Kronisk innsnevring av isjiasnerven og Smerter Overfølsomhet Testing i Rats

1. Hoftenervene Kronisk Sammensnøring

Aseptiske teknikker skal brukes for den kirurgiske prosedyren. Desinfiser kirurgisk arbeidsflaten med 70% etanol og forberede på forhånd sterile instrumenter (f.eks, fine sakser, pinsetter og inntrekking), gauzes, stifter og vattpinner ved autoklavering. For flere operasjoner, rengjøre og resteriliseres instrumenter med 70% etanol eller en tørr perle sterilisatoren mellom rotter. En kirurgisk maske, hår panser og sterile hansker.

For innsnevring av nerve, forberede kromsyre tarmen sutur ved å skjære den opp i små biter på ca 3 cm lengde nedsenket i sterilt saltvann, for å hindre uttørking. For å lukke såret, bruk kommersielt tilgjengelige sterile silke suturer.

1. Anaesthetise rotta på en induksjon kammer med 5% isofluran i O _2, deretter levere 2% isofluran i O ₂ via en spesiallaget ansiktsmaske, og overvåke bedøvet dyret under prosedyren. Vanlige alternative bedøvelsesmidler er inhalert halotan eller intraperitoneal natrium pentobarbital. Ketamin, som en N-metyl-D-aspartat (NMDA), bør unngås, da disse reseptorene er viktige i utviklingen av nevropatisk smerte.
2. Barbere venstre bakbein av rotte. Deretter plasserer dyret på en termo-regulert varme matte ved 37 ° C og gjelder smøring ophthalmic salve til øynene.
3. Steriliser barberte området med tre alternative anvendelser av 70% isopropylalkohol og jod løsning.
4. Med rotta liggende på brystet / thorax, heve venstre bakbein og hold i stilling med femor ved 90 ° til ryggraden bruke maskeringstape på foten.
5. Lag et snitt i huden parallelt, men 3-4 mm under femor, og fri huden fra muskelen rundt snittet ved å skjære gjennom bindevevet.
6. Ved hjelp av sløve sakser, skjærer gjennom bindevevet mellom gluteus superficialis og bicepsfemoris muskler.
7. Bruk en retractor å utvide gapet mellom de to musklene, slik klar visualisering av hoftenervene.
8. Ved hjelp av buede sløv-tipped tang og mikro-saks, forsiktig gratis ca 10 mm på isjiasnerven (proksimalt for sciatic trifurcation) fra omkringliggende bindevev.
9. Under mikroskopet og en god lyskilde, binde fire ligaturer (kromsyre gut 4.0, Ethicon, USA) med en dobbel knute, 1 mm fra hverandre, proksimalt for trifurcation av hoftenervene. For hver ligatur, starte med en enkelt løs sløyfe, så ta tak i de to endene nær sløyfen og stram til loopen er bare så vidt tettsittende og ligatur ikke skyve ikke langs nerve. Å holde løkken i sin rette posisjon, plasserer en andre sløyfe på toppen av den første å fullføre knuten. Til slutt kuttet de løse endene av ligatur til rundt 1mm. Innsnevring av nerve bør være minimal, og straks stanset hvis en kort rykk observeres, for å hindre arresterer av the epineural blodstrømmen. Over etterstramming av ligaturer fører til axotomy, og autotomy (self-lemlestelse), begge uønskede bieffekter som utelukker vellykket smerte overfølsomhet testing.
10. Bruk suturene (Mersilk 5.0, Ethicon) for å lukke muskel lag og stifter (Autoclip, 9 mm) for å feste huden. Deretter bruker jod-løsning (Riodine) å sterilisere såret.
11. Observer rotte tett under anestesi utvinning perioden, og la den komme i en egen bur med flat papir sengetøy (ikke standard husdyrhold sengetøy), for å hindre det ubevisste dyret kveles.
    Før gi noen postoperative analgesi etterforskere bør vurdere det faktum dette kan forstyrre smerter overfølsomhet testing. Faktisk, det er dokumentert at lokal anvendelse av bedøvelse, lidokain, på tidspunktet for skade kan endre utviklingen av nevropatisk smerte, og redusere graden av hyperalgesia i de foregående ukene ^7. For ytterligere diskusjon om dette matter se gjennomgang av Bennett et al ^åtte.

2. Målinger av Pain Atferd

1. Daglig håndtering av rotter i flere dager før du starter forsøket anbefales for å venne rottene til behandlingsprogram deres, redusere stress og risiko for biting.
2. Før atferdsmessige testing, rotter må habituated til testprosedyren og dyret kabinettet. Testomgivelsene bør holdes stille og godt kontrollert, med konstant temperatur og luftfuktighet, og gjennomføres på et tilsvarende tidspunkt hver testøkt.
3. Smerter overfølsomhet testing bør utføres flere ganger før CCI (baseline) og ved ulike tidspunkt etter CCI, som ønsket.

3. Mekanisk Tilbaketrekking Threshold

1. På dagen for testing, sted rotter inn i forhøyet mesh floored testing bur 15-30 minutter før måling tilbaketrekking terskler, slik at buret leting og GroMing aktiviteter for å slutte og rotter til å bli avslappet og i ro.
2. Ved hjelp av en dynamisk plantar von Frey aesthesiometer (Ugo Basile, Italia), plasser touch-stimulator enhet med filament rett under midten plantar overflaten av hindpaw, unngår metall mesh, og trykk på start knappen. Dette løfter filament til mekanisk stimulere plantar overflaten av hindpaw med en økende kraft.

Manuelle von Frey hår er en serie av økende diameter filamenter som er kalibrert for å indusere en bestemt kraft når påføres huden. De kan brukes som et alternativ til en elektronisk dynamisk plantar von Frey aesthesiometer for måling av labben tilbaketrekning terskel, som tidligere beskrevet ^fire. Det finnes også flere alternative produsenter av elektroniske von Frey aesthesiometers (f.eks IITC, USA og Somedic, Sverige).

3. Ta opp mekanisk tilbaketrekning terskelen fra både skadde og friske hindpaws, i en motvektstruck rekkefølge. Denne enheten gjelder press på labben og ved uttak reaksjon systemet automatisk registrerer og viser den maksimale kraften (i gram). Dersom en tvetydig reaksjon skjer (dvs. i tilfelle av bevegelse og eller grooming), gjenta den stimulans og registrere terskelen igjen. Licking eller risting av hindpaw etter stimulering er et tegn på atferd forbundet med smerte.
4. Gjenta mekanisk stimulering 3 ganger med et intervall på ca 5 min mellom stimuli, noterer terskler, og deretter beregne gjennomsnittet av labb tilbaketrekning terskler.

4. Termisk Tilbaketrekking Latency

Den infrarøde (IR) varmeintensiteten av plantar test instrument skal justeres før du starter eksperimentet. I vårt laboratorium, justerer vi IR intensitet for å gi en gjennomsnittlig pote tilbaketrekking ventetid på ca 10 sekunder i naive rotter, og vi setter cut-off ventetid på 20 sekunder for å unngå vev demningenalder i tilfelle svikt for å fjerne en pote.

1. På dagen for testing, for å plassere rotter i glasset floored testing bur 15-30 minutter før måling latency, slik at buret leting og pleie aktiviteter å opphøre og rotter blir avslappet og i ro.
2. Ved hjelp av en termisk plantar analgesi instrument (Ugo Basile, Italia), posisjon den infrarøde kilden direkte under mid-plantar overflate hindpaw, og trykk på start knappen. Dette utsetter plantar overflaten av hindpaw til en stråle av strålevarme gjennom et gjennomsiktig glass overflate. Det finnes også alternative produsenter av termisk plantar analgesi instrumenter (f.eks IITC, USA og Stoelting, USA).
3. Noter uttak latency fra både skadde og friske hindpaws, i en motvektstruck rekkefølge. Denne enheten registrerer automatisk tiden tatt (i sekunder) fra utbruddet av den termiske stimulans til tilbaketrekking av labb fra varmekilden. Dersom en tvetydig reaksjon skjer (dvs. i tilfellet ambulasjon eller grooming), gjenta den stimulans og registrere ventetid igjen. Licking eller risting av hindpaw etter stimulering er et tegn på atferd forbundet med smerte.
4. Gjenta varmen stimulering minst 3 ganger med et intervall på ca 5 min mellom stimuli, registrere ventetider, og deretter beregne gjennomsnittet av labb tilbaketrekning ventetider.

4. Representative Resultater

Et eksempel på mekanisk tilbaketrekning terskel og termisk tilbaketrekking ventetid i ipsilaterale (skadet) og kontralateral (friske) labber av Wistar rotter er vist før (baseline) og 2-12 dager etter CCI i figur 3A, og Figur 3B. Fra disse tallene kan det ses at CCI fører til en betydelig reduksjon i både mekaniske tilbaketrekning terskler og termiske tilbaketrekning ventetider i ipsilaterale hindpaw, indikerer tilstedeværelse av mekanisk og termisk smerte overfølsomhet, begge funksjonene i kroniske nevropatiske smerter .

Figur 1. En skjematisk illustrerer plasseringen av ligaturer i CCI-modellen. Denne dyremodell av nevropatisk smerte innebærer plassering av fire løse kromsyre-gut ligaturer på isjiasnerven, midt på låret nivå. Det resulterer i skader bare en del av afferenter går til foten og påfølgende smerter overfølsomhet av hindpaw.

Figur 2. Diagram av hindpaw areal brukt til smerte testing. Midten av plantar overflaten bare posterior til footpads, som indikert av den røde prikkete sirkel, brukes til smerte testing. Dette området er innerverte meste av terminal grener av hoftenervene. Hælen og footpads bør unngås på grunn av differensial hud følsomhet.

3.jpg "/>
Figur 3. Pain overfølsomhet etter kronisk innsnevring av isjiasnerven i rotter. Etter CCI, er det en betydelig reduksjon i labben uttak terskelen til mekaniske stimuli (A) og labb tilbaketrekning ventetid til termiske stimuli (B) i den skadelidte (ipsilaterale) hindpaw sammenlignet med friske (kontralaterale) hindpaw (p <0,01 gjentatte tiltak 2 -way ANOVA). Data viser gjennomsnitt ± SEM, n = 7 Wistar rotter.

CCI er et mye brukt perifer nerveskade modell av kroniske nevropatiske smerter. Det er relativt enkelt å utføre, og produserer robust og stabil smerte overfølsomhet i minst en måned etter skade. Etter CCI, rotter har unormal holdning av de skadde hindpaw (tær holdt sammen og plantar-bøyd og labben øyelokkene snur seg utover), samt gjentatt risting, vokter og slikking av den skadde hindpaw antyder tilstedeværelsen av spontan smerte ^9. I tillegg til sensorisk dysfunksjon, har flere etterforskere vist at CCI fremkaller atferdsvansker, for eksempel forstyrret sosial samhandling, søvnforstyrrelser, depresjon-lignende og angst-lignende atferd ^10-13, men dette er i kontrast til den manglende finne slike atferdsvansker av andre ^14,15. CCI er derfor vanlig å undersøke både patofysiologien, og potensielle terapeutiske agenter for behandling av nevropatiske smerter.

Vi descrIbe ensidig innsnevring av venstre hoftenervene, men det bør bemerkes at mange forskere har utført CCI på høyre hoftenervene, med lignende smerter og atferdsmessige utfall. Noen etterforskere kan finne det lettere å utføre kirurgi på en bestemt side på grunn av handedness har mens andre skiftet side i løpet av eksperimenter for å utelukke eventuelle skjevheter. Det er bemerkelsesverdig at flere varianter til den opprinnelige prosedyren er rapportert inkludert med kun to ligaturer rundt nerve ^16,17 og bruke sutur materiale annet enn kromsyre gut som vanlig gut og polyglactin (vicryl) ^18,19 i rotter. I tillegg har CCI modellen også blitt modifisert for bruk i mus, der prosedyren er identisk, bortsett fra bruk av 2-3 ligaturer med ulike suturmaterialer inkludert kromsyre gut, nylon, og prolene ^15,20,21.

En begrensning av denne modellen er graden av variasjon blant rottene utsatt for CCI, grunnet variability i tetthet av restriksjonar produsert ved å binde knop med sting. Dette kan delvis overvinnes ved å ha en erfaren forsker som utfører operasjonen på en konsistent måte. Videre kan den type sutur materiale som brukes for ligating nerve også bidra til variasjon, og det antas at kjemikalier fra kromsyre gut megle noen av de atferdsmessige og nevrokjemiske effekter observert i denne modellen ^19,22. Man bør være spesielt hensyn til valg av rotte kjønn (menn kontra kvinner) ^23, alder (ung versus gammel) ^{24,25, 26} kosthold og belastning ^27, noe som i betydelig grad kan påvirke utviklingen av smerte overfølsomhet etter CCI.

Smerter overfølsomhet testing, bruk en elektronisk von Frey aesthesiometer eller manuelle von Frey hår for mekanisk tilbaketrekking terskel og en plantar analgesi (Hargreaves) meter for termisk tilbaketrekking ventetid, er godt etablert og reavgiftspliktige kvantitative målinger av smerte overfølsomhet i små dyr. Deres bruk, i kombinasjon med modeller av nevropatisk smerte, er utbredt og gir mulighet for direkte sammenligninger av pote følsomhet for mekaniske og termiske stimuli på tvers av ulike behandlingstilbud, og mellom ulike stammer av rotter. Det bør bemerkes at andre atferdsmessige analyser, slik som PIN-prikktest og kaldt allodyni, brukes også til testing av CCI-indusert smerte overfølsomhet ^8.

Mens bruken av refleksive tilbaketrekning fra mekaniske eller termiske stimuli er den viktigste mål på nevropatisk smerte i denne modellen og andre, har det nylig blitt kritisert for sin dårlig korrelasjon med menneskelige symptomer og involvering av betydelig eksperimentator skjevhet ^28. Derfor ville bruk av ekstra paradigmer som operante tiltak av smerte ²⁹ og spontant slippes atferd ³⁰ være gunstig.

Likevel desPite disse begrensningene, den CCI modellen og labb uttak tester for måling smerte overfølsomhet er avgjørende for å forstå mekanismene for nevropatisk smerte og identifisere nye smertestillende mål. I vårt laboratorium, vi rutinemessig utfører CCI og måle mekaniske labb tilbaketrekning terskler og termiske labb tilbaketrekning ventetider, for å forstå hvordan nevroimmunologisk interaksjoner bidra til nevropatisk smerte ^31, og vurdere potensialet for modulerende immunsystemet til å redusere smerte overfølsomhet.