La costrizione cronica del nervo sciatico e Ipersensibilità Testing Pain in Rats

1. Costrizione nervo sciatico cronica

Tecniche asettiche deve essere utilizzato per la procedura chirurgica. Disinfettare la superficie chirurgica di lavoro con il 70% di etanolo e preparare in anticipo gli strumenti sterili (ad esempio, forbici, pinze sottili e riavvolgitore), garze, graffette e tamponi in autoclave. Per interventi chirurgici multipli, pulire e strumenti risterilizzare con il 70% di etanolo o uno sterilizzatore a secco perla tra ratti. Una maschera chirurgica, cofano capelli e guanti sterili devono essere indossati.

Per costrizione del nervo, preparare la sutura intestinale cromico tagliandolo in piccoli pezzi di circa 3 cm di lunghezza immersi in soluzione fisiologica sterile, per evitare l'essiccazione. Per chiudere la ferita, utilizzare punti di sutura in seta disponibili in commercio sterili.

1. Anestetizzare il topo in una camera di induzione con il 5% isoflurano in O _2, quindi consegnare il 2% isoflurano in O ₂ tramite una maschera su misura, e monitorare l'animale anestetizzato durante la procedura. Comuni anestetici alternativi vengono inalate alotano o intraperitoneale di sodio pentobarbital. Ketamina, come N-metil-D-aspartato (NMDA) antagonista del recettore, deve essere evitata poiché questi recettori sono importanti per lo sviluppo del dolore neuropatico.
2. Shave la gamba sinistra posteriore del ratto. Quindi, posizionare l'animale su un termoregolato stuoia riscaldamento a 37 ° C e applicare unguento oftalmico lubrificante per gli occhi.
3. Sterilizzare l'area rasata con tre applicazioni alternative del 70% di alcol isopropilico e una soluzione di iodio.
4. Con il ratto disteso sul suo petto / torace, elevare la zampa posteriore sinistra e tenerla in posizione con il femor a 90 ° rispetto alla colonna vertebrale con del nastro adesivo sul piede.
5. Praticare un'incisione in parallelo pelle, ma 3-4 mm al di sotto del femor, e liberare la pelle dal muscolo che circonda l'incisione tagliando attraverso il tessuto connettivo.
6. Usando le forbici, tagliare il tessuto connettivo tra i glutei e superficiale i bicipitifemorale muscoli.
7. Utilizzare un divaricatore per allargare il divario tra i due muscoli, consentendo la visualizzazione chiara del nervo sciatico.
8. Utilizzo di curve a punta smussa forcipe e micro-forbici, delicatamente libera di circa 10 mm del nervo sciatico (prossimale alla triforcazione sciatico) dal tessuto connettivo circostante.
9. Sotto il microscopio e una sorgente di luce buona, legare quattro legature (gut cromico 4.0, Ethicon, USA) con un doppio nodo, 1 mm l'una dall'altra, prossimale alla triforcazione del nervo sciatico. Per ogni legatura, inizia con un singolo ciclo sciolto, quindi afferrare le due estremità in prossimità del ciclo e stringere fino a quando il ciclo è appena avvolgente e la legatura non scivola lungo il nervo. Per mantenere l'anello in posizione corretta, collocare un secondo ciclo sopra il primo a completare il nodo. Infine, tagliare le estremità della legatura a circa 1 millimetro. La costrizione del nervo dovrebbe essere minimo, e immediatamente interrotta se un tic breve si osserva, per evitare l'arresto dei the flusso sanguigno epineurale. Nel corso stringendo le legature porta a assotomia e autotomia (automutilazione), sia effetti collaterali indesiderati che precludono il successo test ipersensibilità al dolore.
10. Utilizzare suture (Mersilk 5,0, Ethicon) per chiudere lo strato muscolare e graffette (Autoclip, 9 mm) per fissare la pelle. Successivamente, utilizzare la soluzione di iodio (Riodine) per sterilizzare la ferita.
11. Osservare il ratto da vicino durante il periodo di recupero anestesia, e permettono di recuperare in una gabbia separata con letto la carta in orizzontale (non lo standard letto zootecnia), al fine di evitare l'animale incosciente soffocamento.
    Prima di dare qualsiasi post-operatorie investigatori analgesia dovrebbe prendere in considerazione il fatto che questo può interferire con i test dolore ipersensibilità. Infatti, è evidente che l'applicazione locale di anestetico, lidocaina, al momento della lesione può alterare lo sviluppo di dolore neuropatico, e diminuire il grado di iperalgesia nelle settimane precedenti ^7. Per un'ulteriore discussione su questo mAttersee vedi recensione di Bennett et al ^8.

2. Misure di comportamenti Pain

1. Gestione quotidiana dei ratti per diversi giorni prima di iniziare l'esperimento si raccomanda, al fine di abituare i topi al loro gestore, ridurre lo stress e il rischio di mordere.
2. Prima di test comportamentali, i ratti devono essere abituati alla procedura di collaudo e la custodia degli animali. L'ambiente di test deve essere mantenuta tranquilla e ben controllata, con temperatura costante e livelli di umidità, e realizzato in un momento simile di giorno ogni sessione di test.
3. Ipersensibilità prova dolore dovrebbe essere eseguita diverse volte prima CCI (baseline) e in diversi momenti dopo la CCI, come desiderato.

3. Ritiro soglia meccanica

1. Il giorno di test, i topi posto nella gabbia elevata test maglia piani 15-30 minuti prima di misurare le soglie di prelievo, consentendo l'esplorazione e la gabbia raschiettogrammazione delle attività di cessare e ratti a diventare rilassato e fermo.
2. Utilizzando una dinamica plantare von Frey aesthesiometer (Ugo Basile, Italia), la posizione del touch-stimolatore unità con il filamento direttamente sotto la metà della superficie plantare della zampa posteriore, evitando la rete metallica, e premere il tasto di avvio. Questo solleva il filamento di stimolare meccanicamente la superficie plantare della zampa posteriore con una forza crescente.

Manuali peli von Frey sono una serie di filamenti di diametro crescente che sono calibrati per indurre una forza specifica quando applicato alla pelle. Possono essere utilizzati come alternativa ad un sistema elettronico dinamica plantare aesthesiometer von Frey per la misurazione della soglia di ritiro zampa, come precedentemente descritto ^4. Ci sono anche diversi produttori di elettronica alternative di von Frey aesthesiometers (ad esempio IITC, Stati Uniti e Somedic, Svezia).

3. Registrare la soglia meccanica ritiro dal hindpa sia danneggiato e illesoWS, in un ordine controbilanciato. Questo dispositivo applica una pressione alla zampa e sulla reazione di astinenza il sistema registra e visualizza automaticamente la massima forza applicata (in grammi). Se una risposta ambigua verifica (ossia in caso di deambulazione o di grooming), ripetere lo stimolo e registrare nuovamente la soglia. Leccare o scuotimento della zampa posteriore a seguito di stimolazione è un segno di comportamento associato al dolore.
4. Ripetere la stimolazione meccanica 3 volte con un intervallo di circa 5 min tra gli stimoli, registrare le soglie, e quindi calcolare la media delle soglie di ritiro zampa.

4. Ritiro latenza termica

La (IR) l'intensità di calore a raggi infrarossi dello strumento di prova plantare deve essere regolata prima di iniziare l'esperimento. Nel nostro laboratorio, abbiamo regolare l'intensità IR per dare una latenza media di ritiro zampa di circa 10 secondi nei ratti naive, e abbiamo impostato il cut-off di latenza a 20 secondi per non danneggiare i tessutietà in caso di mancata rimuovere una zampa.

1. Il giorno di test, i topi posto nella gabbia di vetro, pavimenti in testing 15-30 minuti prima di misurare la latenza, permettendo l'esplorazione gabbia e governare le attività di cessare e nel ratto a diventare rilassato e fermo.
2. Utilizzando uno strumento di analgesia termica plantare (Ugo Basile, Italia), la posizione della sorgente di infrarosso direttamente sotto la metà della superficie plantare della zampa posteriore, e premere il tasto di avvio. Questo espone la superficie plantare della zampa posteriore per un fascio di calore radiante attraverso una superficie di vetro trasparente. Ci sono anche i produttori alternativi di strumenti termici analgesia plantare (ad esempio IITC, Stati Uniti e Stoelting, USA).
3. Registrare la latenza ritiro dal hindpaws sia feriti e illeso, in un ordine controbilanciato. Questo dispositivo registra automaticamente il tempo (in secondi) dall'inizio della dello stimolo termico al ritiro della zampa dalla fonte di calore. Se una risposta ambigua verifica (ossia in caso di ambulazione o governare), ripetere lo stimolo e registrare la latenza di nuovo. Leccare o scuotimento della zampa posteriore a seguito di stimolazione è un segno di comportamento associato al dolore.
4. Ripetere la stimolazione di calore almeno 3 volte con un intervallo di circa 5 min tra gli stimoli, registrare le latenze, e quindi calcolare la media delle latenze di ritiro zampa.

4. Risultati rappresentativi

Un esempio di soglia di ritiro di meccanica e la latenza di ritiro termale nelle zampe omolaterali (infortunato) e controlaterale (illeso) di ratti Wistar viene mostrata prima (baseline) e 2-12 giorni dopo la CCI nella Figura 3A, 3B e Figura. Da questi dati si può notare che CCI causa una riduzione significativa sia soglie di ritiro meccaniche e latenze ritiro termico della zampa posteriore omolaterale, indicando la presenza di ipersensibilità dolore meccanico e termico, entrambe le caratteristiche del dolore neuropatico cronico .

Figura 1. Uno schema che illustra il posizionamento delle legature nel modello CCI. Questo modello animale di dolore neuropatico prevede il posizionamento di quattro sciolti cromico-intestinale legature sul nervo sciatico, a metà coscia livello. Risulta in ferendo solo una parte degli afferenti vanno a l'ipersensibilità dolore al piede e successiva zampa posteriore.

Figura 2. Diagramma della superficie zampa posteriore utilizzato per il test del dolore. La metà superficie plantare appena posteriormente i piedini, come indicato dal cerchio rosso tratteggiata, viene utilizzato per il test del dolore. Questa zona è innervato principalmente dai rami terminali del nervo sciatico. Il tallone e cuscinetti plantari deve essere evitata a causa della sensibilità differenziale pelle.

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Figura 3. Ipersensibilità al dolore a seguito di costrizione cronica del nervo sciatico nel ratto. Dopo CCI, vi è una significativa riduzione della soglia zampa di ritiro agli stimoli meccanici (A) e il ritiro latenza zampa agli stimoli termici (B) nel lesa (omolaterali) zampa posteriore rispetto al indenne (controlaterale) zampa posteriore (p <0.01 misure ripetute 2 -way ANOVA). I dati mostrano media ± SEM, n = 7 ratti Wistar.

CCI è un diffuso modello di lesione del nervo periferico del dolore cronico neuropatico. E 'relativamente semplice da eseguire, e produce ipersensibilità al dolore robusto e stabile per almeno un mese dopo l'infortunio. A seguito di CCI, i ratti mostrano postura anomala della zampa posteriore feriti (dita tenute insieme e plantare-flesso e della zampa rovesciato), così come agitando ripetutamente, guardia e di leccare il ferito zampa posteriore suggerendo la presenza di dolore spontaneo ^9. Oltre alla disfunzione sensoriale, diversi ricercatori hanno dimostrato che evoca CCI disabilità comportamentali, come ad esempio interrotte le interazioni sociali, disturbi del sonno, depressione, come ansia e comportamenti simili a ^10-13, ma questo è in contrasto con l'impossibilità di trovare tali disabilità comportamentali da altri ^14,15. CCI viene comunemente utilizzata per studiare sia la fisiopatologia, e potenziali agenti terapeutici per il trattamento del dolore neuropatico.

Noi describe costrizione unilaterale del nervo sciatico a sinistra, tuttavia va notato che molti sperimentatori hanno eseguito CCI del nervo sciatico destro, con dolore simile e gli esiti comportamentali. Alcuni ricercatori possono trovare più facile eseguire un intervento chirurgico su un lato specifico a causa di prepotenza, mentre altri hanno cambiato le parti entro esperimenti per escludere qualsiasi bias. È interessante notare che diverse varianti alla procedura originale sono stati riportati anche utilizzando solo due legature intorno al nervo ^16,17 e l'utilizzo di materiale di sutura diverso gut cromico come budello e poliglattina (Vicryl) ^18,19 nei ratti. Inoltre, il modello CCI è stato modificato per l'impiego nei topi, dove la procedura è identica, salvo l'impiego di 2-3 legature con materiale di sutura diversi tra intestino cromico, nylon, e prolene ^15,20,21.

Una limitazione di questo modello è il grado di variazione tra i ratti sottoposti a CCI, a causa VariabiliTy nella tenuta delle costrizioni prodotte da nodi marinai con le suture. Questo può essere in parte superati avendo un ricercatore esperto di eseguire l'intervento in modo coerente. Inoltre, il tipo di materiale di sutura usato per legare il nervo può anche contribuire alla variabilità, e si ritiene che le sostanze chimiche dall'intestino cromico mediare alcuni degli effetti comportamentali e neurochimici osservati in questo modello ^19,22. Particolare attenzione dovrebbe essere prestata alla scelta del sesso ratto (maschi contro femmine) ^23, l'età (giovane contro il vecchio) ^24,25, la dieta ²⁶ e ceppo ^27, che possono influenzare significativamente lo sviluppo di ipersensibilità al dolore a seguito di CCI.

Ipersensibilità test Pain, utilizzando un sistema elettronico von Frey aesthesiometer o manuali peli von Frey per la soglia di ritiro di meccanica e di un plantare analgesia (Hargreaves) metro di latenza ritiro termico, sono ben consolidate e riresponsabili misure quantitative di ipersensibilità al dolore negli animali di piccole dimensioni. Il loro uso, in combinazione con modelli di dolore neuropatico, sono diffusi e consentire confronti diretti di zampa sensibilità agli stimoli meccanici e termici attraverso diverse opzioni di trattamento, e tra i diversi ceppi di topi. Va notato che altri saggi comportamentali, quali il test di puntura di spillo e allodinia freddo, sono utilizzati anche per testare CCI dolore indotto ipersensibilità ^8.

Mentre l'uso di recesso riflessiva da stimoli meccanici o termici è la misura principale del dolore neuropatico in questo modello e altri, è stato recentemente criticato per la sua scarsa correlazione con i sintomi umani e il coinvolgimento di bias sperimentatore notevole ^28. Pertanto, l'uso di paradigmi aggiuntive quali misure operante del dolore ²⁹ e comportamenti emessa spontaneamente ³⁰ sarebbe vantaggioso.

Tuttavia, despite queste limitazioni, il modello CCI e le prove di ritiro zampa per ipersensibilità al dolore di misura sono fondamentali per la comprensione dei meccanismi del dolore neuropatico e identificare nuovi obiettivi di analgesici. Nel nostro laboratorio, abbiamo regolarmente eseguire CCI e misurare le soglie di ritiro zampa meccaniche e termiche latenze ritiro zampa, al fine di capire come neuro-immunitario interazioni contribuiscono al dolore neuropatico ^31, e valutare il potenziale di modulare il sistema immunitario per ridurre ipersensibilità al dolore.