Brug af omvendt genetik til at manipulere NSS Gene af Rift Valley Fever virus MP-12 Strain to Improve Vaccine sikkerhed og effekt

1. Inddrivelse af rekombinant MP-12 kodning NSS mutation (r) fra plasmidet DNA'er ²

1. Spred Baby hamster nyre (BHK) / T7-9 celler ^15, der stabilt udtrykker T7 RNA polymerase, i 6-cm retter i Minimum Essential Medium (MEM)-alpha (Invitrogen, Cat # 32561037) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS ), penicillin-streptomycin (Penicillin: 100 E / ml, Streptomycin: 100 mg / ml) (Invitrogen, Cat # 15140122), og 600 mg / ml af hygromycin B (Cellgro, Cat # 30-240-CR).
   * Effektiviteten af ​​virale inddrivelsen er højere i 6-cm retter end i 35-mm retter. BHK/T7-9 celler med lavt antal passager, der understøtter højere satser for tilbagebetaling. Alternativt andre BHK cellelinjer, stabilt udtrykke T7 RNA polymerase kunne bruges ^4,5,16,17.
2. Når cellerne har nået 70-80% confluency, erstatte den kultur supernatanten med frisk MEM-alpha indeholder 10% FBS og penicillin-streptomycin (ikke indeholdende hygromycin B).
   
   * Cellerne skal transfected inden for 1 time efter udskiftning af medium til at undgå tab af T7 RNA polymerase udtryk.
3. Til inddrivelse af RVFV, et sæt af plasmider kodning viral genomisk RNA for fuld-længde viral RNA udtryk, og et andet sæt kodning virale genet åbne læserammer for viral protein udtryk (figur 1 og 2) er påkrævet. Forbered en blanding af følgende plasmids2 (figur 2) i et 1,5 ml rør:
   1. pProT7-S (+) med mutation (er) i NSS genet (2 mg): Dette plasmid koder anti-viral-sense (positiv-sense) i fuld længde RVFV MP-12 S-segment flankeret af T7 projektlederen og hepatitis delta virus (HDV) ribozyme sekvens.
   2. pProT7-M (+) (2 mg): Dette plasmid koder anti-viral-sense (positiv-sense) i fuld længde RVFV MP-12 M-segmentet flankeret af T7 promotoren og HDV ribozyme sekvens.
   3. pProT7-L (+) (2 mg): Dette plasmid koder anti-viral-sense (positiv-sense) i fuld længde RVFV MP-12 L-segmentet flanked af T7 promotoren og HDV ribozyme sekvens.
   4. PT7-IRES-VN (2 mg): Dette plasmid koder RVFV MP-12 N åbne læseramme (ORF) neden for T7 promotor og en encephalomyocarditisvirus (EMCV) intern ribosom post websted (IRES).
   5. PT7-IRES-VL (1 mg): Dette plasmid koder RVFV MP-12 L ORF neden for T7 promotor og en EMCV IRES.
   6. pCAGGS-VG (1 mg): Dette plasmid koder RVFV MP-12 M ORF neden for kylling beta-aktin promotoren.
      * Med tilføjelsen af PT7-IRES-VN, PT7-IRES-VL og pCAGGS-VG er ikke afgørende for inddrivelse af MP-12, men det øger effektiviteten af ^rednings-2. Forfattere oplevet dårlig udtryk for GN / Gc ved hjælp PT7-IRES plasmid, sandsynligvis på grund af manglende utætte scanning af AUGs af ribosomer. Derfor har vi konstrueret pCAGGS-VG for Cap-afhængige GN / Gc udtryk.
      
      
4. Tilsæt 30 ml Transit-LT1 (Mirus, Cat # MIR2300) til 385 ml af Opti-MEM (Invitrogen, Cat # 31985070) i ​​en 1,5 ml rør og vortex kortvarigt.
5. Efter 5 min inkubation ved stuetemperatur, tilsættes langsomt Opti-MEM indeholder liposomer til plasmid blandingen fra trin 1,3 til, bland forsigtigt ved pipettering og inkuber i 15 min ved stuetemperatur.
6. Tilsæt blandingen af liposom og plasmider til dyrkningsmediet af BHK/T7-9 cellerne fra trin 1,2 dråbe for dråbe (Figur 3).
7. Inkubér transfekterede celler ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO ₂ for 24 timer, og erstatte den kultur supernatanten med frisk MEM-alpha indeholder 10% FBS og penicillin-streptomycin (ikke indeholdende hygromycin B).
8. Inkuber cellerne ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO ₂ for yderligere 4 dage (inkuber i 5 dage i alt), og indsamle kulturen supernatanter i en 15 ml rør.
   
   * Den cytopatisk effekt (CPE) observeret her afspejler ikke nødvendigvis et resultat af en vellykket viral nyttiggørelse, fordi transfektionfremkalder celledød, der synes tilsvarende CPE forårsaget af viral RNA replikation eller viral proteinsyntesen.
9. Centrifuger supernatanter ved 2.200 xg ved 4 ° C i 5 min.
   
   * Formålet med dette trin er at pille ned celleaffald fra viral lager. En aerosol-tæt centrifuge spand anbefales for øget sikkerhed.
10. Overfør supernatanter i skruelåg 5 ml cryotubes, og opbevar den passage 0 (P0) virus lager ved -80 ° C til videre brug.

2. Forstærkning af P0-virus

1. P0 prøver indeholder ofte utilstrækkelig viral titer for downstream-eksperimenter ^2. En forstærkning skridt i VeroE6 celler, som er en klon af afrikanske grønne abe nyre (Vero) celler mangler IFN-alpha/beta gener ^18,19, stiger viral titer på op til maksimalt niveau. Alternativt andre celler mangler type I-IFN reaktioner såsom Hec1B celler ²⁰ eller MEF celler fra IFNAR1-knockout mus ²¹ might blive anvendt til dette trin. Spred VeroE6 celler i 10-cm retter i Dulbecco ændrede Minimum Essential Medium (DMEM) (Invitrogen, Cat # 11965092) indeholdende 10% FBS, penicillin-streptomycin (Penicillin: 100 E / ml, Streptomycin: 100 mg / ml), og inkuber ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO _2, indtil de når 80% confluency.
   * Rekombinant MP-12 stammer kodning mutant NSS ofte undlader at replikere effektivt i type I-IFN-kompetente celler.
2. Bland 300 ml P0 prøver med 2,7 ml DMEM med 10% FBS og penicillin-streptomycin. Fjern kulturmediet fra VeroE6 cellerne fra trin 2.1 og erstatte med den fortyndede P0 prøve. Inkuber ved 37 ° C i 1 time i varmeskab med 5% CO _2.
3. Fjern podning og tilsæt 10 ml DMEM med 10% FBS og Penicillin-Streptomycin til hvert fad.
4. Inkuber ved 37 ° C i 3 til 4 dage før CPE af VeroE6 celler viser sig.
   * Forstyrrelse af éncellelag opstår under MP-12 infektion, while rekombinant MP-12 mangler NSS, såsom rMP12-C13type (C13type) (Figur 4), ikke forstyrre monolag, men en række af døde flydende celler forekommer 2 til 3 dage efter smitte.
5. Harvest supernatanten ved 3 til 4 dpi, som beskrevet i afsnit 1,9) og 1,10), og udpege de prøver som E6P1.

3. Titrering af rekombinant MP-12 ved plaque assay

1. Spred VeroE6 celler i 6-godt plader.
   * Endnu en analyse per prøve er mere pålidelig end en enkelt analyse.
2. Når VeroE6 celler er vokset til 80% confluency, forberede 10-fold serielle fortyndinger af virus prøver i DMEM med 10% FBS og Penicillin-Streptomycin op til 10-6 på følgende måde:
   
   • 10 μl af E6P1 prøve + 990 ml DMEM med 10% FBS og penicillin-streptomycin (10 ^-2 fortynding)
   • 100 μl af 10 ^-2 prøve + 900 ml DMEM med 10% FBS og penicillin-streptomycin (10 ^-3 fortynding)
   • 100μl af 10 ^-3 prøve + 900 ml DMEM med 10% FBS og penicillin-streptomycin (10 ^-4 fortynding)
   • 100 μl af 10 ^-4 prøve + 900 ml DMEM med 10% FBS og penicillin-streptomycin (05/10 fortynding)
3. Aspirer medium fra den 6-brønds plade fra trin 3.1 og tilsættes 400 μl af hver fortynding (fra trin 3.2) ind i brønde (Figur 3).
4. Inkuber ved 37 ° C i 1 time i varmeskab med 5% CO _2.
5. Under inkubation forberede to 15 ml rør til den agar-overlay som følger:
   Tube A (holder i 42 ° C vandbad): 7 ml 1,2% ædle agar (VWR, Cat # 101170-362) i vand
   Tube B (hold i 37 ° C vandbad): 7 ml Modified Eagle Medium (MEM 2x) (Invitrogen, Cat # 11935046) indeholdende 10% FBS, penicillin-streptomycin (Penicillin: 100 E / ml, Streptomycin: 100 mg / ml), og 10% Tryptose fosfat bouillon (MP biomedicals, Cat # 1682149).
6. Efter 1 time inkubation, fjern den viralepodning, og straks tilsættes 2 ml pr brønd i en 1:1 blanding af rør A og rør B (fra trin 3.5).
   * Vær omhyggelig med at tilføje overlay straks som udtørring af brønde forårsager død af ikke-inficerede celler.
7. Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 3 dage i en inkubator med 5% CO _2.
8. Forbered rør A og rør B igen som beskrevet i trin 3.5. Forbered også 500 μl 0,33% neutral rød opløsning (Sigma Aldrich, Cat # N2889-100ML) pr plade, som også holdes ved 37 ° C vandbad.
9. Bland rør A, rør B og 500 ml (endelig conc. 0,011%) af neutral rød opløsning og tilsættes 2 ml blanding pr godt.
   * Mængden af ​​neutral rød opløsning, som skal tilsættes afhænger af partiet af neutrale røde løsning, og den første optimering er påkrævet. Lang tids opbevaring på 0,33% neutral Rød opløsning årsager nedbør. I sådanne tilfælde kan udfældning skal helt opløst ved inkubation ved 55 ° C i 10 min efterfulgt af kraftig rystning. Brugen af ​​udfældet neutrale red løsning resulterer i svag farvning af celler, mens genopløses neutral røde løsning pletter celler godt.
10. Inkubér pladen i 16 timer (eller natten over) ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO _2.
11. Tæl antallet af plaques i brønden, som indeholder 10 til 100 plaques per brønd. Beregn antallet af plak danner enheder / ml. For eksempel, hvis vi kigger 28 plaques i brøndene podet med 10 ^-5 fortyndinger, 28 (# af plaques) x (1 ml/0.4 ml) x 10 ⁵ (fortynding) = 7,0 x 10 ⁶ plak danner enheder (PFU) / ml (figur 5).

4. Screening af NSS mutanter som mangler den type I-IFN undertrykkelse funktion

1. Spred C57/WT MEF celler (InvivoGen, Cat # MEF-c57wt), som indkode en udskilles embryonale alkalisk fosfatase (SEAP) genet inducerbare af NF-kB og IRF-3 / 7 (Figur 6), i 12-godt plader. Cellerne holdes i DMEM med 10% FBS, penicillin-streptomycin (Penicillin: 100 E / ml, Streptomycin: 100 mg / ml), Blasticidin S (3 mg / ml), og Zeocin (100 mg / ml).
2. Når cellerne bliver sub-sammenflydende (80%), celler er mock-smittet eller inficeret med MP-12 eller rekombinant MP-12 kodning NSS mutationer ved flerhed af infektion (MOI) af 3 eller 0,1 (se afsnit 2 og 3, mængden af hver inokulum bør være 300 μl). Ved 1 timer efter infektion, skal du fjerne podning, og der tilsættes 1 ml pr brønd DMEM med 10% FBS, penicillin-streptomycin (Penicillin: 100 E / ml, Streptomycin: 100 mg / ml) (Blasticidin og Zeocin tilføjes ikke på dette tid).
3. På 14 timer efter infektion, indsamle kultur supernatanter. Tilsæt 200 μl af kvanti-Blue (InvivoGen, Cat # rep-QB1) og 50 μl af hver prøve (i tre eksemplarer) til brønde på en 96-brønds plade. Seal og Inkubér pladen ved 37 ° C i 1 time
   * Begge MP-12 og rekombinant MP-12 mangler NSS klart fremprovokere vært translationelle undertrykkelse i IFN-alpha/beta kompetente celler, herunder 293 celler, MRC-5 celler og mus embryonic fibroblast (MEF) celler efter 14 timer efter infektion med høj moi. På den anden side, akkumuleres IFN-beta mRNA eller ISG56 mRNA rigeligt med 7 til 8 timer efter infektion i type I-IFN kompetente celler. Derfor valgte vi 14 timer efter infektion at indsamle de supernatanter at se ophobning af SEAP induceret af medfødte immunrespons.
4. Læs OD-værdierne ved 650 nm med en tallerken læser (Figur 7).
   * Resultaterne er i overensstemmelse med de data, der opnås ved Northern blotting hjælp af en RNA-probe er specifikke for mus ISG56 mRNA, der viser op-regulering af ISG56 mRNA i mangel af NSS udtryk (figur 8).
   * Det skal bemærkes, at SEAP aktivitet er bestemt af den overflod af proteiner, som kunne blive påvirket af værten oversættelse aktivitet. En relativ niveau SEAP måske ikke højt i forhold til det øgede niveau af mRNA, fordi SEAP ikke kan syntetiseres selv ved tilstedeværelse af SEAP mRNA, hvis cellulære oversættelse er suppressed. Northern blot er en mere enkel analyse og en mere nøjagtig måde at vurdere mængden af ​​mRNA fremkaldt af manglen på NSS funktioner i inficerede celler end SEAP reporter analysen. Men SEAP reporter systemet er hurtigere end Northern Blot og dermed nyttig til hurtig screening af NSS mutanter potentielt mangler vært transskription undertrykkelse funktion.
   
   

5. Repræsentative resultater:

Det omvendte genetik systemet konsekvent genereret levedygtige rekombinant MP-12 vira med titre højere end 1 x 10 ⁶ PFU / ml. C13type virus mangler NSS funktioner dannet store uklar plaques, mens MP-12 dannet tydelige plaques i forskellige størrelser ² (Figur 5). Mock-inficerede C57/WT MEF celler eller dem, der smittes med MP-12 har ikke øge SEAP i kultur supernatant sammenlignet med mock-inficerede celler, mens kultur supernatant af C57/WT MEF celler inficeret med C13type indeholdt en øgetniveau af SEAP med 14 timer efter infektion (HPI) (Figur 7). Disse resultater er i overensstemmelse med dem, der opnås ved Northern blotting hjælp af en RNA-probe er specifikke for mus ISG56 mRNA (Figur 8).

Figur 1. Genom struktur RVFV
RVFV har et treparts negative-sense eller ambisense RNA-genom ved navn S-, M-og L-segmentet. S-segment koder N og NSS gener i en ambisense måde. N mRNA syntetiseres fra viral-sense (negativ forstand) S-segmentet, mens NSS mRNA syntetiseres fra anti-viral-sense (positiv-sense) S-segmentet. M-segment koder en enkelt M mRNA og syntetiserer the78kD, NSM, GN eller Gc proteiner ved utætte scanning af flere AUGs på 5'region af M mRNA, efterfulgt af deres co-translationel kavalergang ^22,23. L-segment koder L protein. Både N og L proteiner er afgørende for viral transskription og replikation, mens GN og GC er den virale kuvert proteiner. NSS og NSM proteiner strukturmaessige proteiner, som ikke er indarbejdet i viruspartikler.

Figur 2.. Design af plasmid DNA til genopretning af rekombinante RVFV MP-12 stammen
Den cDNA kodning i fuld længde anti-viral-sense S-, M-eller L-segment cloneddownstream af T7 promotor og upstream af hepatitis delta virus (HDV) ribozyme sekvenser, der er udpeget som pProT7-S (+), pProT7-M (+) eller pProT7-L (+), henholdsvis ^2. T7 RNA polymerase udtrykt i BHK/T7-9 celler transcribes de RNA kodning fuld længde S-, M-eller L-segment med præcis genom 3 'ende. De åbne læseramme (ORF) af N eller L proteiner er klonet under encephalomyocarditisvirus (EMCV) intern ribosom post websted (IRES), der er udpeget som PT7-IRES-VN eller PT7-IRES-VL, henholdsvis at tillade ikke-reducerede T7 RNA afskrift at blive anerkendt af ribosomer i Cap-uafhænDent måde. M ORF er klonet under kylling b-actin fortaler for pCAGGS plasmid ^24, som er udpeget som pCAGGS-VG, at tillade syntese af 78kD, NSM, GN og Gc proteiner, som er genereret fra forskellige AUGs af utætte scanning ^23. Både N og L proteiner er nødvendige for at indlede transskription eller RNA replikation, mens PT7-IRES-vn og PT7-IRES-VL ikke er afgørende for inddrivelse af rekombinante MP-12 ^2, sandsynligvis på grund af den formodede utætte udtryk for Pol- II-drevet renteloft RNA afskrifter kodning N-ORF og L-ORF fra pProT7-S (+) og pProT7-L (+), hhv.

Figur 3. Inddrivelse af RVFV MP-12 fra plasmid DNA
Transfektion af BHK/T7-9 celler med pProT7-S (+), pProT7-M (+), pProT7-L (+), PT7-IRES-VN, PT7-IRES-VL og pCAGGS-VG plasmider (Fig.1 ) genererer smitsom rekombinant RVFV MP-12 stammen i kultur supernatantS. Supernatanten ved 5 dag efter transfektion er indsamlet, og inkuberet til frisk Vero E6 celler for viral forstærkning. Typisk, kan mere end 1 x 10 ⁶ PFU / ml af virus skal inddrives ved 3 til 4 dage efter infektion. De forstærkede virus (E6P1 virus) titreres ved hjælp af plaque assay med Vero E6 celler og bruges til fænotype analyser og immunogenicitet undersøgelser.

Figur 4. S-segment af MP-12 og rMP12-C13type
Sammenligningen af ​​MP-12 og rMP12-C13type (C13type) S-segmenter. Sammenlignet med NSS af MP-12 stammen, er NSS ORF af C13type afkortet med 69%, og er identisk med naturligt isolerede klon 13 stamme ^2,25.

Figur 5. Plaque assay for MP-12 (funktionel NSS) og C13type (ikke-funktionelle NSS)
Den monolayer af Vero E6 celler i en 6-brønds plade bruges til plaque assay. Efter 3 dages inkubation med 0,6% agar overlay, den anden agar overlay, der indeholder neutral røde løsning er tilføjet. Så er plaques tælles på dag 4 efter infektion. MP-12 former tydelige plaques af varierede størrelser, mens C13type former store uklare plaques (eller foci). Den godt 10 til 100 plaques bør anvendes til optælling.

Figur 6. Aktivering vej af udskilles alkalisk fosfatase (SEAP) reporter genet i C57/WT MEF celler
Interferon-beta promoter omfatter bindende sekvenser af AP-1, NF-kB og IRF-3. RVFV replikering aktiverer AP-1, NF-kB og IRF-3 ^7,11. Men NSS hæmme frigivelsen af repressor kompleks fra den IFN-beta promoter selv efter binding af disse transskriptionsfaktorer, og dermed undertrykke syntesen af IFN-beta mRNA ^26. Desuden NSS sequesters TFIIH P44 subunits8 og enLSO fremmer nedbrydning af TFIIH P62 subunits ^27, således fremkalde en generel vært transskription undertrykkelse herunder IFN-alfa-genet og gener under RS promotor. C13type eller andre NSS mutanter mangler IFN-beta undertrykkelse funktion fremkalde IFN-beta syntese, som igen aktiverer IFN-alpha-promotoren og interferon-følsomme respons element (RS) promotor. IRF-7 er derefter transcriptionally opreguleret ved IFN-alpha/beta stimulering og yderligere opreguleres af IFN-alfa til støtte for IRF-3 ^28,29. I denne analyse, kode C57/WT MEF celler udskilles alkalisk fosfatase (SEAP) på nedstrøms en kunstig binding sekvens af NF-kB, IRF-3 og IRF-7. Således NSS mutanter mangler IFN-beta undertrykkelse funktion upregulate SEAP hvis sekretion er derefter måles.

Figur 7. Induktion af SEAP ved C13type
C57/WT MEF celler (InvivoGen) blev mock-Smittet eller inficeret med MP-12 eller rMP12-C13type (C13type) på moi af 3 (venstre panel) eller 0,01 (højre panel). Kultur supernatanter (50 μl) ved 14 HPI blev blandet med 200 μl af kvanti-Blue (InvivoGen) substrat i 96 brønds plade og OD-værdierne ved 650 nm blev målt efter 1 h inkubation ved 37 ° C ved en plade læser. Den relative stigninger på SEAP til mock-inficerede celler er vist. De data, der repræsenterer gennemsnittet + / - standardafvigelse af tre uafhængige forsøg. Den kultur supernatant fra C13type-inficerede celler viser øget SEAP, hvilket tyder på mangel på værten transskription undertrykkelse af NSS.

Figur 8. Nordlige skamplet med DIG-mærkede RNA-probe
Vildtype musen embryonale fibroblast (MEF) celler blev mock-smittet eller inficeret med MP-12 eller rMP12-C13type (C13type) på moi af 3. Total RNA blev indsamlet ved 7 HPI ved hjælp Trizol (Invitrogen), og Northern bmasse blev udført ved hjælp digoxigenin-mærket RNA probe specifikke for mus endogene ISG56 mRNA eller MP-12 N mRNA / anti-viral-sense S-segmentet ^2,30. For at gøre sonder til mus endogene ISG56 mRNA eller RVFV N mRNA / anti-viral-sense S-segmentet, sæt PCR-fragmenter forstærket af primer af KpnmISG56F (GGG TGG TAC CGC TCC ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG KAG) og HindmISG56 (TAC AAA GCT TAT GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA CCA GG) for ISG56 mRNA eller KpnNF (AGT TGG TAC CAT GGA CAA CTA TCA AGA GCT TGC G) og HindNR (GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT AAG) for RVFV N mRNA / anti-viral-sense S-segmentet blev fordøjet med KPN I og Hind III, og ligated ind pSPT18 plasmid (Roche. Så RNA prober mærket med digoxigenin blev syntetiseret ved hjælp DIG RNA Mærkning Kit (SP6/T7) (Roche, Cat # 1 175 025). Den 28S rRNA-niveau for hver prøve er også vist som lastning kontrol. Wild-type MEF celler inficeret med C13type induceret ISG56 mRNA syntese, mens dem, der smittes med MP-12 Inducerede ikke det, hvilket tyder på mangel på værten transskription undertrykkelse i C13type-inficerede celler. Dataene er i overensstemmelse med dem, der opnås ved SEAP assay i figur 6.

Omvendt genetik systemer til RVFV er udviklet af flere grupper ved at udnytte T7 promotoren ^2,4,5 eller mus ³ eller menneskelige ⁴ pol-I promotor. I dette manuskript, beskriver vi en protokol til at generere rekombinant RVFV MP-12 stammer ved hjælp BHK/T7-9 celler ^15, der stabilt udtrykker T7 RNA polymerase. Effektiviteten af ​​virale inddrivelsen forskellig, afhængig af tilstand BHK/T7-9 celler, mængden af ​​plasmider, antallet af transfekterede celler og så videre. Vi har altid forstærke P0 virus i Vero E6 celler for at opnå en høj titer virus lagre til eksperimenter. Type-I IFN-kompetente celler såsom menneskelige lunge diploide (MRC-5) celler kan bruges til viral forstærkning kun, når NSS-funktionen understøttes en effektiv virusreplikation ved at hæmme antivirale aktiviteter, herunder type I-IFN eller PKR.

En plak-analysen er en ganske nyttig metode til titrering MP-12 og NSS mutanter. Som en generel forholdsregel forplaque assay bør celler straks tilføjes med overlay på et passende temperatur efter fjernelsen af ​​virale inokulum. Crystal violet farvning er ikke egnet til påvisning af C13type virus plaques, fordi C13type virus ikke forstyrre monolayer af Vero E6 celler ^2. På den anden side kunne neutral røde pletter med succes afsløre plaques dannet af C13type virus. Styrken af ​​cellulære farvning med neutral rød bestemmes af den relative indarbejdelse af neutrale røde farvestof i levende celler. Det er derfor sandsynligt, at C13type-inficerede celler har en reduceret metabolisk aktivitet, som fører til nedsat iblanding af neutral rød farve sammenlignes med ikke-inficerede celler, og som danner en svag farvning fokus. Den krævede mængde neutral røde varierer med masser af neutral red løsning. Langsigtet opbevaring af neutral red løsning ofte genererer bundfald. Dette kan forebygges ved hjælp af varme-opløsning af neutral rød opløsning ved 55 ° C i 10 min, men detpåvirker farvning af celler.

Det er vigtigt at bruge vira med nøjagtige viral titer i eksperimenter. Den titer i en viral bestanden kan være nedsat af medierne med pH-værdi under 6,5 ^31, der er angivet med gullig farve af phenol rød i den virale lager, langtidsopbevaring, gentagne fryse-tø cykler og så videre. Derfor er det vigtigt at bruge friske viral materiel til dyrs vaccination eller titrere lager igen lige før eksperimentet.

RVFV indkode to karakteriseret strukturmaessige proteiner, NSS og NSM. Den RVFV mangler NSS er betydeligt svækket i dyr ^25,32, mens RVFV mangler NSM stadig er yderst virulent hos rotter ^33. Således NSS spiller en vigtig rolle som virulens faktor i patogenesen. NSS er et multifunktionelt protein, som inducerer 1) undertrykkelse af værten generelle transskription ^8, 2) undertrykkelse af IFN-beta mRNA syntese ²⁶ og 3) forringelse af dsRNA-dependent proteinkinase (PKR) ^9,10. Den forældrenes MP-12 stammen kunne yderligere svækket ved at indføre trunkering eller mutationer i NSS. På den anden side er det også vigtigt at fastholde immunogenicitet af sådanne mutant MP-12. Type-I IFN spiller en rolle for modningen af dendritiske celler, hvilket er vigtigt for den differentieringer af T-celler og B-celler ^12-14. Forskellige NSS mutanter mangler IFN-beta undertrykkelse funktion, som opretholde fuld eller delvis NSS funktioner, er nyttige til at analysere virkningen af ​​NSS-medieret IFN-beta undertrykkelse funktion på immunogenicitet og sikkerhed af vaccine kandidater. Det er kendt, at celler inficeret med RVFV WT ZH548 stammen aktivere NF-kB, IRF-3, og AP-1 (Figur 6), mens IFN-beta mRNA syntese er undertrykt af NSS på transkriptionel niveau ^7. Således MP-12, som udtrykker fuldt funktionel NSS ^3, hæmmer syntesen af NF-kB/IRF-3/7-inducible SEAP reportergen mRNA på transcriptional niveau, mens rekombinant MP-12 mangler NSS funktioner såsom C13type kunne få de SEAP mRNA syntese (figur 7). Til korrekt at forstå resultatet af immunogenicitet af sådanne mutanter, bør fænotyper yderligere karakteriseret i cellekultur-system. For eksempel bør den virale replikation kinetik afprøves i type I-IFN kompetente celler såsom menneskelige lunge diploide MRC-5 celler eller musen embryonale fibroblast (MEF) celler. PKR nedbrydning funktion kan testes ved Western blot med antistoffer specifikke for mennesker eller mus PKR. IFN-beta mRNA induktion af NSS mutation skal bekræftes ved det nordlige skamplet med digoxigenin-mærket RNA probe specifik mod human eller mus IFN-beta mRNA. Host generelle transskription undertrykkelse kan afprøves ved at analysere indarbejdelse af en Uridin analoge ind spirende mRNA. I sidste ende bør immunogenicitet og sikkerhed af kandidat MP-12 NSS mutanter blive testet i mus. Typisk, 1 x 10 ⁵ PFU af candidate vaccine fortyndes i PBS gives subkutant og sera indsamlet fra retro-orbital sinus på dag 30 (eller 42) og dag 180 testes for tilstedeværelse af neutraliserende antistoffer ved plaque reduktion neutralisere test (PRNT ₈₀₎ og total IgG mod RVFV N og GN / Gc af IgG ELISA belagt med oprensede rekombinante virale proteiner. Effekten af vaccinekandidater kan testes ved at udfordre mus ved 42 dage efter immunisering med vild-type ZH501 (f.eks, IP, 1 x 10 ³ PFU) på dyr biosikkerhedsniveau (BSL) 4 facilitet eller forbedrede BSL3 + facilitet i USA Den omvendte genetik tilgang er et kraftfuldt værktøj til at designe og generere sikker og immunogen levende svækkede RVFV vacciner.