections sont indiquées en bleu. (B) Schémas des trois tranches qui peuvent être obtenus à partir de dorsal à ventral et that contenir à la fois du cerveau antérieur (Fb) et le mésencéphale (Mo). Notez que seule une tranche contient les neurones dopaminergiques (b tranche). La tranche appropriée peuvent être identifiés en fonction de la position des ventricules et la continuité du tissu mésencéphale et du cerveau antérieur (flèches, comparer la section B de l'article a et c). La zone contenant les neurones dopaminergiques est indiqué en rose, la zone contenant des précurseurs dopaminergiques est représenté en vert, les flèches bleues indiquent les projections de développement. (C) La tranche contenant les neurones dopaminergiques est cultivé sur des inserts membrane. Abréviations: VMB, mésencéphale ventral; DMB, du mésencéphale dorsal; Hyp, l'hypothalamus; Hb, rhombencéphale.

Figure 2. Projections des neurones dopaminergiques du mésencéphale dans les cultures organotypique sont dépendants de l'intégrité du cerveau antérieur. L'immunohistochimie de la tyrosine hydroxylase (TH) pour étiqueter les neurones dopaminergiques. (A) tranche aiguë (0 DIV)indiquant l'emplacement normal des neurones dopaminergiques dans le mésencéphale ventral. La flèche blanche indique la zone qui est montré dans un plus fort grossissement dans l'encart. Projections à l'prosencéphale n'ont pas encore développé. Après une DIV, les projections à l'prosencéphale commencent à se former. Projections s'étendre dans le cerveau antérieur à 2-3 DIV. Flèches blanches indiquent l'emplacement des corps cellulaires indiqué dans un plus fort grossissement dans les encarts (cadre blanc). Les flèches jaunes soulignent les projections normales en tranches intactes indiqué dans un plus fort grossissement dans les encarts (cadre jaune). Aberrant projections se développer en tranches avec du prosencéphale endommagé. Les flèches rouges indiquent les projections aberrantes de la dorsale du mésencéphale indiqué dans un plus fort grossissement dans les encarts (cadre rouge). Les dommages sont indiquées par des astérisques rouges. Après 3 DIV, la plupart des tranches (n = 5 / 7) avaient des projections aberrantes vers le mésencéphale dorsal. (B) immunomarquage TH sur l'horizontale des sections de cerveau congelé à différents stades de développement de montrer le développementdes projections dopaminergiques in vivo. Flèches blanches indiquent l'emplacement des corps cellulaires indiqué dans un plus fort grossissement dans les encarts (cadre blanc). Les flèches jaunes soulignent la position de la projections du plus fort grossissement dans les encarts (cadre jaune). Le niveau des sections gelées a été choisi pour se rapprocher du niveau de la tranche de cultures organotypiques. Notez qu'un sections congelées (12 um) ne représente pas toute la tranche organotypique (300 um). Par conséquent, les projections montré à E13.5 E14.5 et ont été observés sur les articles 120 um plus ventral que la section contenant les corps cellulaires (astérisques jaune).

Figure 3. Mésencéphale cultures tranche coronale colorées pour la tyrosine hydroxylase (TH) comme un marqueur des neurones dopaminergiques. (AC) Tranches après DIV 1, 2 ou 3. Les neurones dopaminergiques développent des projections vers le mésencéphale aberrante dorsale (rflèches éd.) Pointes de flèches montrent l'emplacement des corps cellulaires dopaminergiques.

Figure 4. Prolifération cellulaire et la viabilité des cellules en culture organotypique mésencéphale. (A) Les cellules en prolifération ont été marqués par l'ajout de BrdU (50 ng / mL, Sigma) au milieu de culture pendant 18 h. Les tranches ont été par la suite immunocolorées pour BrdU. Après une DIV, les cellules BrdU marqués sont situés dans les zones ventriculaires (flèches rouges). Après 4 DIV, les cellules proliférantes sont plus dispersés et une zone ventriculaire distinctes n'est plus maintenu. (B) Les cellules nécrotiques ont été marqués par addition d'iodure de propidium (1μg/μL, Sigma) au milieu de culture pendant 2 heures et visualisé par microscopie à fluorescence. Après une DIV, le mésencéphale ventral (vmb) n'est pas nécrosée, mais de nombreuses cellules d'iodure de propidium marqué peut être vu dans le mésencéphale dorsal et du cerveau antérieur. Après 3 DIV de la viabilité cellulaire diminue dans le midbra ventralepo Barre d'échelle: 500 um (C) Immunostaing pour la caspase-3 clivée de visualiser les cellules apoptotiques. A 1 ou 2 DIV, seuls quelques neurones dopaminergiques (TH) sont apoptotiques. Après 3 DIV, les neurones dopaminergiques de commencer à entrer en apoptose. Panneaux au milieu et à droite sont forts grossissements de la zone encadrée dans les panneaux de gauche. Les images sont forts grossissements projections d'intensité maximale de z-stacks de 14-16 frames. Les images ont été prises toutes les 0,5 um avec un Zeiss Apotome set-up.

Figure 5. Route migratoire des YFP neurones marqués dans une tranche aiguë. (A) Tranche horizontale utilisé pour l'imagerie laps de temps de YFP neurones marqués. La tranche a été incubé pendant 5 heures avant l'imagerie. Les cellules ont été marquées en utilisant une inductible Cre / loxP système ^6. Shh souris ^{CREER 8} et souris ROSA journaliste ^{loxP-STOP-loxP-EYFP 9,} nousre utilisé. La recombinaison de l'allèle journaliste ROSA (et d'expression EYFP) est induite dans les cellules qui expriment CREER (Shh cellules exprimant), mais seulement sur l'administration de tamoxifène (Sigma). Dans cet exemple, le tamoxifène (3 mg/40 g de poids corporel) a été administré à des souris gravides à E8.5. Ce dispositif expérimental est principalement attribuable à l'étiquetage des précurseurs des neurones dopaminergiques et leurs descendants dans le mésencéphale ventral ^10,11. Barre d'échelle: 500 um. (B) traçage de la route migratoire de la YFP neurones marqués dans une tranche aiguë. Time-lapse images de YFP neurones marqués destin tracé ont été acquises toutes les 30 min pour un temps total de 5 h 30 min sur un Zeiss Axio Observer-microscope (objectif CE PlnN 10x / 0,3). Les tranches ont été incubées dans une chambre environnementale (incubateur XLS1 Pecon) à 37 ° C et fourni avec 5% de CO _{2 au} cours de l'imagerie. La position initiale des cellules est marqué par des flèches rouges, les positions de migration sont marqués d'un astérisque rouge.