Visualisering af Caenorhabditis elegans Cuticle strukturer ved hjælp af de lipofile Vital Dye, DII

1. Udarbejdelse af Dii pletten

1. Forbered en stamopløsning på 20 mg / ml DII (Biotium, Inc., Hayward, CA) i DMF. DII er lysfølsomt, så beskytte DII mod lys ved indpakning i folie.
2. Opret en arbejdsgruppe fortynding af Dii ved at tilsætte 0,6 μL DII materiel til 399,4 μL M9 for hver population. Dette skulle give en endelig arbejder fortynding af 30 mikrogram / ml Dii i M9. Dette kan skaleres op til farvning flere befolkningsgrupper samtidigt. Shield DII mod lys af indpakning røret (r) i folie.

2. Udarbejdelse af nematoder

1. Brug en 60 mm plade med en befolkning på uforurenet nematoder. Vask dyr fra pladen ved hjælp af en opløsning af 0,5% Triton X-100 i M9 buffer ved forsigtigt hvirvlende væske i en cirkulær bevægelse hen over overfladen af ​​pladen til at løsne alle larver og voksne dyr. Overfør skylles ud i et sterilt 1,5 ml rør.
2. Umiddelbart spin ned dyrene ved 2000 rpm i 30 sek. Fjern og kassér så meget supernatant som muligt uden at forstyrre massen af ​​dyr på bunden af ​​røret.
3. For at reducere residual Triton X-100, skylles dyr ved hjælp af M9 buffer, spin, og fjern supernatant. Gentag dette trin én gang.
4. Tilsæt 400 μL af arbejdstid DII løsning M9 til røret og vortex kort resuspendere dyr i løsningen.
5. Ryst rør ved 20 ° C vandret i 3 timer ved 350 omdrejninger i minuttet i en lys-beskyttet miljø. Hvis det ønskes, kan dyr inkuberes op til 16 timer efter farvning.
6. For at reducere mængden af ​​ubundet farvestof, spin ned dyrene ved 2000 rpm i 20 sek. Fjern og kassér så meget supernatanten som muligt uden at forstyrre massen af ​​dyr.
7. Resuspender dyr i 400 μL M9 buffer og hælde væske på en bakterie-fri del af en NGM agarplade tilsået med OP50 E. coli. Give dyrene mulighed for at genvinde mindst 30 minutter. Under inddrivelse tid dyrene skal kravle væk fra DII farvning flydende og på maden. Dette trinreducerer baggrundsfluorescens fra gratis DII.

3. Montering og observere prøver

1. Smelt 4% agar i vand ved hjælp af en autoklave eller en mikrobølgeovn.
2. Opret genbruges afstandsstykker, som kan bruges til at sikre en ensartet tykkelse agar pad, ved layering to stykker af lab tape på et objektglas. Lav to spacer dias alt.
3. Arranger et rent objektglas mellem to spacer dias. Pipette omkring 150 μL (fire dråber) af smeltet 4% agar på midten af ​​den rene objektglas. Hurtigt dække den smeltede agar ved hjælp af et ekstra skub til at danne en agar pad. Fjern forsigtigt låget glide, holde puden centreret på toppen af ​​den stigende dias.
4. Pipette ca 5 mikroliter af nematoder bedøvelse (100 mM - 1 mm levamisol, for eksempel) på puden.
5. Mount 8 til 12 dyr i narkose og dæk med et mikroskop dækglas.
6. Observere dyrene ved hjælp af en forbindelse eller konfokal mikroskop udstyret med mindst 40x formål, be ve og en DSRed / TRITC (eller andre kompatible) filter. Den fluorescens excitation maksimalt DII er 549 nm og dets emission maksimale er 565 nm for bundet farvestof (Biotium, Inc., Hayward, CA).

4. Repræsentative resultater

Dii pletter neglebånd af vildtype og mutant C. elegans. Den cuticular Overfladen indeholder annuli adskilt af omkredsen furer og i nogle faser, langsgående kamme kaldet alae. Hver udviklingsstadiet har cuticular strukturer med forskellige kompositioner ^2. Højderygge eller furer af både alae og annuli fluorescens-pletter, afhængigt af overfladen sammensætning, hele larver og voksne stadier og forbliver synligt op til en dag efter helbredelse ved hjælp af denne metode. Baggrund fluorescerende pletter er undertiden observeret (figur 2F, G), men ikke rutinemæssigt (figur 1, figur 2A-E, H, I). Alle billeder blev taget med spinning disk konfokal eller, når det bemærkes, widefield (WF) sammensatte mikroskopi.

Figur 2. Dii fluorescens-pletter C. elegans neglebånd i alle faser af post-embryonale udvikling. 630x forstørrelse. Skala bar = 10 ìm. Farvning af vildtype dyr i A) L1, B) L2; C) Dauer, D) L3, E) L4, og F) voksne stadier. Den alae og ringformede kamme er fluorescens farves i L1 og Dauer dyr (A, C). Dii pletter ringformede ridges i L2 dyr(B). Annular furer plet i L3 og L4 dyr (D, E). De furer af alae og annuli farves hos voksne dyr (FH). Alae er sammensat af to, fem eller tre riller (i L1, Dauer, eller voksne dyr, henholdsvis), der kører længden af dyret (pile) ^16. Annuli skabe omkredsen kamme omkring dyret (pilespidser, F og J). Neglebånd af voksne mutant dyr vise moderat cuticular organisation defekter (GH). G) højderygge af alae er diskontinuerlig (WF). H) Overtallige alae kamme er smeltet og forgrenede eller tvedelt (WF). Kollagen genet mutanter udviser alae og ringformede organisation defekter (IJ). I) i transgene dyr overekspression pRF4 (rol-6 (su1006)), højderygge af alae ligger i en vinkel til længden af dyret. J) Annuli i transgene dyr overekspression pRF4 (rol-6 (su1006)) vise et uregelmæssigt mønster.

Figur 3. ExternAl morfologiske strukturer er oplyst af Dii farvning. 630x forstørrelse. Skala barer = 10 ìm. Dii fremhæver også andre udvendige funktioner, herunder A) voksne hermafrodit vulva, B) voksne mandlige hale stråler og blæser, og C) hermafrodit hale spike (kløvet i denne mutant baggrunden).

Figur 4. Cuticle tager længere tid at pletten med DII end miljømæssigt udsatte neuroner. 630x forstørrelse. Skala bar = 10 ìm. Efter to timers farvning, er amphid (ikke vist), og phasmid sensoriske neuroner (pile) i tilstrækkelig grad plettet. I modsætning hertil er hårstrået af yngre dyr kun delvist farves i lapper (pilespids).

Tabel 1. Cuticular farvning under forskellige betingelser. Forskellige inkubation løsninger og tidspunkter blev testet til at optimere cuticular farvning hos dyr. H ₂ 0, sterilt destilleret vand. Delvis farvning indikerer pletvist farvning af larver neglebånd (Figur 4), selvom voksne neglebånd pletter consistently.

Den DII farvningsmetode præsenteres her giver mulighed for forholdsvis hurtig og bekvem måde at visualisere neglebånd i C. elegans. Ved nyorientering og optimere en metode, der almindeligvis anvendes til billede miljømæssigt udsatte sensoriske neuroner ^15,17, kan DII bruges til fluorescens plet både alae og ringformede strukturer (figur 1 og 2), samt vulva, mandlige hale, og Hermafrodit hale spike (Figur 3). Vi har konstateret, at inkubationstid løsning og tid indflydelse på evne til DII konsekvent at farve i hårstrået (Tabel 1, Figur 4). Metoden til DII farvning miljømæssigt udsatte neuroner anvender en to-timers inkubationstid i M9 med Triton X-100 ^15. En indledende vask af M9 med det overfladeaktive Triton X-100 hjælper med at fjerne forurening fra cuticular overfladen og forhindrer, at dyr fra klumpe. Men inkubere dyrene tre timer i en farvning løsning i samme buffer forhindrer farvestof fra farvning neglebånd (Tabel 1).Dette kan være forårsaget af lipider på den nematode overflade, der krængede af længere behandling i rengøringsmiddel. Inkubation af dyr i vand med DII pletter neglebånd, angiver, at M9 saltopløsning ikke er nødvendig for DII farvning af neglebånd. Selv om en vand-baseret protokol anbefales til neuronal DII farvning ^15, finder vi, at dyr behandles på denne måde optræder ofte usunde. Vask dyr kort i 0,5% Triton X-100 i M9, efterfulgt af en tre-timers inkubation i farvning løsning lavet med M9, giver konsekvent farvning af cuticular strukturer og vedligeholder trivsel af dyrene.

Dyr kan blive reddet efter observation og vedligeholdes, således at direkte downstream analyser. Denne metode er et praktisk værktøj, der kan bruges i mange undersøgelser, herunder men ikke begrænset til, cuticular sekretion og organisation, epidermal celle udvikling, heterochronic gen veje, og nematode evolution.