Chronische Vernauwing van de nervus ischiadicus en Pijn Overgevoeligheid Testen bij ratten

1. Heupzenuw Chronische Vernauwing

Aseptisch worden gebruikt voor de chirurgische procedure. Ontsmet de chirurgische werkblad met 70% ethanol en voor te bereiden op voorhand steriele instrumenten (bv., fijn schaar, pincet, en oprolmechanisme), gaasjes, nietjes en swabs in de autoclaaf. Voor meerdere operaties, reinigen en opnieuw steriliseren instrumenten met 70% ethanol of een droge korrel sterilisator tussen de ratten. Een chirurgisch masker, haar motorkap en steriele handschoenen te worden gedragen.

Voor vernauwing van de zenuw, de voorbereiding van de chroom-darm hechtingen door te snijden in kleine stukjes van ongeveer 3 cm lang ondergedompeld in een steriele zoutoplossing, aan het drogen te voorkomen. Voor het sluiten van de wond, gebruik in de handel verkrijgbare steriele zijden hechtdraden.

1. Verdoven de rat in een inductie-kamer met 5% isofluraan in O _2, dan levert 2% isofluraan in O ₂ via een op maat gemaakt gezichtsmasker, en toezicht houden op de verdoofd dier tijdens de procedure. Vaak alternatief anesthetica worden ingeademd halothaan of intraperitoneale natriumpentobarbital. Ketamine, een N-methyl-D-aspartaat-(NMDA)-receptorantagonist, te worden vermeden aangezien deze receptoren belangrijk in de ontwikkeling van neuropathische pijn.
2. Scheer de linker achterpoot van de rat. Vervolgens het dier te plaatsen op een thermo-gereguleerde mat bij 37 ° C en toepassing smeerolie oogzalf voor de ogen.
3. Steriliseer het geschoren gebied met drie alternatieve toepassingen van 70% isopropyl alcohol en jodium oplossing.
4. Met de rat ligt op zijn borst / thorax, verheffen linker achterpoot en in positie te houden met de femor op 90 ° ten opzichte van de wervelkolom met behulp van plakband op de voet.
5. Maak een insnijding in de huid parallel, maar 3-4 mm onder de femor en gratis de huid van de spieren rond de incisie door te snijden door middel van het bindweefsel.
6. Met behulp van stompe schaar, dwars door het bindweefsel tussen de gluteus superficialis en de bicepsfemoris spieren.
7. Gebruik een oprolmechanisme om de kloof tussen de twee spieren te verruimen, zodat duidelijke visualisatie van de nervus ischiadicus.
8. Met behulp van gebogen stompe-tip tang en micro-schaar, zachtjes gratis ongeveer 10 mm van de nervus ischiadicus (proximaal van de nervus trifurcation) van het omringende bindweefsel.
9. Onder de microscoop en een goede lichtbron, bind vier ligaturen (chroomzuur darm 4.0, Ethicon, USA) met een dubbele knoop, 1 mm van elkaar, proximaal van de trifurcation van de nervus ischiadicus. Voor elke ligatuur, beginnen met een losse lus, dan pakt u de twee uiteinden in de buurt van de lus en draai totdat de lus is maar net strak en de ligatuur niet glijden langs de zenuw. De lus in de juiste positie te houden, plaatst de tweede lus bovenop de eerste naar de knoop te voltooien. Tot slot, knip de losse uiteinden van de ligatuur tot ongeveer 1 mm. Vernauwing van de zenuw moet minimaal zijn, en onmiddellijk gestopt als een korte twitch wordt waargenomen, om te voorkomen dat de arrestatie van the epineural doorbloeding. Over het aandraaien van de ligaturen leidt tot axotomy en autotomie (zelfverminking), zowel ongewenste bijwerkingen die succesvol pijn overgevoeligheid testen uit te sluiten.
10. Gebruik hechtingen (Mersilk 5.0, Ethicon) om de spierlaag en nietjes (Autoclip, 9 mm) dicht bij de huid vast te zetten. Vervolgens gebruik jodiumoplossing (Riodine) op de wond steriliseren.
11. Observeer de rat gedurende de anesthesie herstelperiode, en laat het te herstellen in een aparte kooi met platte papieren beddengoed (niet de standaard veehouderij beddengoed), om het onbewuste dier verstikking te voorkomen.
    Voor opgave van post-operatieve analgesie onderzoekers zou het feit dat dit kan interfereren met pijn overgevoeligheid van proeven. In feite zijn er aanwijzingen dat lokale toepassing van verdoving, lidocaïne, op het moment van schade kan de ontwikkeling van neuropathische pijn te veranderen, en de mate van de hyperalgesie in de voorafgaande weken ^7. Voor verdere discussie over dit mAtter zie beoordeling door Bennett et al. ^8.

2. Metingen van Pijn Gedrag

1. Dagelijkse behandeling van ratten enkele dagen voordat het experiment wordt aanbevolen om de ratten wennen aan de geleider, stress te verminderen en het risico van bijten.
2. Voorafgaand aan de gedrags-testen, ratten moeten worden gewend aan de testprocedure en de dierenweide. De testomgeving moet worden gehouden rustig en goed onder controle, met een constante temperatuur en luchtvochtigheid, en uitgevoerd op een vergelijkbaar moment van de dag elke testsessie.
3. Pijn overgevoeligheid testen moeten worden uitgevoerd meerdere malen voor CCI (baseline) en op verschillende tijdstippen na CCI, zoals gewenst.

3. Mechanische onttrekkingsdrempel

1. Op de dag van testen, plaats ratten in de verhoogde vloer maas testen kooi 15-30 minuten vóór de meting terugtrekking drempels, waardoor kooi exploratie en GrooMing-activiteiten te staken en ratten te worden ontspannen en stilstaat.
2. Met behulp van een dynamische plantaire von Frey aesthesiometer (Ugo Basile, Italië), de positie van de touch-stimulator unit met de gloeidraad direct onder het midden van de voetzool van de achterpoot, het vermijden van de metalen gaas en druk op de startknop. Dit tilt de gloeidraad aan de voetzool van de achterpoot mechanisch te stimuleren met een toenemende kracht.

Manual von Frey haren een reeks van toenemende diameter filamenten die zijn afgestemd op een specifieke kracht op te wekken indien toegepast op de huid. Ze kunnen worden gebruikt als alternatief voor een elektronisch dynamische plantaire von Frey aesthesiometer voor het meten van poot onttrekkingsdrempel, zoals eerder beschreven ^4. Er zijn ook verschillende andere fabrikanten van elektronische von Frey aesthesiometers (bijv. IITC, Verenigde Staten en Somedic, Zweden).

3. Noteer de mechanische onttrekkingsdrempel van zowel gewonden en niet-gewonde hindpaws, in een wisselende volgorde. Dit apparaat is van toepassing druk om de poot en bij de uitslag de reactie van het systeem registreert automatisch en geeft de maximale kracht uitgeoefend (in gram). Als een dubbelzinnige reactie optreedt (in het geval van ambulantie of verzorging), herhaalt u de stimulus en opnieuw op te nemen van de drempel. Likken of schudden van de achterpoot volgende stimulatie is een teken van gedrag dat gepaard gaat met pijn.
4. Herhaal de mechanische stimulatie 3 keer met een interval van ongeveer 5 min tussen stimuli, nemen de drempels, en dan berekent het gemiddelde van poot terugtrekking drempels.

4. Thermische Intrekking Latency

De infrarood (IR) warmte-intensiteit van de plantaire testinstrument moet worden aangepast voordat het experiment. In ons laboratorium, passen we de IR-intensiteit op een gemiddelde poot terugtrekken latency van ongeveer 10 seconden in naïeve ratten geven, en we de cut-off latency op 20 seconden van het weefsel dam te voorkomenleeftijd in het geval van onvermogen om een ​​poot te verwijderen.

1. Op de dag van testen, om plaats ratten in de glazen vloer testen kooi 15-30 minuten voor het meten van latency, waardoor kooi exploratie en verzorgen activiteiten te staken en ratten worden ontspannen en stilstaat.
2. Met behulp van een thermische plantaire analgesie instrument (Ugo Basile, Italië), de positie van de infrarood-bron direct onder het midden van de voetzool van de achterpoot, en druk op de startknop. Dit onthult de plantaire oppervlak van de achterpoot van een straal van stralingswarmte door middel van een transparante glazen oppervlak. Er zijn ook alternatieve fabrikanten van thermische plantaire analgesie instrumenten (bv. IITC, Verenigde Staten en Stoelting, USA).
3. Noteer de terugtrekking latency van beide gewonden en onbeschadigd hindpaws, in een wisselende volgorde. Dit apparaat registreert automatisch de tijd die nodig is (in seconden) vanaf het begin van de thermische stimulus tot intrekking van de poot van de warmtebron. Als een dubbelzinnige reactie optreedt (in het geval van ambulaTIE of verzorging), herhaalt u de stimulus en opnieuw op te nemen van de latentie. Likken of schudden van de achterpoot volgende stimulatie is een teken van gedrag dat gepaard gaat met pijn.
4. Herhaal de warmte stimulatie ten minste 3 keer met een interval van ongeveer 5 min tussen stimuli, nemen de latencies, en dan berekent het gemiddelde van poot terugtrekking latency.

4. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van mechanische en thermische onttrekkingsdrempel terugtrekking vertraging in het ipsilaterale (gewonden) en contralaterale (ongeschonden) poten van Wistar ratten weergegeven voordat (baseline) en 2-12 dagen na CCI in figuur 3A en fig. 3B. Uit deze figuren blijkt dat CCI een aanzienlijke vermindering van de mechanische en thermische onttrekkingsdrempel terugtrekking latentie van het ipsilaterale achterpoot veroorzaakt, waarbij de aanwezigheid van mechanische en thermische pijn overgevoeligheid beide kenmerken van chronische neuropathische pijn .

Figuur 1. Een schematische illustratie van de positionering van de ligaturen de CCI model. Dit diermodel van neuropathische pijn gaat om plaatsing van vier losse chroom-gut ligaturen op de heupzenuw, halverwege de dij niveau. Dit resulteert in verwonden slechts een deel van de afferentia naar de voet en de daaropvolgende pijn hypersensitiviteit van de achterpoot.

Figuur 2. Schema van de achterpoot areaal voor pijn testen. De mid-voetzool juist achter de voetensteun, zoals aangegeven door de gestippelde cirkel rode, wordt gebruikt voor pijn testen. Dit gebied wordt vooral gestimuleerd door terminal takken van de nervus ischiadicus. De hiel en voetkussens moeten als gevolg van verschil in gevoeligheid van de huid worden vermeden.

3.jpg "/>
Figuur 3. Pijn overgevoeligheid na chronische vernauwing van de nervus ischiadicus bij de rat. Na CCI is er een aanzienlijke vermindering poot onttrekkingsdrempel mechanische stimuli (A) en poot terugtrekking latentie thermische stimuli (B) in de gewonde (ipsilaterale) achterpoot opzichte van de onbeschadigde (contralaterale) achterpoot (P <0,01 herhaalde metingen 2 -way ANOVA). Uit de gegevens blijkt gemiddelde ± sem, n = 7 Wistar ratten.

CCI is een veel gebruikte perifere zenuwschade model van chronische neuropathische pijn. Het is relatief eenvoudig uit te voeren, en produceert robuuste en stabiele pijn overgevoeligheid ten minste een maand na verwonding. Naar aanleiding van CCI, ratten vertonen abnormale houding van de gewonde achterpoot (tenen bij elkaar gehouden en plantaire-gebogen en poot eversie), maar ook herhaaldelijk schudden, bewaking en likken van de gewonde achterpoot suggereert de aanwezigheid van spontane pijn ^9. Naast de sensorische disfunctie, een aantal onderzoekers hebben aangetoond dat CCI gedrag een handicap, zoals verstoorde sociale interacties, slaapstoornissen, depressie-achtige en angst-achtige gedrag ^10-13 oproept, maar dit is in tegenstelling tot het uitblijven van een dergelijke gedragsverandering een handicap vinden anderen ^14,15. CCI wordt daarom vaak gebruikt om zowel de pathofysiologie, en potentiële therapeutische middelen voor de behandeling van neuropathische pijn te onderzoeken.

We descrIbe eenzijdige vernauwing van de linker nervus ischiadicus, maar het dient te worden opgemerkt dat vele onderzoekers hebben CCI uitgevoerd op de juiste heupzenuw, met vergelijkbare pijn en gedragsmatige uitkomsten. Sommige onderzoekers vinden het makkelijker om een ​​operatie uit te voeren op een bepaalde kant te wijten aan willekeur, terwijl andere ingeschakeld kanten binnen experimenten uit te sluiten bias. Het is opmerkelijk dat een aantal wijzigingen in de oorspronkelijke procedure zijn gemeld, waaronder met behulp van slechts 2 ligaturen rond de zenuw ^16,17 en het gebruik van hechtmateriaal anders dan chroomzuur darmen, zoals gewone darm en polyglactine (Vicryl) ^18,19 bij ratten. Bovendien heeft de CCI model ook aangepast voor gebruik in muizen, waarbij de procedure identiek, behalve voor het gebruik van 2-3 ligaturen met verschillende hechtmateriaal zoals chroomzuur darm nylon en prolene ^15,20,21.

Een beperking van dit model is de mate van variatie tussen de ratten blootgesteld aan CCI, als gevolg van variabiliTy in de dichtheid van de vernauwingen die door koppelverkoop knopen met de hechtingen. Dit kan gedeeltelijk worden ondervangen door het hebben van een ervaren onderzoeker het uitvoeren van de operatie op een consistente manier. Bovendien kan het type hechtmateriaal voor ligatie van het zenuw ook bijdragen aan variabiliteit en aangenomen wordt dat stoffen uit het chroomzuur darm aantal gedrags-en neurochemische waargenomen in dit model ^19,22 bemiddelen. Speciale aandacht moet worden besteed aan de keuze van de rat geslacht (mannen versus vrouwen) ^23, leeftijd (jong versus oud) ^24,25, dieet ²⁶ en ²⁷ stam, die aanzienlijk kunnen invloed hebben op de ontwikkeling van pijn overgevoeligheid na CCI.

Pijn overgevoeligheid testen, met behulp van een elektronische von Frey aesthesiometer of handmatige von Frey haren voor mechanische terugtrekking drempel en een plantaire analgesie (Hargreaves) meter voor thermische terugtrekking latency, zijn goed ingeburgerd en opnieuwaansprakelijk kwantitatieve maatregelen van pijn overgevoeligheid in kleine dieren. Het gebruik ervan in combinatie met modellen van neuropathische pijn, zijn wijdverspreid en zorgen voor directe vergelijkingen van de poot gevoeligheid voor mechanische en thermische stimuli in de verschillende behandelingsmogelijkheden, en tussen de verschillende stammen van ratten. Opgemerkt dat andere gedrag assays, zoals de pen priktest en koude allodynie ook worden gebruikt voor het testen CCI geïnduceerde pijn overgevoeligheid ^8.

Hoewel het gebruik van reflexieve terugtrekking uit mechanische of thermische prikkels is de belangrijkste maatregel van neuropatische pijn bij dit model en anderen, is onlangs bekritiseerd vanwege de slechte correlatie met de menselijke symptomen en de betrokkenheid van de grote experimentator partijdigheid ^28. Daarom zou het gebruik van extra paradigma's, zoals operante maatregelen van pijn ²⁹ en spontaan uitgestoten gedrag ³⁰ nuttig zijn.

Niettemin desPite deze beperkingen, de CCI-model en de poot terugtrekken tests voor het meten van pijn overgevoeligheid zijn cruciaal voor het begrijpen van de mechanismen van neuropathische pijn en het identificeren van nieuwe pijnstillende doelen. In ons laboratorium hebben we routinematig uitvoeren van CCI en meten van mechanische poot terugtrekken drempels en thermische poot terugtrekken latency, om te begrijpen hoe neuro-immuun interacties bijdragen aan neuropathische pijn ^31, en ​​van het potentieel van het moduleren van het immuunsysteem om de pijn te overgevoeligheid te verminderen.