In vitro uncoating van HIV-1 Kernen

1. De productie van HIV-1 deeltjes

Alvorens verder te gaan, moet u toestemming vragen en volg de richtlijnen van de bioveiligheid kantoor van uw instelling om te werken in een bioveiligheid faciliteit goedgekeurd voor infectieuze HIV. U moet ervoor zorgen dat de juiste zorg en veiligheidsmaatregelen worden gevolgd tijdens het werken in de bioveiligheid laboratorium.

De productie van HIV-1 deeltjes wordt meestal uitgevoerd door tijdelijke transfectie van 293T-cellen met HIV-1 DNA met behulp van een proviraal calciumfosfaat transfectie methode ^{7, 8.} Hoge titer virusvoorraden gegroeid door de cultuur van de besmette T-cellen zijn ook geschikt.

1. Cultuur 293T cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal bovine serum (FBS) en aangevuld met antibiotica [Penicilline (100 IU / ml) en streptomycine (100 ug / ml)] bij 37 ° C, 5% CO ₂ .
2. Los cellen van bijna samenvloeiende gerechten met 0,25% trypsine-EDTA en zaad 2x10 ⁶
3. Op de volgende dagen, moet de cel monolagen worden ongeveer 25% confluent en klaar voor transfectie. Voor de zes gerechten uit de cellen worden getransfecteerd, brengen 120 ug van proviraal DNA tot een volume van 2,7 ml met steriel water. Aan dit mengsel toe te voegen 0,3 ml van 2,5 M CaCl ₂ en 3 ml 2XBBS, en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen. Laat het mengsel op kamertemperatuur staan ​​gedurende 10-20 minuten.
4. Voeg 1 ml van het resulterende mengsel druppelsgewijs naar het midden van elk gerecht, terwijl voorzichtig te zwenken om te mengen. Plaats de borden 's nachts (~ 16 uur) in een incubator ingesteld op 35 ° C en 3% CO _2.
5. Zuig het kweekmedium en voorzichtig voeg 5 ml PBS.
6. Aspireren PBS en voeg 5 ml vers medium. Cultuur van de cellen in de broedstoof bij 37 &deg, C en 5% CO ₂ voor extra 24-48 uur.
7. Verzamel de kweeksupernatant met virale deeltjes, overzetten naar een 50 ml conische centrifugebuis. Combineer de supernatanten van alle gerechten en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 5 minuten te pellet cellen en puin. Filter het supernatant met behulp van 0,45 micrometer poriegrootte spuit filters. Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om aërosolvorming te minimaliseren tijdens het werken met het levende virus. Dit omvat het gebruik van conische buizen met O-ringen of rotor emmer dekt tijdens het centrifugeren stap. Indien dit niet mogelijk is, moet de schroef doppen van de buizen worden gewikkeld met parafilm.

2. Concentratie van HIV-1 virionen door ultracentrifugatie

1. Plaats de cultuur supernatant (30 ml) in een 38,5 ml polyallomer centrifugebuis (voor Beckman SW32Ti rotor of gelijkwaardig). Voorzichtig onderlaag van het virus bevat supernatant met 5 ml oplossing van 20% sucrose in PBS met behulp van een 5 ml pipet.
2. Centrifugeer gedurende 3 uur bij32.000 rpm bij 4 ° C (175.000 xg bij r _max) tot pellet virusdeeltjes.
3. Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie, zorg ervoor dat u de pellet te verstoren op de bodem van de buis. Voeg 0,5 ml van 1XSTE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) aan de buis en plaats bij 4 ° C gedurende 1 uur aan de pellet los te maken. Met behulp van een brede-boring 1 ml pipet tip voorzichtig pipet op en neer een paar keer om de pellet los te maken van de bodem van de buis. Vervolgens overdracht van de losgemaakte pellet over in een 1,5 ml microcentrifugebuis, zorg schuimvorming te voorkomen. Incubeer bij 4 ° C voor een ander 1-3 uur om de kleine groepjes van het virus te verspreiden. Tijdens deze periode, de voorbereiding van de sucrose gradiënt zoals beschreven in stap 3.1.
4. Voorzichtig pipet het virus vering op en neer meerdere malen en centrifugeer bij 8.000 tpm (6000 xg) bij 4 ° C in een gekoelde microcentrifuge gedurende 1 minuut om de resterende klonten te verwijderen. Houd het monster koude tijdens dit proces.

3. Sucrose gradiëntcentrifugatie om kernen te isoleren

HIV-1-kernen zijn geïsoleerd met behulp van een "spin-thru" methode ^9, dat is een wijziging van de eerder beschreven methode voor de zuivering van HIV-2 cores ^10.

1. Bereid een 12 ml lineair 30% tot 70% sucrose gradiënt in 1XSTE buffer in een 14,5 ml polyallomer centrifugebuis voor SW32.1Ti rotor. Voor te bereiden verloop, gebruik dan een 20 ml gradiënt eerste; plaats 6 ml van 70% sucrose oplossing op de korte zijde (dicht bij de uitlaatpoort) en 6 ml van 30% sucrose-oplossing aan de andere kant. Zorg ervoor dat de luchtbellen niet zitten gevangen in het kanaal verbindt de twee kamers. Gebruik de Auto Densi-Flow gradiënt eerste aan de gradient pomp van onder naar de bovenkant van de buis met 1 ml van 85% sucrose-oplossing aan de onderkant. Plaats voorzichtig de helling bij 4 ° C tot afgekoeld (2-4 uur).
2. Met behulp van een brede-boring 1 ml pipet tip voorzichtig overlay het verloop met 0,25 ml van 15% sucrose oplossing in STE met 1% Triton X-100. Voorzichtig overlay met 0,25 ml van 7,5% sucrose oplossing in STE met behulp van een breed boring 1 ml pipet tip. Wees voorzichtig dat u de lagen mengen.
3. Voorzichtig overlay met 0,5 ml virus suspensie van stap 2.4. Deze stap moet zorgvuldig worden onderzocht op eventuele verstoring in het verloop en het mengen van de underlaid sucrose lagen te voorkomen.
4. Plaats de buizen in de pre-cooled SW32.1Ti emmer en centrifugeer bij 32.000 tpm (187.000 xg bij r _max) 's nachts (16-20 uur) bij 4 ° C. Om te voorkomen dat pauzeren van de centrifuge, niet beginnen centrifugeren totdat het vacuüm in de centrifuge bereikt 250 micrometer
5. Verzamel 1 ml fracties van boven naar beneden van het verloop met behulp van de Auto-Densi-Flow gradiënt fractionator. Plaats de buizen op het ijs onmiddellijk bij de inzameling. Meng de inhoud van de buizen door het omkeren paar keer, en trekken 50 ul van elke fractie voor kwantificering van ELISA of reverse transcriptase activiteit test.

4. Lokalisatie van HIV-1 kernenen opslag van kernen

1. Voor het uitvoeren van uncoating testen, is het belangrijk om te bepalen welke fracties intact HIV-1 cores bevatten. Dit kan worden vastgesteld door p24-ELISA of reverse transcriptase activiteit test met behulp van de 50 ul aliquots vanaf stap 3.6.
2. Het herstel van CA in verband met de kernen is vaak gerelateerd aan de stabiliteit van de kernen. Meet de kern verbonden CA door p24-ELISA ⁹ met behulp van een monster van elke fractie. Als alternatief, meet de activiteit van reverse transcriptase van elke fractie. Met behulp van beide methoden het hoogtepunt moet worden rond fractie 10.
3. Zwembad de fracties die kernen. Als de kernen mogen niet worden gebruikt voor uncoating test onmiddellijk, aliquot de gepoolde kernen in de 0,2 tot 0,3 ml aliquots, flash-vries in vloeibare N2 en bewaar bij -80 ° C. Kernen bevroren op deze manier zijn geschikt voor de uncoating test. De opbrengst van de core-geassocieerde CA is typisch 1-2 ug van p24 per milliliter of ongeveer 15% van de totale virion-geassocieerdep24.

5. Kinetische bepaling van HIV-1 uncoating

1. De hoeveelheid HIV-1 cores nodig per uncoating reactie is ongeveer 50 ng. Voor het uitvoeren van de in vitro uncoating assay, Verdun de hoeveelheid van de kernen met een gelijk volume van koude 1XSTE buffer om de viscositeit van de suspensie te verminderen en pipetteren fouten te minimaliseren.
2. Verder te verdunnen 100 ul van de kernen in 0,15 ml koud 1XSTE buffer met 10 ug / ml van de BSA in een 1,5 ml microcentrifugebuis. We vullen de STE buffer met BSA (10 ug / ml) tot adsorptie van CA te minimaliseren om de muren van de buis. Meng door het buisje meerdere malen. Niet vortex de monsters. Incubeer de buizen in een waterbad bij 37 ° C voor getimede intervallen (15, 30, 60 en 120 min). De buizen moeten worden ondergedompeld in het waterbad ten minste tot het niveau van de interne steekproef om nog opwarming zorgen.
3. Tijdens de incubatie, voorzichtig periodiek meng de inhoud van de buis (meestal 5 -10 min) door de knop van de buis. Voor een nul minuten controle, verdunnen 100 ul van de kernen in 0,15 ml koud 1XSTE buffer en incubeer op ijs gedurende de gehele lengte van het experiment (120 min). De nul minuten controle geeft de basale uncoating waarde en wordt gebruikt om de stijging van de uncoating van de kernen geïncubeerd bij 37 ° C voor de verschillende getimede intervallen te bepalen.
4. Aan het einde van de incubatieperiode, stop het uncoating proces door het plaatsen van de buizen in het ijs gedurende 10 minuten.
5. Centrifugeer de buizen op 45.000 rpm (TLA-55 rotor; 125.000 xg bij r _max) gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Dit zal pellet de intacte kernen en de vrije CA vrijgekomen als gevolg van uncoating van de kernen zal blijven in de supernatant. De rotor moet worden voorgekoeld bij 4 ° C vóór het laden van de monsters.
6. Breng de bovenstaande nieuwe voorgekoeld microfugebuizen buizen bij voorkeur met behulp van gel-loading tips bij kamertemperatuur bewaard. Houdt u er rekening mee dat de pellet niet zichtbaar met het blote oog, dus neem uiterste zorg werwijl pipetteren uit het supernatant. Resuspendeer de pellets in 250 ul van ELISA monster oplosmiddel (0,5% Triton X-100 en 5% Donor kalfsserum in PBS). Teneinde een efficiënt ontbinding van de pellet, vortex zorgen na het toevoegen van de ELISA-monster verdunningsmiddel. Kwantificeren van de CA inhoud van de pellet en supernatant met behulp van p24-ELISA, zoals beschreven in de volgende paragraaf.
7. De omvang van uncoating wordt verkregen door het berekenen van de fractie van de CA in de supernatant.

6. Test voor CA door p24-ELISA

1. Veel commerciële ELISA kits zijn beschikbaar en kunnen worden gebruikt om de CA te kwantificeren. Gebruik een commerciële of "in-house" ELISA en omvatten p24 normen om de lineariteit van de test te bepalen. Verdunningen van de monsters moet worden getest om de nauwkeurigheid te garanderen.
2. We hebben een zelfgemaakte ELISA die routinematig we gebruiken om test voor CA. De procedure is aangepast van een eerder verslag ¹¹ en is uitgevoerd met behulp van capture en detector antilichamen die beschikbaar zijn vanaf NIH AIDS Onderzoek en referentiereagens Program.

7. Representatieve resultaten:

Een voorbeeld van een resultaat van ELISA voor het bepalen van fracties die kern is weergegeven in figuur 1. Na het verzamelen van fracties (1 ml per stuk), werd 50 pi van het monster uit elke fractie gebruikt om seriële verdunningen te maken en geanalyseerd door ELISA. De totale p24 verkregen door het toevoegen van de waarden voor twaalf fracties werd 14,5 microgram. Zoals weergegeven in de figuur fracties 8-10 bevatten kernen. De p24 waarde voor de core-bevattende fracties was 2,17 microgram. Het percentage van de kern-geassocieerde p24 (14,97%) werd bepaald door de verhouding van p24 waarde voor de kern van fracties (2,17 pg) aan de totale waarde van p24 (14,5 pg). Fractie 1 of 2 bevat altijd hoogste bedrag van de p24, dit betekent vrij CA, die niet is gekoppeld aan de kernen. Dit wordt gevolgd door een geleidelijke vermindering van de p24-waarden met elke volgende fractie, dan is een sterke stijging en ten slotte een sterke daling van de p24waarden. Als de juiste zorg wordt genomen tijdens het laden van de helling dan de piek van de kern-geassocieerde CA is in de omgeving van fractie 10.

Een typisch resultaat verkregen door het testen van de kinetiek van uncoating van HIV-1 kernen is weergegeven in Figuur 2. De grafiek toont een tijdsafhankelijke toename in uncoating van de wild-type HIV-1 kernen. Het percentage uncoating waarde werd verkregen door het berekenen van de fractie van de CA in de supernatant. Met de praktijk is de test zeer reproduceerbaar en is nuttig voor het bepalen van de stabiliteit van virale kernen in vitro. Houdt u er rekening mee dat de reproduceerbaarheid van de test is sterk afhankelijk van de correcte afhandeling van de monsters tijdens de procedure. Omdat de kernen zijn hitte labiel, moeten de monsters worden gehandhaafd op 4 ° C gedurende de test, behalve tijdens de incubatietijd.

Figuur 1 Equilibrium dichtheidsgradiënt centrifugeren vanHIV-1 kernen. Een geconcentreerde virus suspensie werd toegepast op de top van een 30 tot 70% lineair sucrose gradiënt bedekt met 1% Triton-X-100. Na een nacht centrifugatie bij 187.000 xg en 4 ° C, 1 ml fracties werden verzameld van boven (Fraction 1) naar beneden (Fraction 12) en p24 werd gekwantificeerd door ELISA.

Figuur 2 Tijd verloop van de HIV-1 uncoating in vitro. Gezuiverd HIV-1 kernen werden verdund en geïncubeerd bij 37 ° C voor de aangegeven tijdsintervallen. De nul-min monster werd geïncubeerd op ijs over de gehele lengte van het experiment. Na de incubatie werden de monsters ultracentrifuged op 125.000 xg gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Supernatant en pellets werden gescheiden en geanalyseerd door p24 ELISA. De mate van uncoating werd bepaald zoals beschreven in het protocol tekst. Elke reactie uncoating werd in duplo uitgevoerd; foutbalken spanwijdte het bereik van de twee waarden.

De hier beschreven methode om HIV-1 kernen te zuiveren om te studeren uncoating in vitro is handig voor het bestuderen van deze fase van de HIV-1 levenscyclus, in het bijzonder als gevolg van onbeschikbaarheid van een gevalideerde methode om HIV-1 uncoating analyseren doelcellen. Hoewel deze methode gebruikt evenwicht ultracentrifugatie te zuiveren kernen, anderen hebben gebruikt direct pilleren na korte lyse met 1% Triton-X-100 ^{12, 13} of pelletering door een sucrose kussen bedekt met 0,1% Triton-X-100 ^{14, 15.}

Het herstel van de kernen deze methode verkregen is onderhevig aan experimentele variatie. Een variabele in het succes van dit protocol is de transfectie-efficiëntie. Normaal gesproken hebben we een lading hoeveelheid virus die ten minste 7 microgram van p24 op het verloop. Ons laboratorium maakt gebruik van een calciumfosfaat transfectie methode voor virus productie. Terwijl andere transfectie methoden kunnen ook geschikt zijn, hebben we niet geëvalueerd ze voor het isoleren van kernen. Andere belangrijke variables dat de belangrijkste opbrengst van invloed zijn de zorg die bij de toepassing van de lagen van de gradiënt en in het houden van de monsters koud. Grootst mogelijke zorgvuldigheid moet worden genomen bij de voorbereiding sucrose gradiënten om te voorkomen dat het mengen van verloop. Elke verstoring, terwijl de toepassing van de geconcentreerde virus suspensie kan leiden tot ongewenste en vroegtijdig contact van de virions met schoonmaakmiddel onder de barrière sacharose laag; zoals langdurig contact kan splitsen de kwetsbare kernen en leiden tot verminderde capside vereniging. Ook is het even belangrijk om de sucrose dichtheidsgradiënt en het virus schorsing koud te houden tijdens de gehele procedure. De procedure is onder de knie en met succes gebruikt door vele verschillende wetenschappers in ons laboratorium.

HIV-1-cores zijn hitte-labiele ^4, daarom is het zeer belangrijk te fractioneren van de sucrose gradiënt, terwijl het koud is en onmiddellijk plaats van de ingezamelde fracties op het ijs. Sinds uncoating van de kernen is ook afhankelijk van de pH en de zoutconcentratie van de buffer^4, is het zeer aan te raden om de pH van STE buffer te meten voordat u verder gaat met de test. Het tarief van uncoating kunnen enigszins verschillen met iedere batch kernen. Uncoating reacties dienen te worden uitgevoerd in duplo, en als de waarden afwijken door meer dan 15%, dan is de reacties dienen te worden uitgevoerd in drievoud tot consistentie is bereikt. Gratis CA eiwit heeft de neiging vast te houden aan de binnenkant van de buizen, daarom is het noodzakelijk om BSA ten een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml in het reactiemengsel om adsorptie van CA te minimaliseren aan de wanden van de buizen.

Zoals eerder vermeld, de uncoating test hier beschreven kan worden gebruikt voor het identificeren en bestuderen cellulaire factoren die van invloed uncoating. Het kan ook worden gebruikt om het effect van de capside gericht op verbindingen en cellulaire factoren op de reverse transcriptie in kernen met behulp van een endogene reverse transcriptie assay te bestuderen. Isolatie van HIV-1 kernen in voldoende hoeveelheden kan ook toestaan ​​dat de analysevan interacties van de capside met cellulaire factoren die door immunogold elektronenmicroscopie.