JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Bioengineering

بروتوكول لكشف ونبش النفايات الغاز مرحلة الجذور الحرة في دخان السجائر العادي

1, 2, 2

1CDCF-AOX Lab, 2National Biomedical Center for Advanced ESR Technology (ACERT), Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    تم استخدام التحليل الطيفي للاحتباس تدور ESR لدراسة تأثير مضادات الأكسدة النباتية الليكوبين ، بيكنوغينول واستخراج بذور العنب على نظافتها الغاز مرحلة الجذور الحرة الموجودة في دخان السجائر.

    Date Published: 1/02/2012, Issue 59; doi: 10.3791/3406

    Cite this Article

    Yu, L. X., Dzikovski, B. G., Freed, J. H. A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (59), e3406, doi:10.3791/3406 (2012).

    Abstract

    ويرتبط تدخين السجائر مع السرطانات البشرية. وقد أفيد أن سبب معظم الوفيات بسرطان الرئة بسبب التدخين السجائر 5،6،7،12. على الرغم من القطران التبغ والمنتجات ذات الصلة في مرحلة الجسيمات من دخان السجائر من أهم أسباب الأمراض ذات الصلة مسرطنة ومطفرة ، دخان السجائر يحتوي على كميات كبيرة من الجذور الحرة التي تعتبر أيضا مجموعة هامة من المواد المسرطنة 9،10. الجذور الحرة الهجوم مكونات الخلية بنية البروتين الضارة ، والدهون وتسلسل الحمض النووي وتزيد من مخاطر الاصابة بأنواع مختلفة من السرطانات. تنتج الجذور استنشاق adducts التي تساهم في العديد من الآثار الصحية السلبية الناجمة عن دخان التبغ في الرئتين 3. وقد أجريت دراسات للحد من الجذور الحرة الموجودة في دخان السجائر لتقليل مخاطر الأضرار التي يسببها التدخين. وقد أفيد بأن الهيموغلوبين والتي تحتوي على مركبات الهيم يمكن مسح جزئيا أكسيد النيتريك ، على رد الفعلتأكسد وnitrosocompounds متقلبة مسرطنة من 4 دخان السجائر. وتألفت أ "تصفية الحيوي" كان يستخدم من الهيموغلوبين والكربون المنشط على كنس الجذور الحرة وإزالة ما يصل إلى 90 ٪ من الجذور الحرة من دخان السجائر 14. ومع ذلك ، ونظرا لعدم فعالية التكلفة ، وأنه لم يتم تسويقها بنجاح. وأظهرت دراسة أخرى جيدة من كفاءة الكسح shikonin ، وهو مكون من الادوية العشبية الصينية 8. في هذه الدراسة ، ونحن التقرير على بروتوكول مشترك لإدخال المستخلصات الطبيعية المضادة للأكسدة في فلتر السجائر لمسح المتطرفين المرحلة الغاز الحر في دخان السجائر وقياس الأثر على كنس الجذور الحرة في مرحلة الغاز دخان السجائر التيار (MCS) باستخدام تدور للاحتباس رنين تدويم الإلكترون (ESR) الطيفي 1،2،14. أظهرنا قدرة عالية من الليكوبين الكسح واستخراج بذور العنب والتي يمكن أن تشير إلى تطبيقها في المستقبل في مرشحات السجائر. ميزة هامة من هذه الايجابياتالزبالين pective هو أنه يمكن الحصول عليها بكميات كبيرة من مشتقات صناعة النبيذ أو الطماطم على التوالي 11،13

    Protocol

    1. المواد

    كانوا جميعا المذيبات المستخدمة في هذا العمل الصف كاشف. تدور في فخ ، بما في ذلك N - ثالثي بوتيل - α - phenylnitrone (PBN) والتسمية تدور القياسية 2،2،6،6 - ميثيل - 1 - piperinyoxyl (TEMPO) تم الحصول عليها من سيجما وكانت تستخدم لتوفيره. تم الحصول على مضادات الأكسدة النباتية تجاريا سوانسون من الولايات المتحدة الأمريكية ، وشركة.

    2. إعداد دخان السجائر وتحليل الجذور الحرة

    1. لإدخال المواد المضادة للاكسدة في التصفية ، حلت أول من المواد المضادة للاكسدة وبيكنوغينول استخراج بذور العنب في الايثانول 95 ٪ ، في حين حلت الليكوبين في الأسيتون. وكانت وحدات التخزين المذيبات مختلفة اعتمادا على الذوبان المضادة للأكسدة.
    2. كمية من المواد المضادة للاكسدة والتي تبلغ 0.4 استخدمت مغ / التصفية. وكانت مغلفة ثم انهم مع 10 ملغ من الكربون المنشط. لهذا الغرض وكان أثار الكربون المنشط لساعات 12 ~ مع الحل المضادة للأكسدة في الظروف اللاهوائية ، التي تمت تصفيتها وتجفيفها تحت فراغ. ثم أدخلت المواد المضادة للاكسدة في تصفية خلات التقليدية (CA فلتر). لهذا الغرض ، تم قطع التصفية الى قطعتين. أدرجت المغلفة مضادات الأكسدة النباتية بين قطعتين من التصفية وملفوفة بقطعة من الشريط لتشكيل فلتر -- مضادات الأكسدة تصفية شطيرة (الشكل 1A). وعلقت في وقت لاحق هذا المرشح الجامع لقضبان السجائر التي تحتوي على التبغ. وأضيف عنصر التحكم تم تصفية في بنفس الطريقة التي عامل التصفية المضادة للأكسدة أي باستثناء المضادة للأكسدة.
    3. قبل محاكاة التدخين ، وتفكيك السجائر البحوث والاحتفاظ بها في بيئة الرطوبة ثابتة (20 درجة مئوية والرطوبة النسبية 60 ٪) باستخدام محلول مشبع NaBr مدة لا تقل عن 2 يوما.
    4. تم إجراء محاكاة التدخين للتحليل الروتيني عند درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز واحد التدخين المرفأ الذي ، كما هو مبين في Fig.1 ، يتكون من الماء أو الشافطة غاست مضخة كهربائية DOA - P104 - BN / ضاغط الهواء (بينتون هاربور ، ميش) متصلا إلى محاصرة الجانبيةالتجمع من خلال تقاطع - T مع نهاية واحدة مفتوحة. أجريت نفث عن طريق توصيل النهاية المفتوحة التي لا تزال مفتوحة بين نفث. تم فحص تدفق الغاز من خلال تدفق متر والتي وضعت في ~ 2.2 = 17.5 مل SCFH / ثانية عن طريق ضبط صمام وضعت بين المضخة وتنفيس.
    5. ويدخن السجائر البحوث تحت شرط حجم نفخة من 35 مل لمدة 2 ثانية يتكرر كل 60 ثانية ، على غرار 1. تم إجراء محاكاة لتقدير كمية التدخين من الغاز في المرحلة الجذور الحرة جنبا إلى جنب مع نظام تدور محاصرة كما هو مبين في الشكل. 1.
    6. واتخذت عشرة نفث مكثفة (35 مل / نفخة) لكل السجائر. وقد تم جمع الغاز مرحلة الجذور الحرة وذلك بتمرير MCS من خلال لوحة مرشح كامبريدج ، وقدم بعد ذلك إلى زيادة ونقصان حل محاصرة (0.05 م PBN في البنزين ، 2.0 مل).
    7. بعد نفخة الماضي ، كان الحل محاصرة فقاعات عدلت للحجم الأولي (2.0 مل) مع البنزين نفسه. ونقلت وقسامة الى 25 ~0 مم و 3 مم أنبوب الزجاج رقم واحد في نهاية مغلقة.
    8. وكان الحل امؤكسج محاصرة باستخدام إجراء تجميد مضخة الذوبان. أنها جمدت بموجب النيتروجين السائل ، وطبق من فراغ. ثم تم إذابة تحت جو الأرجون ، والسماح فقاعات الغاز المحاصرين الى الهرب ، والمجمدة مرة أخرى. بعد تكرار هذه الدورة ثلاث مرات ، وكان الأنبوب اللهب مختومة تحت فراغ وتستخدم في قياسات ESR أخرى. مطلوب هذه الخطوة لأن الأكسجين ، وهو قابل للذوبان بشكل جيد في مادة البنزين ويوسع خطوط ESR من المتطرفين العضوية. نزع الأكسجين يحسن كثيرا من نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
    9. سجلت فرقة X - ESR الأطياف على مطياف EMX بروكر على تردد 9.34 جيجاهيرتز تحت الظروف القياسية. تم ضبط مطياف المستخدمة في معظم التجارب : مركز حقل 3312.5G والمسح 80G العرض ، تعديل السعة 0.5G ، والوقت ثابت 82 ميكروثانية ، والمسح الضوئي الوقت 40 ثانية.
    10. وتدور adducts فخ مستقرة نسبيا في ظروف التجربة ، والتي في بعض الحالات مساuired 25 التراكمات التي اتخذت عادة ~ 20 دقيقة. ومع ذلك ، بعد 12 ساعة انخفضت كثافة الإشارات ESR في محلول البنزين بمعامل ~ 5.
    11. لقياس تركيز معقد إضافي محاصرة ، تم دمج الأولي طيف ESR أول المشتقة. امتصاص الطيف الناتجة يظهر خلفية القميص واسع ، على الأرجح بسبب السخام / القطران المنتجات الواردة في الدخان.

      بعد طرح هذه الخلفية تم دمج الثلاثي فصل من ناتج إضافة محاصرة وقت واحد أكثر (الشكل 2).

    3. ممثل النتائج

    معظم الجذور الحرة في حرق السجائر المنتجة دخان (المرحلة الغاز) لحظية وغير مستقرة. من أجل مراقبة هؤلاء المتطرفين ويستخدم تقنية فخ زيادة ونقصان. انها تلتقط الغاز مرحلة الجذور الحرة من قبل تحويلها إلى ناتج إضافة تدور أكثر استقرارا ، ويمكن الكشف عنها بواسطة ESR (Fig.1). في هذه الدراسة ، فإن الحل تدور فخ 0.05وقد استخدم M PBN لجمع الغاز دخان المرحلة الجذور الحرة ، والتي هي خليط من الجذور الأكسجين والكربون محورها التي يصعب فصل 15. في حالتنا ، ولكن ، لوحظ تقسيم فائق الدقة الثوابت A N = = 13.7G و1.95G H متشابهة الى حد بعيد القيم المناظرة لمحاصرة adducts من الجذور الحرة alkoxyl (RO.) 2 ، مما يوحي بأنهم المنتجات الرئيسية. أثبتنا أن الإشارات الضعيفة واستنساخ ESR منخفض لوحظ في قياساتنا الأولي (الشكل 2) ونظرا لتدفق الرطوبة في الدخان. لحل هذه المشكلة ، واضاف لدينا النيتروجين السائل (LN2) فخ بين مرشح كامبريدج والحل فخ زيادة ونقصان. 2 في فخ LN إزالة المياه من التدفق من خلال تجميد MCS سريعة واحتلالها على الجدار الداخلي للأنبوب زجاجي. هذا تحسن كبير إشارات ESR وسمحت النتائج للاستنساخ عالية (الشكل 3).

    وقد تم تحديد مبلغ الجذور الحرة المحاصرين باستخداممرجع العينة. لعينات السيطرة دون مضادات الأكسدة ، وكان تركيز معقد إضافي نموذجي في البنزين قدرت عن طريق المقارنة لا يتجزأ من الطيف لها مزدوجة مع الطيف لا يتجزأ مزدوجة لتركيز معروف من TEMPO 1.24 ميكرومتر (Fig.2). لأن كمية من الهواء تمر عبر كل سيجارة أثناء التدخين و~ 350 مل ، وهذا يعطي تقديرا للتركيز على الجذور الحرة في مرحلة الغاز في MCS من ~ M -9 7.1X10 ، وعدد من المتطرفين المحاصرين من مرحلة الغاز من سيجارة كاملة من 15 1.5X10 ~. وتقديرا لمجموع الجذور الحرة في دخان سيجارة كاملة ، بما في ذلك الغاز ومرحلة الجسيمات ، ~ 10 16 9 الجذور الحرة.

    وقد لوحظت مستويات مختلفة من تأثير مضادات الأكسدة النباتية الكسح على الغاز في المرحلة الجذور الحرة في التيار الرئيسي دخان السجائر. وقدمت معدلاتها الكسح في الشكل. 4. وأظهرت الليكوبين واستخراج بذور العنب أعلى معدلات منخفضة في حينولوحظ إيه معدل بيكنوغينول (Fig.4).

    الشكل 1
    الشكل 1. رسم تخطيطي لتحسين تصميم محاكاة التدخين لجمع الغاز مرحلة الجذور الحرة في دخان السجائر التيار (MCS) باستخدام فخ زيادة ونقصان. ولفت MCS بواسطة شفاطة المياه من خلال تصفية CA ، ثم كامبريدج تصفية (فلتر الأصفر) ، ومرت فخا لإزالة النيتروجين السائل H 2 O. منتجات الغاز ذهبت اخيرا الى مرحلة تدور الفخ وانفجر من خلال زيادة ونقصان حل الفخ. وقد وضعت مضادات الأكسدة النباتية بين قطعتين من المرشحات خلات التقليدية (الموسع في الدائرة أ) تعلق على السجائر على كنس الجذور الحرة في MCS.

    الشكل 2
    الشكل 2. تقدير كمي للتركيز معقد إضافي للاحتباس تدور في البنزين يتطلب طرح إشارة خلفية واسعة من INTEGRA firstل الطيف. المعلمات تقسيم فائق الدقة للناتج إضافة تدور محاصرة هي H = 1.95 G ، أ = N 13.7G.

    الشكل 3
    الشكل 3. تمرير عن طريق فخ LN2 يحسن كثيرا من جودة الإشارات التي تم الحصول عليها من خلال محاصرة ESR - دوران MCS.

    الشكل 4
    الشكل 4. تأثير مضادات الأكسدة الطبيعية على تركيز الجذور الحرة في MCS. شدة إشارة النسبية هي : السيطرة -- 100 ٪ ، وبيكنوغينول -- 55 ٪ ، استخراج بذور العنب -- 12 ٪ ، الليكوبين -- 10 ٪.

    Discussion

    تقدير موثوق به للتأثير الزبالين الحرة الراديكالية المختلفة الموجودة في دخان التبغ يتطلب تقنية استنساخه للكشف عن كمية من الجذور الحرة. 1 سابقا ، وقد تبين أن كميات صغيرة من أعلى تركيز فخ الحلول تدور في المذيبات غير القطبية هي الأكثر فعالية في محاصرة المتطرفين خالية من دخان التبغ. دخان السجائر يحتوي على بخار الماء دائما من احتراق المركبات العضوية والرطوبة المتبقية في التبغ والتي يمكن في نهاية المطاف في المذيبات محاصرة. هذا مزيج من المياه في فخ الحل PBN تدور يقلل كثيرا من عمر adducts محاصرة تدور وكثافة إشاراتها ESR. إزالة الرطوبة من خلال هذا بسيط MCS يمر من خلال أنبوب على شكل حرف U تبرد مع النيتروجين السائل تحسنت بشكل كبير على نوعية أطياف ESR في تجاربنا ، على الرغم من بعض قد يكون جزء من الغاز في المرحلة المتطرفين المحاصرين أيضا على السطح المتجمد.

    ر بهأسلوبه قارنا الكفاءة النسبية لمختلف الراديكالية بنبش المركبات الطبيعية التي أدخلت مرشحات السجائر. وجدنا أن الليكوبين واستخراج بذور العنب مباشرة بعد تضمين مرشحات السجائر قادرة على مسح تصل إلى 90 ٪ من الجذور الحرة من الغاز MSC المرحلة. مثل هذه القدرة العالية الكسح صفوف هذه المركبات الطبيعية الرخيصة المتاحة بسهولة بين حماة الأكثر كفاءة وذكرت الجذور الحرة مثل الهيموجلوبين وshikonine 8،14. حتى الآن ، لدينا في مرشحات السجائر التجارب محملة مضادات الأكسدة الطبيعية درس فقدت جزءا ملحوظا من قدرتها على المسح بعد أسبوع من التخزين في درجة حرارة الغرفة. ويمكن حل هذه المشكلة تحفيز الطلب في المستقبل الليكوبين واستخراج بذور العنب في مرشحات السجائر التجارية.

    Disclosures

    الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

    Acknowledgements

    وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة ، ومنحة المعاهد الوطنية للصحة رقم / NCRR P41 - RR 016292 (على سبيل ACERT).

    References

    1. Baum, S. L., Anderson, I. G. M., Baker, R. R., Murphy, D. M., Rowlands, C. C. Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure. Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).
    2. Bluhm, A. L., Weinstein, J., Sousa, J. A. Free radicals in tobacco smoke. Nature. 229, 500-500 (1971).
    3. Church, D. F., Pryor, W. A. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications. Environ. Health. Perspect. 64, 111-126 (1985).
    4. Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J. C. Scavenging effects of hemoglobin and related heme containing compounds on nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke. a new method for protection against the dangerous cigarette constituents. Anticancer. Res. 14, 2717-2726 (1994).
    5. Hecht, S. S. Tobacco smoke carcinogens and lung cancer. Journal of the National Cancer Institute. 91, 1194-1210 (1999).
    6. Kodama, M., Kaneko, M., Aida, M., Inoue, F., Nakayama, T., Akimoto, H. Free radical chemistry of cigarette smoke and its implication in human cancer. Anticancer. Res. 17, 433-437 (1997).
    7. Nair, A. K., Brandt, E. N. Effects of smoking on health care costs. Journal of Oklahoma State Medical Association. 93, 245-250 (2000).
    8. Nishizawa, M., Kohno, M., Nishimura, M., Kitagawa, A., Niwano, Y. Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment. Chem. Pharm. Bull. 53, 796-799 (2005).
    9. Pryor, W. A. Cigarette smoke and the involvement of free radical reactions in chemical carcinogenesis. Br. J. Cancer. 8, 19-23 (1987).
    10. Pryor, W. A. Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity. Environ. Health. Perspect. 105, 875-882 (1997).
    11. Rozzi, N. I., Singh, R. K., Vierling, R. A., Watkins, B. A. Supercritical fluid extraction of lycopene from tomato processing byproducts. J. Agric. Food. Chem. 50, 2638-2643 (2002).
    12. Shopland, D. R. Tobacco use and its contribution to early cancer mortality with a special emphesis on cigarette smoking. Environmental. Health. Perspectives. 103, 131-142 (1995).
    13. Shrikhandle, A. J. Wine products with health benefits. Food Res. Int. 33, 469-474 (2000).
    14. Valavanidis, A., Haralambous, E. A comparative study by electron paramagnetic resonance of free radical species in the mainstream and sidestream smoke of cigarettes with conventional acetate filters and 'bio-filters'. Redox. Rep. 6, 161-171 (2001).
    15. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K. Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).

    Comments

    6 Comments

    Fantastic, well done. Everybody gains here, the smoker, non-smoker and the environment.
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 3, 2012, 1:28 PM

    Actually, nobody gains. If cancer were the only health concern, I could possibly get enthused. But, what about cardiovascular and respiratory concerns. Plus, most of the smoke generated by a burning cigarette is sidestream, not mainstream. The sidestream smoke is not passing through any filter, so the carcinogens are still abundantly present to the non-smoker and smoker alike.
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 4, 2012, 4:31 PM

    This work was previously published, but you do no cite the paper.
    Scavenging Effects of Plant Antioxidants on Gas-Phase Free Radicals in
    Mainstream Cigarette Smoke
    Xin Shen a; Kejun Zhong b; Xianjun Sun b; Hongbing Lu b; Yu Shen c;Long-Xi Yu ac
    a Department of Plant Breeding and Genetics, Cornell University, Ithaca, New York, USA b Technical
    Center of China Tobacco Hunan Industrial Corp. Ltd., Changde, China c Hunan Agricultural
    University, Changsha, China Analytical Letters, 43: 446²11;454, ²010
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 16, 2012, 8:12 PM

    To the editors

    The author Long-Xi Yu is affiliated with the Changde Cigarette Factory (CDCF). He clearly has a potential conflict of interest. Why is he allowed not to declare this conflict?

    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 30, 2012, 6:22 AM

    Thank you for your comment. Since the authors do not recommend smoking, nor promote any one additive CDFC produces, we felt listing the affiliation was sufficient.

    Beth Hovey (Editorial Director)
    Reply

    Posted by: Beth H.January 31, 2012, 4:36 PM

    Muy bien excelente, yo soy estudiante de ingeniería industrial y tengo como proyecto hacer un purificador para autos así evitar la contaminación ambiental y personal que tenemos al inalar tanto humo en las calles. ¿ alguien me podría ayudar con la parte química? gracias
    Reply

    Posted by: Oscar yovanny p.August 28, 2013, 11:56 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter