Kronisk Sammandragning av ischiasnerven och Smärta Överkänslighet Testning i råttor

1. Ischiasnerv kronisk konstriktionsskada

Aseptiska tekniker som bör användas för den kirurgiska proceduren. Desinficera den kirurgiska arbetsytan med 70% etanol och förbereda i förväg sterila instrument (t.ex., fina saxar, pincetter och upprullningsdon), gasväv, klammer-och kompresser genom autoklavering. För flera operationer, rengöra och resterilise instrument med 70% etanol eller en torr pärla sterilisator mellan råttor. En kirurgisk mask, hår motorhuv och sterila handskar bör användas.

För sammandragning av nerven, förbereda suturen kromsyra tarmen genom att skära den i små bitar ca 3 cm längd nedsänkta i steril saltlösning, för att förhindra torkning. För att stänga såret, använda kommersiellt tillgängliga sterila siden suturer.

1. Bedöva råttan i en induktionskammare med 5% isofluran i O _2, sedan leverera 2% isofluran i O ₂ via en skräddarsydd ansiktsmask, och övervaka anestesi djuret under förfarandet. Vanliga alternativa anestetika inandning halotan eller intraperitoneal natriumpentobarbital. Ketamin, som en N-metyl-D-aspartat (NMDA)-receptor-antagonist, bör undvikas eftersom dessa receptorer är viktiga vid utvecklingen av neuropatisk smärta.
2. Raka vänster bakben hos råtta. Sedan placerar djuret på en termo-reglerad värmematta vid 37 ° C och tillämpa salva smörjande ögondroppar för ögonen.
3. Sterilisera den rakade området med tre alternerande tillämpningar av 70% isopropylalkohol och jodlösning.
4. Med råttan låg på bröstet / bröstkorg, höja vänstra bakben och håll på plats med femor vid 90 ° mot ryggraden med maskeringstejp på foten.
5. Göra ett snitt i huden parallellt, men 3-4 mm under femor, och fri huden från muskel som omger snittet genom att skära genom den sammanbindande vävnaden.
6. Med trubbiga saxar, skär genom bindväven mellan gluteus superficialis och bicepsfemoris muskler.
7. Använd en upprullare för att vidga klyftan mellan de två musklerna, vilket möjliggör tydlig visualisering av ischiasnerven.
8. Med böjda trubbig spets tång och mikroföretag saxar, varsamt utan cirka 10 mm av ischiasnerven (proximalt om sciatic trifurcation) från den omgivande bindväven.
9. Under mikroskop och en bra ljuskälla, knyta fyra ligaturer (krom tarmen 4,0, Ethicon, USA) med en dubbel knut, 1 mm från varandra, proximalt om trifurcation av ischiasnerven. För varje ligatur, börja med en enda lös slinga, sedan ta tag i båda ändarna nära slingan och dra åt tills slingan knappt tätt och ligaturen inte glida längs nerven. För att hålla loopen i sitt rätta läge, placera en andra slinga ovanpå den första för att fullborda knut. Slutligen skärs de lösa ändarna av ligaturen till omkring 1 mm. Förträngning av nerven bör vara minimal, och omedelbart avbrytas om en kort rycka observeras att förhindra arrestera av the epineural blodflödet. Under åtdragning av ligaturer leder till axotomin och autotomy (självstympning), båda oönskade biverkningar som hindrar framgångsrika tester smärta överkänslighet.
10. Använda suturer Mersilk 5,0, Ethicon) för att stänga muskelskiktet och klamrar (Autoclip, 9 mm) för att fästa på huden. Använd sedan jodlösning (Riodine) för att sterilisera såret.
11. Observera råttan noga under narkos återhämtningsperioden, och låt den återhämta sig i en separat bur med platt papper sängkläder (ej standard djurhållning strö), för att förhindra det omedvetna djuret kvävas.
    Innan jag ger några postoperativ smärtlindring utredare bör överväga att detta kan störa med smärta överkänslighet testning. I själva verket finns det bevis för att lokal applicering av anestetikum, lidokain, vid tiden för skada kan förändra utvecklingen av neuropatisk smärta, och minska graden av hyperalgesi i de föregående veckorna ^7. För vidare diskussion om detta mAtter se översikt av Bennett et al ^8.

2. Mätningar av Pain beteenden

1. Daglig hantering av råttor i flera dagar innan experimentet rekommenderas för att vänja råttorna till sin handler, minska stress och risken att bita.
2. Före beteendetestning, råttor måste vana vid testproceduren och djuret inneslutningen. Testmiljön bör hållas tyst och välkontrollerade, med konstant temperatur och luftfuktighet, och utförs vid samma tidpunkt på dagen varje test session.
3. Smärta överkänslighet testning bör göras flera gånger innan CCI (baslinje) och vid olika tidpunkter efter CCI, om så önskas.

3. Mekanisk återtagströskel

1. På dagen för testning, placera råttor i förhöjda nätet golv tester buren 15-30 minuter innan mätning återtagströsklarna, vilket gör att buren prospektering och Grooming aktiviteter för att upphöra och råttor för att bli avslappnad och stilla.
2. Med en dynamisk plantar von Frey aesthesiometer (Ugo Basile, Italien), placera touch-stimulatorn enhet med glödtråden direkt under mitten-plantar yta baktassen, undvika metallnät, och tryck på startknappen. Detta lyfter filamentet för att mekaniskt stimulera den plantara ytan av baktassen med en ökande kraft.

Manuella von Frey-hår är en serie av ökande diameter filament, vilka är kalibrerade att inducera en specifik kraft när den appliceras på huden. De kan användas som ett alternativ till en elektronisk dynamisk plantara von Frey-aesthesiometer för mätning av tassbortdragning tröskelvärde, såsom tidigare beskrivits ^4. Det finns också flera alternativa tillverkare av elektroniska von Frey aesthesiometers (t.ex. IITC, USA och Somedic, Sverige).

3. Anteckna mekaniska återtagströskeln från både skadade och oskadade hindpaWS, i en motviktstruckar ordning. Denna anordning applicerar tryck på tassen och vid återdragning reaktion systemet automatiskt registrerar och visar den maximala kraft som appliceras (i gram). Om ett tvetydigt svar uppträder (dvs. vid förflyttningar och grooming), upprepa stimulans och registrera tröskeln igen. Slickande eller skakning av baktassen efter stimulering är ett tecken på beteende i samband med smärta.
4. Upprepa mekanisk stimulering 3 gånger med ett intervall på ca 5 min mellan stimuli, registrera trösklar, och sedan beräkna medelvärdet av trösklar tassbortdragning.

4. Termisk bakadragningsfrekvensen

Den infraröda (IR) värmeintensiteten av den plantara testinstrumentet bör justeras före start av experimentet. I vårt laboratorium, justera vi IR-intensiteten för att ge en genomsnittlig latens tass tillbakadragande av cirka 10 sekunder i naiva råttor och vi sätter cut-off latens på 20 sekunder för att undvika vävnad dammenålder i händelse av underlåtenhet att ta bort en tass.

1. På dagen av tester, för att placera råttor i glaset golv testa buren 15-30 minuter innan du mäter latency, vilket gör att buren prospektering och trimning aktiviteter för att upphöra och råttor blir avslappnad och stilla.
2. Med hjälp av en termisk plantar analgesi instrument (Ugo Basile, Italien), placera infrarödkällan direkt under mitten-plantar yta baktassen, och tryck på startknappen. Detta exponerar den plantara ytan av baktassen för en stråle av strålningsvärme genom ett transparent glas yta. Det finns också alternativa tillverkare av termiska plantar analgesi instrument (t.ex. IITC, USA och Stoelting, USA).
3. Anteckna bakadragningsfrekvensen från både skadade och oskadade baktassar i en motviktstruck ordning. Denna anordning spelar automatiskt den tid det tar (i sekunder) från starten av termisk stimulus till tillbakadragande av tassen från värmekällan. Om en tvetydig respons uppträder (dvs. i fallet med ambulation eller grooming), upprepa stimulans och registrera latens igen. Slickande eller skakning av baktassen efter stimulering är ett tecken på beteende i samband med smärta.
4. Upprepa värmen stimuleringen minst 3 gånger med ett intervall på ca 5 min mellan stimuli, registrera latenser, och sedan beräkna medelvärdet av latenser tassbortdragning.

4. Representativa resultat

Ett exempel på mekanisk återtagströskel och termisk tillbakadragande latency i ipsilaterala (skadade) och kontralaterala (oskadade) tassar Wistar råtta visas före (baslinje) och 2-12 dagar efter CCI i figur 3A och 3B figur. Av dessa siffror kan man se att CCI orsakar en betydande minskning av både mekaniska återtagströsklarna och termiska latenser indragning av ipsilaterala baktassen, vilket indikerar närvaro av mekanisk och termisk smärta överkänslighet, båda funktionerna av kronisk neuropatisk smärta .

Figur 1. En schematisk och illustrerar positioneringen av ligaturerna i CCI-modellen. Denna djurmodell för neuropatisk smärta involverar placering av fyra lösa kromsyra-gut ligaturer på ischiasnerven, på mitten av låret nivå. Det resulterar i skadade endast en del av afferenter går till foten och efterföljande smärta överkänslighet av baktassen.

Figur 2. Diagram av baktassen yta som används för testning av smärtan. Mitten av fotsulan precis bakom trampdynorna, såsom indikeras av den röda streckade cirkeln, används för testning av smärtan. Detta område är innerveras mestadels av terminal grenar av ischiasnerven. Hälen och trampdynorna ska undvikas på grund av differentiell huden.

3.jpg "/>
Figur 3. Pain överkänslighet efter kronisk förträngning av ischiasnerven hos råttor. Efter CCI, finns det en signifikant reduktion i tassbortdragning tröskelvärde för mekanisk påverkan (A) och tillbakadragande av tassen latens för termiska stimuli (B) i den skadade (ipsilateral) baktass jämfört med oskadade (kontralaterala) baktass (P <0,01 upprepade mätningar 2 -vägs ANOVA). Data visar medelvärde ± SEM, n = 7 Wistar-råttor.

CCI är en allmänt använd perifer nervskada modell av kronisk neuropatisk smärta. Det är relativt enkelt att utföra, och producerar robust och stabil smärta överkänslighet i minst en månad efter skada. Efter CCI, råttor uppvisar onormal hållning av den skadade baktassen (tår hålls samman och plantar-böjda och tass vrängs), samt upprepade skakningar, bevakning och slickande av den skadade baktassen tyder på förekomsten av spontan smärta ^9. Förutom sensorisk dysfunktion, har flera forskare visat att CCI väcker beteende funktionshinder, t.ex. störda sociala interaktioner, sömnstörningar, depression-liknande och ångest-liknande beteenden ^10-13, men detta är i motsats till underlåtenheten att hitta sådana beteenden funktionshinder av andra ^14,15. CCI därför vanligtvis för att undersöka både patofysiologin och potentiella terapeutiska medel för behandling av neuropatisk smärta.

Vi descrIbe ensidig sammandragning av den vänstra ischiasnerven, men det bör noteras att många experimentatorerna har utförts CCI på höger ischiasnerven, med liknande smärta och beteendemässiga effekter. Vissa forskare kan finna det lättare att utföra kirurgi på ett specifikt sida på grund av godtycke, medan andra bytte sida i experiment för att utesluta någon bias. Det är anmärkningsvärt att flera ändringar av det ursprungliga förfarandet har rapporterats med hjälp endast 2 ligaturer runt nerven ^16,17 och använda sutur material än krom tarmen som vanligt tarmen och polyglaktin (Vicryl) ^18,19 hos råttor. Dessutom har CCI-modellen också ändrats för att användas i möss, där förfarandet är identisk, förutom användningen av 2-3 ligaturer med olika suturmaterial, inklusive krom tarmen, nylon och Prolene ^15,20,21.

En begränsning hos denna modell är graden av variation bland råttor som utsatts för CCI, på grund av variabiliTy i täthet av förträngningar som produceras genom att knyta knutar med suturer. Detta kan delvis övervinnas genom att ha en erfaren forskare som utför operationen på ett konsekvent sätt. Vidare kan den typ av suturmaterial användes för ligering av nerven bidrar också till variabilitet, och det förmodas att kemikalierna från kromsyra tarmen mediera vissa av de beteendemässiga och neurokemiska effekter som observerats i denna modell ^19,22. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt valet av råttans kön (män kontra kvinnor) ^23, ålder (unga jämfört med gamla) ^24,25, diet ²⁶ och stam ^27, som avsevärt kan påverka utvecklingen av smärta överkänslighet efter CCI.

Smärta överkänslighet tester med ett elektroniskt von Frey aesthesiometer eller manuella von Frey hårstrån för mekanisk återtagströskel och plantar analgesi (Hargreaves) meter för termisk tillbakadragande latency, är väl etablerade och äransvariga kvantitativa mått av smärta överkänslighet i små djur. Deras användning i kombination med modeller för neuropatisk smärta, är omfattande och möjliggöra direkta jämförelser av tassen känslighet för mekaniska och termiska stimuli i olika behandlingsalternativ, och mellan olika stammar av råttor. Det bör noteras att andra beteendemässiga analyser, såsom den nålstick testet och kall allodyni, även används för att testa CCI-inducerad smärta överkänslighet ^8.

Medan användningen av reflexiva tillbakadragande från mekaniska eller termiska stimuli är den viktigaste måttet på neuropatisk smärta i denna modell och andra har det nyligen kritiserats för sitt dåliga korrelation med mänskliga symtom och medverkan av väsentlig försöksledaren partiskhet ^28. Därför skulle användningen av ytterligare paradigm som operanta åtgärder av smärta ²⁹ och spontant utsända beteenden ³⁰ vara fördelaktigt.

Icke desto mindre desPite dessa begränsningar, CCI modellen och tassen testerna återtag för mätning smärta överkänslighet är avgörande för att förstå de mekanismer som neuropatisk smärta och identifiera nya smärtstillande mål. I vårt laboratorium utför vi rutinmässigt CCI och mäta mekaniska trösklar tassbortdragning och termiska tass latenser tillbakadragande, i syfte att förstå hur neuro-immuna interaktioner bidrar till neuropatisk smärta ³¹ och bedöma potentialen för att modulera immunsystemet för att minska smärta överkänslighet.