Constriction chronique du nerf sciatique et les essais hypersensibilité à la douleur chez le rat

1. Constriction du nerf sciatique chronique

Des techniques aseptiques devraient être utilisées pour la procédure chirurgicale. Désinfecter la surface de travail chirurgical avec de l'éthanol 70% et se préparer à l'avance des instruments stériles (par exemple, des ciseaux fins, pinces, et rétracteurs), les gazes, des agrafes et des prélèvements à l'autoclave. Pour de multiples interventions chirurgicales, nettoyer et instruments restériliser d'éthanol à 70% ou un stérilisateur à sec cordon entre les rats. Un masque chirurgical, chapeau cheveux et des gants stériles devraient être portés.

Pour la constriction du nerf, de préparer la suture intestinale chromique en le coupant en petits morceaux d'environ 3 cm de longueur immergés dans une solution saline stérile, pour éviter le dessèchement. Pour refermer la plaie, utilisez disponibles dans le commerce sutures de soie stériles.

1. Anesthésier le rat dans une chambre d'induction en utilisant 5% d'isoflurane en O _2, puis elle émet 2% l'isoflurane en O ₂ par l'intermédiaire d'une coutume fait un masque facial, et de surveiller l'animal anesthésié au cours de la procédure. Communes anesthésiques alternatives sont inhalées halothane ou de sodium par voie intrapéritonéale du pentobarbital. La kétamine, comme un antagoniste des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA), devrait être évitée puisque ces récepteurs jouent un rôle important dans le développement de la douleur neuropathique.
2. Rasez la patte postérieure gauche du rat. Ensuite, placez l'animal sur un tapis chauffant thermo-régulée à 37 ° C et d'appliquer une pommade ophtalmique lubrifiante pour les yeux.
3. Stériliser la zone rasée avec trois applications de remplacement de l'alcool isopropylique à 70% et une solution d'iode.
4. Avec le rat couché sur sa poitrine / thorax, élever la jambe gauche de derrière et maintenir en position avec le femor à 90 ° par rapport à la colonne vertébrale à l'aide de ruban-cache sur le pied.
5. Faire une incision dans la peau parallèlement, mais de 3-4 mm en dessous de la femor, et libérer la peau des muscles entourant l'incision en coupant à travers le tissu conjonctif.
6. Avec des ciseaux émoussés, coupées à travers le tissu conjonctif entre les fessiers superficiel et les bicepsmuscles crural.
7. Utiliser un écarteur à creuser l'écart entre les deux muscles, ce qui permet une visualisation claire du nerf sciatique.
8. Utilisation de courbes atraumatiques pince et micro-ciseaux, doucement libre environ 10 mm du nerf sciatique (à proximité de la trifurcation sciatique) à partir du tissu conjonctif environnant.
9. Sous le microscope et une bonne source de lumière, attachez quatre ligatures (intestin chromique 4.0, Ethicon, États-Unis) avec un double nœud, 1 mm d'intervalle, à proximité de la trifurcation du nerf sciatique. Pour chaque ligature, commencer avec une seule boucle lâche, puis saisissez les deux extrémités à proximité de la boucle et serrer jusqu'à ce que la boucle est à peine serré et la ligature ne glisse pas le long du nerf. Pour maintenir la boucle dans sa position correcte, placer une deuxième boucle sur le dessus de la première à terminer le nœud. Enfin, couper les bouts de la ligature d'environ 1mm. Constriction du nerf devrait être minime, et immédiatement arrêté si une secousse brève est observée, pour empêcher l'arrestation d'edébit sanguin e epineural. Au cours de serrer les ligatures conduit à axotomie, et autotomie (auto-mutilation), les deux effets secondaires indésirables qui empêchent succès les tests hypersensibilité à la douleur.
10. Utilisez des sutures (Mersilk 5.0, Ethicon) pour fermer la couche musculaire et des agrafes (Autoclip, 9 mm) pour fixer la peau. Ensuite, utilisez une solution d'iode (Riodine) pour stériliser la plaie.
11. Observez le rat étroitement au cours de la période de récupération d'anesthésie, et lui permettre de récupérer dans une cage séparée avec lit le papier à plat (pas la litière des animaux d'élevage norme), afin d'éviter l'animal inconscient d'étouffement.
    Avant de donner des enquêteurs analgésie post-opératoire doit tenir compte du fait cela peut interférer avec les tests hypersensibilité à la douleur. En fait, il existe des preuves que l'application locale d'anesthésique, la lidocaïne, au moment du traumatisme peut altérer le développement de la douleur neuropathique, et de diminuer le degré de l'hyperalgésie dans les semaines précédentes ^7. Pour plus de détails sur ce mAtter voir revue par Bennett et al ^8.

2. Les mesures de comportements de la douleur

1. Des manipulations quotidiennes des rats pendant plusieurs jours avant de commencer l'expérience est recommandé afin d'habituer les rats à leur gestionnaire, réduire le stress et le risque de mordre.
2. Avant les tests de comportement, les rats ont besoin d'être habitué à la procédure de test et le compartiment des animaux. L'environnement du test devrait rester au calme et bien contrôlée, avec la température et hygrométrie constantes, et réalisé à la même époque de la journée chaque session de test.
3. Hypersensibilité à la douleur des tests doivent être effectués plusieurs fois avant de l'ICC (base) et à différents moments après l'ICC, comme vous le souhaitez.

3. Seuil de retrait mécanique

1. Le jour du test, les rats placer dans la cage des tests de maille élevée étages 15-30 minutes avant de mesurer les seuils de retrait, ce qui permet la cage d'exploration et de Grooactivités ming de cesser et de rats de devenir détendu et immobile.
2. En utilisant une dynamique plantaire von Frey esthésiomètre (Ugo Basile, Italie), la position de l'unité de contact-stimulateur avec le filament directement sous la surface mi-plantaire de la patte arrière, en évitant le treillis métallique, et appuyez sur la touche de démarrage. Ce lève le filament à stimuler mécaniquement la surface plantaire de la patte arrière avec une force croissante.

Manuelles von poils Frey sont une série de filaments de diamètre croissant qui sont calibrés pour induire une force spécifique lorsqu'elle est appliquée sur la peau. Ils peuvent être utilisés comme une alternative à un esthésiomètre électronique plantaire dynamique von Frey pour la mesure du seuil de retrait de la patte, comme décrit précédemment ^4. Il ya également plusieurs autres fabricants de von électronique esthésiomètres Frey (p. ex IITC, Etats-Unis et Somedic, Suède).

3. Enregistrez le seuil de retrait mécanique de hindpa fois blessé et saufsws, dans un ordre contrebalancé. Ce dispositif applique une pression sur la patte et de la réaction de retrait le système enregistre et affiche automatiquement la force maximale appliquée (en grammes). Si une réponse ambiguë se produit (c.-à-dans le cas de la marche ou de toilettage), répétez le stimulus et enregistrer le seuil à nouveau. Lécher ou en secouant de la stimulation suivante patte arrière est un signe de comportement associé à la douleur.
4. Répétez la stimulation mécanique 3 fois avec un intervalle d'environ 5 min entre les stimuli, enregistrer les seuils, puis calculer la moyenne des seuils de retrait de la patte.

4. Latence de retrait thermique

L'intensité de chaleur infra-rouge (IR) de l'instrument d'essai plantaire doit être ajustée avant de commencer l'expérience. Dans notre laboratoire, nous ajustons l'intensité IR de donner un temps de latence moyen de patte de retrait d'environ 10 secondes chez les rats naïfs, et nous avons mis le temps de latence de coupure à 20 secondes pour éviter d'endommager les tissusl'âge en cas d'échec pour supprimer une patte.

1. Le jour du test, les rats placer dans la cage de verre tests étages 15-30 minutes avant de mesurer la latence, permettant l'exploration cage et le toilettage des activités de cesser et les rats de devenir détendu et immobile.
2. L'utilisation d'un instrument de l'analgésie thermique plantaire (Ugo Basile, Italie), la position de la source infrarouge directement sous la surface mi-plantaire de la patte arrière, et appuyez sur la touche de démarrage. Cette situation expose la surface plantaire de la patte arrière d'un faisceau de chaleur rayonnante à travers une surface en verre transparent. Il ya aussi d'autres fabricants de thermiques instruments analgésie plantaires (p. ex IITC, Etats-Unis et Stoelting, Etats-Unis).
3. Noter le temps de latence de retrait à partir de pattes de derrière à la fois blessés et saufs, dans un ordre contrebalancé. Ce dispositif enregistre automatiquement le temps nécessaire (en secondes) depuis le début de la stimulation thermique pour le retrait de la patte de la source de chaleur. Si une réponse ambiguë se produit (c.-à-dans le cas de ambulation ou de la toilette), répétez le stimulus et enregistrer le temps de latence à nouveau. Lécher ou en secouant de la stimulation suivante patte arrière est un signe de comportement associé à la douleur.
4. Répétez la stimulation de la chaleur au moins 3 fois avec un intervalle d'environ 5 min entre les stimuli, enregistrer les temps de latence, puis calculer la moyenne des temps de latence retrait de la patte.

4. Les résultats représentatifs

Un exemple de seuil de retrait mécanique et de la latence de retrait thermique dans les pattes ipsilatéral (blessé) et controlatéral (indemne) de rats Wistar est montré avant (de référence) et 2-12 jours après l'ICC à la figure 3A, et la figure 3B. De ces chiffres, il peut être vu que de l'ICC entraîne une réduction significative dans les deux seuils de retrait mécaniques et thermiques latences de retrait de la patte postérieure ipsilatérale, indiquant la présence d'hypersensibilité à la douleur mécanique et thermique, les deux caractéristiques de la douleur neuropathique chronique .

Figure 1. Un schéma illustrant le positionnement des ligatures dans le modèle ICC. Ce modèle animal de la douleur neuropathique implique le placement de quatre lâches chromique-intestinale ligatures sur le nerf sciatique, à mi-cuisse. Il en résulte qu'une partie blesser des afférents allant de l'hypersensibilité à la douleur pied et postérieure de la patte arrière.

Figure 2. Schéma de la zone patte arrière utilisé pour le test de douleur. La surface à mi-plantaire juste derrière les coussinets plantaires, comme indiqué par le cercle rouge en pointillés, est utilisé pour le test de douleur. Cette zone est innervé principalement par les branches terminales du nerf sciatique. Le talon et coussinets doivent être évités en raison de la sensibilité cutanée différentielle.

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Hypersensibilité à la douleur la figure 3. À la suite de constriction chronique du nerf sciatique chez le rat. Après l'ICC, il ya une réduction significative du seuil de retrait de la patte à des stimuli mécaniques (A) et la latence de retrait de patte à des stimuli thermiques (B) en la personne lésée (ipsilatéral) patte arrière par rapport à la non blessé (controlatéral) patte arrière (P <0,01 mesures répétées 2 ANOVA). Les données montrent moyenne ± SEM, n = 7 rats Wistar.

CCI est largement utilisé modèle de périphérique des lésions nerveuses de la douleur neuropathique chronique. Il est relativement simple à réaliser, et produit hypersensibilité à la douleur robuste et stable pour au moins un mois après une blessure. Après l'ICC, les rats présentent une posture anormale de la patte arrière lésée (orteils maintenues ensemble et flexion plantaire et la patte éversée), ainsi que répété en secouant, de gardiennage et le léchage de la patte arrière lésée suggérant la présence de la douleur spontanée ^9. En plus de dysfonctionnement sensoriel, plusieurs chercheurs ont montré que l'ICC évoque des troubles du comportement, tels que perturbé les interactions sociales, troubles du sommeil, dépression et l'anxiété-comme-comme des comportements ^10-13, mais cela est en contraste avec l'échec à trouver ces troubles du comportement par d'autres ^14,15. CCI est donc couramment utilisé pour étudier à la fois la physiopathologie, et des agents thérapeutiques potentiels pour le traitement de la douleur neuropathique.

Nous descrBIE constriction unilatérale du nerf sciatique gauche, mais il convient de noter que de nombreux expérimentateurs ont effectué CCI sur le nerf sciatique droit, avec douleur semblable et les résultats comportementaux. Certains chercheurs peuvent trouver plus facile d'effectuer une chirurgie sur un côté spécifique en raison de latéralité, tandis que d'autres ont changé de camp dans les expériences d'écarter tout préjugé. Il est à noter que plusieurs variantes de la procédure d'origine ont été signalés, y compris en utilisant seulement 2 ligatures autour du nerf et l'utilisation de ^16,17 matériel de suture autre que l'intestin chromique tels que l'intestin plaine et polyglactine (vicryl) ^18,19 chez les rats. En outre, le modèle de l'ICC a également été modifié pour l'usage chez la souris, où la procédure est identique, sauf pour l'utilisation de ligatures 2-3 avec des matériaux de suture divers, y compris l'intestin chromique, le nylon et prolène ^15,20,21.

Une limitation de ce modèle est le degré de variation entre les rats soumis à l'ICC, en raison de variabité dans l'étanchéité des constrictions produites par des nœuds avec les points de suture. Cela peut être partiellement surmonté par un chercheur expérimenté ayant effectuer la chirurgie d'une manière cohérente. En outre, le type de matériel de suture utilisé pour la ligature du nerf peut également contribuer à la variabilité, et on croit que les produits chimiques à partir de l'intestin chromique médiation quelques-uns des effets comportementaux et neurochimiques observés dans ce modèle ^19,22. Une attention particulière devrait être accordée au choix du sexe chez le rat (mâles par rapport aux femmes) ^23, l'âge (jeunes contre vieux) ^{24,25, 26} et alimentation souche ^27, ce qui peut considérablement influer sur le développement d'une hypersensibilité douleur à la suite de l'ICC.

Tests hypersensibilité à la douleur, en utilisant un système électronique von Frey esthésiomètre ou manuelles von Frey poils pour seuil de retrait mécanique et une analgésie plantaire (Hargreaves) mètres de la latence de retrait thermique, sont bien établies et resusceptibles de mesures quantitatives de hypersensibilité à la douleur chez les petits animaux. Leur utilisation, en combinaison avec des modèles de douleur neuropathique, sont très répandus et permettent des comparaisons directes de la sensibilité de patte à des stimuli mécaniques et thermiques à travers différentes options de traitement, et entre différentes souches de rats. Il convient de noter que d'autres tests comportementaux, tels que le test piqûre d'épingle et l'allodynie froide, sont également utilisés pour tester l'ICC-douleur induite par une hypersensibilité ^8.

Bien que l'utilisation de retrait réflexif à partir de stimuli mécaniques ou thermiques est la principale mesure de la douleur neuropathique dans ce modèle et d'autres, il a récemment été critiquée pour sa faible corrélation avec les symptômes de l'homme et la participation de partialité expérimentateur considérable ^28. Par conséquent, l'utilisation de paradigmes supplémentaires telles que les mesures opérantes de la douleur ²⁹ et comportements spontanément émis ³⁰ serait bénéfique.

Néanmoins, despite de ces limites, le modèle de l'ICC et les tests de retrait de la patte pour hypersensibilité à la douleur de mesure sont essentiels à la compréhension des mécanismes de la douleur neuropathique et identifier de nouvelles cibles analgésiques. Dans notre laboratoire, nous avons systématiquement effectuer des CCI et de mesurer les seuils mécaniques et thermiques retrait de la patte latences retrait de la patte, afin de comprendre comment les interactions neuro-immunes contribuer à la douleur neuropathique ^31, et d'évaluer le potentiel de moduler le système immunitaire afin de réduire hypersensibilité à la douleur.