Visualisering av Caenorhabditis elegans Cuticle Structures Bruke Lipofile Vital Dye, DII

1. Utarbeidelse av DII flekken

1. Forbered en stamløsning på 20 mg / ml DII (Biotium, Inc., Hayward, CA) i DMF. DII er lys sensitive, så beskytt DII fra lys ved å pakke inn i folie.
2. Lag en arbeidsgruppe utvanning av DII ved å tilsette 0,6 mL DII lager til 399,4 mL M9 for hver populasjon. Dette bør gi en endelig jobbe fortynning på 30 mikrogram / ml DII i M9. Dette kan skaleres opp til farging flere populasjoner samtidig. Shield DII fra lys ved å pakke røret (e) i folie.

2. Utarbeidelse av nematoder

1. Bruk en 60 mm plate som inneholder en befolkning på forurenset nematoder. Vask dyr fra platen ved hjelp av en løsning av 0,5% Triton X-100 i M9 buffer ved forsiktig virvlende væske i sirkelbevegelser over overflaten av platen for å løsne alle larver og voksne dyr. Overfør vask i en steril 1,5 ml tube.
2. Umiddelbart spin ned dyrene ved 2000 rpm i 30 sek. Fjern og kast så mye støtteernatant som mulig uten å forstyrre den massen av dyr på bunnen av røret.
3. For å redusere residual Triton X-100, skyll dyr bruker M9 buffer, spinn, og fjern supernatanten. Gjenta dette trinnet en gang.
4. Legg til 400 mL arbeide DII løsning i M9 til røret og vortex kort til resuspender dyr i løsningen.
5. Rist tube ved 20 ° C horisontalt for 3 timer ved 350 rpm i en lys-beskyttet miljø. Hvis ønskelig, kan dyr være inkubert opptil 16 timer for farging.
6. For å redusere mengden av ubundet fargestoff, spinne ned dyrene ved 2000 rpm i 20 sek. Fjern og kast så mye supernatant som mulig uten å forstyrre massen av dyr.
7. Resuspender dyr i 400 mL M9 buffer og hell væsken på en bakterie-fri del av en NGM agar plate seeded med OP50 E. coli. La dyr å utvinne minst 30 minutter. Under restitusjonstid dyrene skal krype unna DII flekker væske og på maten. Dette trinnetreduserer bakgrunnsfluorescens fra gratis DII.

3. Montering og observere prøver

1. Smelt 4% agar i vann ved hjelp av en autoklav eller en mikrobølgeovn.
2. Lage gjenbrukbare avstandsstykker, som kan brukes til å sikre ensartet tykkelse på agar pad, med lagdeling to stykker av lab tape på et glass slide. Lag to spacer lysbilder totalt.
3. Arranger et rent glass-slide mellom to spacer lysbilder. Pipetter ca 150 mL (fire dråper) av smeltet 4% agar på midten av rent glass slide. Raskt dekke smeltet agar med et ekstra skyv for å danne en agar pad. Fjern forsiktig dekselet lysbilde, holder puten sentrert på toppen av montering lysbildet.
4. Pipetter ca 5 mL av nematode bedøvelse (100 mM - 1 mM levamisole, for eksempel) på pad.
5. Mount 8-12 dyr i narkose og dekk med et mikroskop dekkglass.
6. Observer dyrene ved hjelp av en sammensatt eller confocal mikroskop utstyrt med minst en 40x objecti ve og en DSRed / TRITC (eller andre kompatible) filter. Fluorescens eksitasjon maksimalt DII er 549 nm og dens utslipp maksimum er 565 nm for bundet fargestoff (Biotium, Inc., Hayward, CA).

Fire. Representant Resultater

DII flekker cuticle av villtype og mutant C. elegans. Den cuticular Overflaten inneholder annuli atskilt av omkrets furer, og i noen stadier, kalt langsgående rygger alae. Hver utviklingsstadiet har cuticular strukturer med tydelige komposisjoner ^2. Rygger eller furer av både alae og annuli fluorescensmerket beis, avhengig av overflaten sammensetning, gjennom larve og voksen stadier og være synlig opp til en dag etter at gjenoppretting ved hjelp av denne metoden. Bakgrunn fluorescerende flekker er ofte observert (Tall 2F, G), men ikke rutinemessig (Figur 1, Figur 2A-E, H, I). Alle bildene ble tatt med spinning disk confocal eller når bemerket, widefield (WF) compound mikroskopi.

Figur 2. DII fluorescensmerket flekker C. elegans cuticle på alle stadier av post-embryonale utvikling. 630x forstørrelse. Scale bar = 10 mikrometer. Farging av vill-type dyr i A) L1; B) L2; C) dauer; D) L3; E) L4, og F) voksne stadier. Den alae og ringformede rygger er fluorescensmerket beiset i L1 og dauer dyr (A, C). DII flekker ringformet høydedrag i L2 dyr(B). Ringformet furer flekken i L3 og L4 dyr (D, E). Den furer av alae og annuli er beiset i voksne dyr (FH). Alae er sammensatt av to, fem eller tre rygger (i L1, dauer eller voksne dyr, henholdsvis) som kjører lengden på dyret (piler) ^16. Annuli skape omkrets rygger rundt dyret (pilspisser, F og J). Cuticle av voksne muterte dyr vise moderate cuticular organisasjon defekter (GH). G) Ridges av alae er usammenhengende (WF). H) overtallige alae rygger er smeltet og forgrenet og splittnagler (WF). Kollagen genet mutanter utstilling alae og ringformet organisasjon defekter (IJ). I) I transgene dyr overekspresjon pRF4 (rol-6 (su1006)), rygger av alae ligge på skrå til lengden på dyret. J) Annuli i transgene dyr overekspresjon pRF4 (rol-6 (su1006)) vise et uregelmessig mønster.

Figur 3. Eksternal morfologiske strukturer er opplyst av DII farging. 630x forstørrelse. Scale barer = 10 mikrometer. DII fremhever også andre ytre funksjoner, inkludert A) voksen hermafroditt vulva, B) voksne mannlige tail stråler og fan, og C) hermafroditt hale spike (delte seg i denne mutant bakgrunnen).

Figur 4. Cuticle tar lengre tid å farge med DII enn miljømessig utsatt nerveceller. 630x forstørrelse. Scale bar = 10 mikrometer. Etter to timer med flekker, er amphid (ikke avbildet) og phasmid sensoriske nevroner (piler) nok flekkete. I motsetning er cuticle av yngre dyr kun delvis beiset i patcher (pilspiss).

Tabell 1. Cuticular flekker under ulike forhold. Forskjellige inkubasjonstid løsninger og tider ble testet for å optimalisere cuticular flekker hos dyr. H ₂ 0, sterilt destillert vann. Delvis flekker indikerer flekkvis farging av larve cuticle (figur 4), men voksen cuticle flekker consistently.

Den DII flekker Metoden som presenteres her gir en relativt rask og praktisk måte å visualisere skjellaget i C. elegans. Ved repurposing og optimalisering av en metode som ofte brukes til å image miljømessig utsatt sensoriske nevroner ^15,17, kan DII brukes til fluorescensmerket flekker både alae og ringformede strukturer (Figur 1 og 2), samt vulva, male hale, og hermafroditt hale spike (figur 3). Vi har funnet ut at inkubasjonstiden løsningen og tid påvirke evnen til DII å konsekvent stain cuticle (tabell 1, figur 4). Metoden for DII beising miljømessig utsatt nevroner bruker en to-timers inkubasjonstid i M9 med Triton X-100 ^15. En innledende vask av M9 med surfactant Triton X-100 bidrar til å fjerne forurensning fra cuticular overflaten og hindrer dyrene fra clumping. Men incubating dyrene tre timer i en flekker løsning i samme buffer hindrer fargestoff fra flekker cuticle (Tabell 1).Dette kan være forårsaket av lipider på nematode overflaten blir strippet av ved lengre behandling i syntetisk vaskemiddel. Inkubasjon av dyr i vann med DII flekker skjellaget, indikerer at M9 salt løsning ikke er nødvendig for DII farging av cuticle. Selv om en vann-basert protokoll anbefales for neuronal DII beising ^15, finner vi at dyr behandlet på denne måten ofte vises usunn. Vaske dyr kort i 0,5% Triton X-100 i M9, etterfulgt av en tre-timers inkubering i farging løsning laget med M9, gir konsekvent farging av cuticular strukturer og opprettholder trivsel for dyrene.

Dyr kan være reddet etter observasjon og vedlikeholdt, tillater direkte nedstrøms analyser. Denne metoden er et praktisk verktøy som kan brukes i mange studier, inkludert men ikke begrenset til, cuticular sekresjon og organisasjon, epidermal celle utvikling, heterochronic genet pathways, og nematode evolusjon.