Brug af Affordable LED-arrays for Foto-Stimulation af neuroner

1. Optisk Kalibrering: Måling LED Power

1. Vedhæft en LED-array til en heatsink aktivt afkølet af en ventilator og anbringer denne LED / heatsink aparatus til en Kollimatorlinse.
2. Udskift lygte i brightfield belysning med LED / heatsink / fan / objektiv apparater. Dette apparat skal være omhyggeligt placeret således, at kollimeret LED stråle bevæger sig langs en lige optisk vej til kondensatoren linsen. Sørg for, at heatsink / blæser er korrekt jordet, at systemets fælles grundlag.
3. Kør LED-array med en strømforsyning, der kan give hurtige og firkantede pulser af strøm. Denne strømforsyning kan styres af en 5V TTL puls stammer fra en puls generator.
4. Centrer kollimeret stråle langs straalegangen defineret mellem feltet mellemgulvet og kondensator linse. Ideelt set vil LED stråle lidt overfylde den helt åbne feltet membran. Typisk vil et mere stramt kollimeret LED stråle udfylde dette blænde mindre, og vil producere more magt på bekostning af ensartethed. I vores setup har vi øget lys ensartethed ved at vælge en Kollimatorlinse der forventes en lidt udvidet billede af LED-array på sit konjugat fly på consenser mellemgulvet.
5. Opnå Kohler belysning ved at fokusere kondensatoren, så billedet af feltet membranen (mellemgulvet tættest på lyskilden) er fokuseret på den skive kammer (fig. 1). Et tyndt væv linse papir kan fungere som en projektionsskærm for at visualisere den fokuserede billede af feltet mellemgulvet på andre dybder.
6. Bor en række pinholes af kendte diameter i et uigennemsigtigt materiale. Placer en af ​​disse små pinholes over sensoren af ​​et optisk power-meter. Sæt strøm måler på prøven scenen og centrere magten meter over fokuseret billede af feltet membranen ved blot at flytte magt meter, indtil det giver en maksimal læsning. Fastgør wattmeteret i denne position.
7. Helt åben alle åbninger (aperature membran ogfelt membran). Systematisk flytte vedlagte skive kammer / power meter i forhold til den optiske lightpath og beregn ensartethed af optiske magt inden for det belyste område. Byg ensartethed plottet til dit system. Hvis mikroskopet er korrekt opsætning med Kohler belysning centreret på målet fokus bør maksimal effekt være direkte under mål, og regioner uden for dette fokus vil nu modtage en kendt mængde af belastning i henhold til ensartethed plot.
8. For hver størrelse af pinhole, bygge en standardkurve af optiske magt vs hul areal. Ved at justere input strømmen til LED-array, producere denne kurve på flere effektniveauer, og fra hver kurve beregne effekt pr mm2. Hvis LED-array skal bruges til lapning optik, så sørg for at indføre optiske elementer, der er nødvendige for at lappe (kondensatorer, pinholes og filtre) at vide, hvor meget der sendes lys under lappe belysning.
9. Spejlvende wattmeteret tilansigt målet, beregne intensiteten af ​​belysning på 470nm, når kviksølvet lampen er tændt.
10. Tilføj en live-skive til kammeret, og genopbygge standard kurver at bestemme lyset strøm sendes gennem spredning hjernevæv.

2. Udskæring Procedure og Elektrofysiologi

Del A: Slice Forberedelse

1. Bedøver (60 mg / kg Ketamin og 2mg/kg Xylazin) og halshugge musen. Dissekere hjernen i kunstigt cerebral spinalvæske (ACSF, i mm: 124 NaCl, 3 KCl, 1,3 MgSO _4, 26 NaHCO _3, 1,25 NaHPO _4, 20 glukose, 2 CaCl _2, ~ 310mOsm, pH 7,4, når boblede med en blanding af 95% O2 og 5% CO ₂ ^5,1), pas på ikke at beskadige olfaktoriske pærer. Adskil de to hjernehalvdele og sted på agar med den ventrale overflade selv med den ene kant (til vandret sektioner).
2. Lim agar og dorsale overflade af hver cortical halvkugle til vibratome Chuck, og langsomt fylde badekarret med iskolde ACSF. Slice fra ventrale overflade i 300 μm sektioner, overførsel af hver sektion til opvarmet (34-36 ° C) og iltet ACSF, mulighed for at restituere i 30-45 minutter.

Del B: Løse Patch Måling af tærskelværdien Spike

3. Efter bringe skiver til stuetemperatur i 30 minutter, placere forsigtigt en skive i optagelsen kammer af mikroskopet kammeret under konstant perfusion af iltet ACSF.
   Ved risiko for overdrevent stimulerende ChR2 inficerede neuroner, kan tilstedeværelsen af ​​EYFP-ChR2 blive bekræftet i epifluorescence (fig. 2a)
4. Træk glas-elektroder på en pipette aftrækker (Sutter P-97). Fyld denne elektrode med ACSF. Når den placeres i ACSF badet spidsen modstand bør være mellem 7-10 MOhms.
5. Under fluorescerende belysning, skal du finde i den skive en sund ChR2-EYFP neuron med modne morfologi. Også finde denne neuron er Soma under patching optik.
6. Med lys positivt tryk passeret gennem elektrode spidsen, lavere plasteret elektroden mod de identificerede fluorescerende neuron. Når membranen kontakt, hurtigt frigivelse positivt tryk og anvende en lille og kort mængde af suge gennem spidsen. En giga-ohm tætning bør foretages mellem plasma membranen og væggene af plasteret elektrode.
7. Selv hvis en giga-Seal er ikke dannet, hvis elektroden er tilstrækkeligt tæt på en fluorescerende neuron spiking aktivitet skal producere en målelig lokal Feltspænding. Aktiver ChR2 i denne neuron ved at blinke forskellige doser af lys. Fordi lys-dosis er en funktion af både lysdiode og varighed, beregne, hvor meget lys er nødvendigt for at fremmane en handling potentiale på flere beføjelser og varigheder (fig. 2b). Også observere hvor meget spiking sker under kviksølvlampe belysning.

3. Repræsentative resultater:

På vores mikroskop (Olympus BX51WI), vores LED er mign linje med 2 åbninger og en kondensator linse, og derved bevare den oprindelige lightpath af den fabriksinstallerede arc lampe. Ved at lukke både feltet mellemgulvet og aperature mellemgulvet, kan vi opnå brightfield kontrast tilstrækkelig til patch clamp optagelser (fig. 1b). Med alle membraner helt åben, vi udsætter den skive til maksimalt lys strøm til channelrhodopsin aktivering (fig. 1a). På vores mikroskop, producerer denne patching konfiguration lys-tæthed, der er cirka tre størrelsesordener lavere end den maksimale fulde feltet tæthed (4,1 μW / mm ² versus 6,88 mW / mm ^2).

Vi ser robust mærkning af voksen-fødte lugtekolben granula og periglomerular neuroner uger efter lentiviral smitte ved at migrere neuroblasts i rostralt vandrende strøm (fig. 2a) En løs-patch optagelse fra en enkelt voksen-født ChR2-EYFP udtrykke granula celle indikerer, at en 5 ms stimulation ved Maximum effekt (6,88 mW / mm ²⁾ er tilstrækkelig til at fremkalde spiking (fig. 2b). Siden udtryk niveau varierer mellem cellerne, vil mængden af ​​lys, der passerer grænsen til spike variere og bør beskrives statistisk for hver celle type af interesse.

Figur 1. LED-array setup for fuld-field photostimulation og patch-clamp skive elektrofysiologi. For at aktivere channelrhodopsin (ChR2) Vi forventer et kollimeret stråle gennem åben ryg åbninger og kondensator optik (a). Denne konfiguration kan ændres til høj-kontrast patching optik ved fuldt ud at lukke feltet mellemgulvet og modulere bredden af ​​feltet membranen (b). Forkortelser: a. fan, b. varmeafleder, c. LED-array, d. Kollimatorlinse, e. spejl, f. felt mellemgulvet, g. blænde, h. kondensator linse, i. SAmple fase, J. mål.

Figur 2. Billede af en 300μm horisontal skive lugtekolben for patch clamp og hel-field photostimulation (a). Lentivirally smittede voksne-fødte granula celler, der udtrykker ChR2-EYFP kan ses udstrålende fra kernen af ​​det olfaktoriske pære. Lyset-dosis, der kræves for at fremkalde spiking kan findes ved at øge varigheden af ​​LED-blitz (b). Tærsklen for dette granul celle var 5 ms ved fuld LED intensitet (2.43mW/mm ^2). Scale i (a) = 500μm, skala i (b) = 50ms.

De seneste år er der sket en eksplosion i popularitet optogenetic værktøjer til neurovidenskab forskning ^6. Som et resultat, er det stadig vigtigere at sænke barrieren for indrejse til laboratorier, der ønsker at begynde at bruge disse nye værktøjer. Her beskriver vi, hvordan man laver en enkel og billig renovering og kalibrering af en konventionel patch-clamp riggen, så det kan gøre fuld-field optisk stimulering af channelrhodopsin-udtrykkende neuroner. I særdeleshed, anvender vi denne teknik til studiet af lugtekolben voksne neurogenese specifikke kontrol med nyfødte neuroner med lys.

Vi viser hvordan du kan afgøre, om en LED-lyskilde producerer nok strøm til ChR2 aktivering, og demonstrere hvordan uløseligt hurtig on / off hastighed lysdioder kan nemt regulere doseringen af ​​lys gives til neuroner. Mens vores lab med succes har brugt denne teknik, der findes alternative måder at udsætte neuroner til kontrollerede doser af lys hver wed sine egne fordele og ulemper.

Hvis flere optiske magt er nødvendig, vil mange kviksølv lamper producere betydeligt mere lys end en LED-array, og et mikroskop mål og filter sæt er allerede til stede for at fokusere på den ønskede bølgelængder på prøve. Men med denne løsning hverken magt eller varigheden af ​​eksponering kan let kontrolleres. Længde af eksponering vil være nødvendigt at være kontrolleret af en ekstern lukker, og disse er ofte dyrere end en LED-array, og kraften vil skulle dæmpes ved at tilføje neutralfiltre til lyset sti - med risiko for at forårsage vibrationer, som ville reducere Succesraten på patch-clamp eksperimenter.

Vores implementering gør det også vanskeligt at kontrollere den rumlige udstrækning af belysning. Hvis spot belysning man ønsker at målrette specifikke grupper af ChR2 udtrykke neuroner, den ene løsning er at scanne en laser plet med en galvometer scanning spejl til forskelligesteder på den skive. På dette tidspunkt, dog mikroskopet begynder at ligne en konventionel konfokal mikroskop både i kompleksitet og omkostninger. En nylig udviklet alternativ er at fokusere billedet af en mikro-LED-array på prøve ^7, eller til at forme en ensartet inden for excitation med en digital micromirror enhed ^8.

LED-arrays har forskellige fordele, der gør dem unikt egnet til channelrhodopsin stimulation. Deres on / off hastighed sker på nanosekund tidsplaner og så denne hastighed kan bruges til at finjustere varigheden af ​​lys eksponering for biologiske væv. Derudover kan farven på lysdioder blive valgt til at opfylde specifikke magnetisering bands uden behov for filtrering. Med fremkomsten af ​​rød-forskudt channelrhodopsin mutanter, ville det være enkelt at bruge to lysdioder i forskellige farver til individuelt at ophidse to forskellige populationer af neuroner. Alternativt, hvid LED-arrays - ligesom den, der anvendes i denne rapport, som kombinerer blå (450nm pEAK) og grøn (550nm peak) galliumnitrid dioder - er bredspektrede, som giver undersøgeren den frihed til at målrette en bred vifte af excitation bands.

Efter optisk kalibrering, skal hver celletype, der udtrykker channelrhodopsin være præget at afgøre, hvor meget lys er forpligtet til at fremmane en handling potentiale. Vi beskriver en simpel elektrofysiologisk karakterisering ved hjælp af løs-patch metode, som har den fordel at undgå at ændre cellens indre dynamik med pipette løsning. Men i en fuld undersøgelse helcelle-optagelser er nødvendige for at afgøre, hvor meget lys producerer en given mængde depolariseringen, og stabiliteten af ​​disse evoked potentials over tid. Desværre følsomhed tilsatte aktivitet for lys dosis er afhængig af en række parametre uden for eksperimentel kontrol. Disse omfatter niveauet for ChR2 udtryk (en funktion af konstruere kopiantal og udviklingsmæssige regulering af den virale promoter), og den iboende biofysiske egenskaber neuron ^9.

Den fluorescerende intensiteten af ​​den ChR2-EYFP fusion kan være en indikator for, hvor meget lys der er behov for at bringe neuron til tærskelværdien. Der er dog Instationære systemer i denne form for skøn forårsaget af internaliserede aggregater af kanal, og ved rangering conductances forårsaget ved at aktivere kanaler distalt for spike indledning zone. I sidste ende, for hver type neuron en statistisk karakterisering af befolkningen bliver nødt til at ske. Dette lider for det forbehold, at svagt fluorescerende celler er vanskelige at lappe, og så viral konstruktioner kan begunstiges med en supplerende fluorescerende mærke, der er somatisk begrænset ^10.

Det er helt klart overflødigt at lappe en ChR2 inficeret neuron, hvis lys kan bruges til at styre sine spiking aktivitet. En bedre udnyttelse af optogenetics in vitro er at undersøge den synaptiske tilslutning af en optogeneticallymålgruppen med andre medlemmer af kredsløbet. I vores hænder, har vi koblet fuld felt stimulering af ChR2 voksen-fødte granula celler med patch clamp optagelser fra mitral celler til at måle egenskaberne for den nydannede synapser mellem disse to celletyper ^4. Fordi sandsynligheden af ​​tilslutningsmuligheder mellem en enkelt granula og mitral celler er meget lavt, vores eksperiment var kun muligt ved samtidig aktivering af mange hundrede ChR2 udtrykker granula celler. Fremtidige opdagelsen af nye genetiske markører og nye virale levering metoder til at mærke specifikke neuronale populationer vil øge nytten af in-vitro optogenetics i forskellige systemer. Det er især denne teknik velegnet til at opdage sparsomme, men stærke forbindelser mellem uventede neuronal delmængder ^11,12. Da de mange forskellige anvendelser for denne teknik vokser, så vil behovet for enkel og prisbillig hardware til styring af lys leveret på in vitro-skiver.