פרוטוקול לאיתור גז הדחה בשלב רדיקלים חופשיים עשן סיגריות רגילה

Yu, L. X., Dzikovski, B. G., Freed, J. H. A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (59), e3406, doi:10.3791/3406 (2012).

עישון סיגריות קשור סרטן אנושיים. זה כבר דיווחו כי רוב מקרי המוות מסרטן הריאות נגרמים על ידי עישון סיגריות ^5,6,7,12. למרות המלחים טבק ומוצרים נלווים בשלב החלקיקים של עשן הסיגריות הם הגורמים העיקריים של מחלות הקשורות ו מוטגניות מסרטנים, עשן סיגריות מכיל כמויות משמעותיות של רדיקלים חופשיים נחשבים גם כקבוצה חשוב של חומרים מסרטנים ^9,10. רדיקלים חופשיים לתקוף מרכיבי התא על ידי מבנה חלבונים, שומנים פוגע רצפי DNA ולהגדיל את הסיכון לפתח סוגים שונים של סרטן. רדיקלים בשאיפה לייצר adducts שתורמים רבות של ההשפעות הבריאותיות השליליות של עישון טבק בריאה ^3. מחקרים שנערכו כדי להפחית את הרדיקלים החופשיים בעשן הסיגריות כדי להקטין סיכונים של פגיעה הנגרמת מעישון. זה כבר דווח כי המוגלובין heme המכיל תרכובות יכול חלקית לחפש תחמוצת החנקן, תגובתיאוקסידנטים nitrosocompounds נדיפים מסרטנים של ⁴ עשן סיגריות. "ביו מסנן" כלל פחמן המוגלובין מופעל שימש לחפש רדיקלים חופשיים להסיר עד 90% של רדיקלים חופשיים של עשן סיגריות ^14. עם זאת, בשל חוסר יעילות, עלות, זה לא היה ממוסחר בהצלחה. מחקר נוסף הראה יעילות הדחה טובה של shikonin, רכיב של צמחי מרפא סיניים ^8. במחקר הנוכחי, אנו מדווחים פרוטוקול מציגה משותף תמציות נוגדי חמצון טבעיים לתוך מסנן את הסיגריה הדחה בשלב גז רדיקלים חופשיים עשן סיגריות מדידת ההשפעה לחפש על שלב רדיקלים חופשיים גז בעשן הסיגריות המיינסטרים (MCS) באמצעות ספין השמנה אלקטרונים ספין תהודה (שקיעת דם) ספקטרוסקופיה ^1,2,14. הראינו יכולת הדחה גבוה של ליקופן ותמצית זרעי ענבים אשר יכול להצביע על יישום עתידם פילטרים של סיגריות. יתרון חשוב של המקצוענים האלהאוכלי נבלות pective היא שהם ניתן לקבל כמויות גדולות של מוצרי לוואי של תעשיית עגבניות או יין בהתאמה ^11,13

1. חומרים

כל ממיסים המשמשים בעבודה זו היו בכיתה מגיב. מלכודת ספין, כולל N-טרט-בוטיל-α-phenylnitrone (PBN) ואת התווית ספין תקן 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperinyoxyl (טמפו) התקבלו סיגמא שימשו המסופקים. נוגדי חמצון המפעל התקבלו מסחרית של סוונסון, Inc בארה"ב.

2. הכנת עשן סיגריות וניתוח של רדיקלים חופשיים

1. כדי להציג חומרים נוגדי חמצון לתוך המסנן, פיקנוגנול נוגדי חמצון תמצית זרעי ענבים היו מומסים הראשון אתנול 95%, ואילו הליקופן היה מומס אצטון. הכרכים ממס היו שונים בהתאם מסיסות נוגדי חמצון.
2. כמות נוגדי החמצון של 0.4 מ"ג / פילטר היה בשימוש. הם היו מצופים אז עם 10 מ"ג של פחם פעיל. לשם כך פחם פעיל היה נרגש עבור ~ 12 שעות עם הפתרון נוגד חמצון בתנאים אנאירוביים, מסונן מיובשים תחת ואקום. נוגדי חמצון הוכנסו מכן לתוך המסנן אצטט קונבנציונלי (ע"א לסנן). לענין זה, מסנן נחתך לשני חלקים. המפעל נוגדי חמצון מצופה הוכנסו בין שתי פיסות המסנן עטוף בפיסת קלטת כדי ליצור מסנן - נוגד חמצון, מסנן כריך (איור 1A). מסנן זה בשילוב צורפה לאחר מכן מוטות סיגריות המכילות טבק. בקרת המסנן נעשה באותה דרך כמו מסנן נוגד חמצון, למעט נוגדי חמצון לא נוספה.
3. לפני הסימולציה עישון, סיגריות המחקר היו פרקה והמשיך בסביבת לחות קבועה (20 ° C, לחות יחסית של 60%) באמצעות פתרון NaBr רווי מינימום של 2 ימים.
4. סימולציה עישון לניתוח שגרתי בוצע בטמפרטורת הסביבה באמצעות מכשיר חד נמל העישון אשר, כפי שמוצג תמונה 1, מורכב aspirator מים או גסט DOA-P104-BN משאבת ואקום / מדחס אוויר (בנטון הארבור, Mich) המחובר על השמנה, ספיןהרכבה דרך צומת-T עם קצה אחד פתוח. נפחא בוצעו על ידי פקיקה את הקצה הפתוח אשר נותרה פתוחה בין שאיפות. זרימת הגז נבדקה על ידי מד זרימת ולהגדיר ב ~ 2.2 SCFH = 17.5 mL / s על ידי התאמת שסתום ממוקם בין המשאבה לבין פורקן.
5. סיגריות המחקר היו מעושן בתנאים של נפח נשיפה של 35 מ"ל למשך של 2 שניות חוזר כל 60 שניות, בדומה ^1. סימולציה עישון לאמידה כמותית של גז שלב רדיקלים חופשיים בוצע בשיתוף עם מערכת ספין השמנה כפי שמוצג באיור. 1.
6. עשרת פחזניות אינטנסיבי (35 mL / נשיפה) נלקחו כל סיגריה. גז שלב רדיקלים חופשיים נאספו על ידי העברת MCS דרך מסנן קיימברידג' לרפד ולאחר מכן הציג את הפתרון ספין השמנה (0.05 מ 'PBN ב בנזין, 2.0 מ"ל).
7. לאחר נשיפה האחרון, הפתרון השמנה מבעבע היה וסידרה נפח הראשונית שלה (2.0 מ"ל) עם בנזן זהה. Aliquot הועבר אל ~ 250 מ"מ אורך, 3 מזהה מ"מ זכוכית צינור אטום בקצה אחד.
8. הפתרון היה deoxygenated השמנה באמצעות הליך הקפאת-pump-ההפשרה. זה היה קפוא תחת חנקן נוזלי, ו - ואקום יושמה. אז זה היה מופשר תחת אווירה ארגון, המאפשר בועות גז שנלכדו לברוח, קפוא שוב. לאחר מחזור זה חזר על עצמו שלוש פעמים, הצינור היה להבה חתום תחת ואקום ומשמש במדידות שקיעת דם נוספת. צעד זה נדרש כי חמצן, אשר מסיסה היטב בנזן, מרחיב קווי שקיעת דם של רדיקלים אורגניים. Deoxygenation משפר באופן דרמטי את יחס האות לרעש.
9. X-Band שקיעת דם ספקטרה נרשמו על ספקטרומטר Bruker EMX בתדר של 9.34 GHz בתנאים סטנדרטיים. ההגדרות ספקטרומטר בשימוש ברוב הניסויים היו: מרכז השדה 3312.5G, סריקת רוחב 80G, אפנון משרעת 0.5g, קבוע הזמן 82 מיקרו שניות, זמן סריקה 40 שניות.
10. מלכודת adducts ספין הם יציבים יחסית לתנאי הניסוי, אשר במקרים מסוימים required 25 הצטברויות, אשר בדרך כלל לקח ~ 20 דק '. עם זאת, לאחר 12 שעות את עוצמת האותות שקיעת דם בתמיסה בנזין ירד בפקטור של ~ 5.
11. כדי לכמת את הריכוז של adduct השמנה, הראשונה נגזרת הקשת הראשונית שקיעת דם היה משולב. ספקטרום הבליעה שהתקבל מראה רקע גופיה רחבה, ככל הנראה בשל פיח / זפת המוצרים הכלולים העשן.
    
    לאחר ניכוי רקע זה שלישיה הפרידה של adduct השמנה היה משולב עוד פעם אחת (איור 2).

3. נציג תוצאות

רוב הרדיקלים החופשיים המיוצרים סיגריה בוערת עשן (שלב גז) הם רגעי ובלתי יציב. על מנת לצפות אלה רדיקלים טכניקה מלכודת ספין הוא מועסק. היא לוכדת גז שלב רדיקלים חופשיים על ידי להפוך אותם adduct ספין שהוא יותר יציב והוא יכול להיות מזוהים על ידי שקיעת דם (תמונה 1). במחקר הנוכחי, הפתרון ספין מלכודת של 0.05M PBN שימש לאיסוף גז עשן שלב רדיקלים חופשיים, שהם תערובת של רדיקלים חמצן ופחמן ממוקדת אשר קשה להפריד בין ^15. במקרה שלנו, לעומת זאת, פיצול קבועים נצפתה hyperfine = _N 13.7G ו = _H 1.95G דומים מאוד לערכים המתאימים עבור לכידת adducts של רדיקלים חופשיים alkoxyl (RO.) ^2, מה שמראה כי הם המוצר העיקרי. הראינו כי אותות חלשים reproducibility שקיעת דם נמוך נצפתה במדידות הראשוניות שלנו (איור 2) היו בשל הלחות בזרימת עשן. כדי לפתור בעיה זו, הוספנו חנקן נוזלי (LN2) מלכודת בין מסנן קיימברידג' הפתרון למלכודת הספין. מלכודת ₂ LN מוסר מזרימת מים MCS על ידי הקפאה מהירה ללכוד אותו על הקיר הפנימי של צינור הזכוכית. זה השתפר מאוד אותות שקיעת דם ואפשרו תוצאות לשעתקו מאוד (איור 3).

כמות הרדיקלים החופשיים לכודים נקבע באמצעותהתייחסות המדגם. לקבלת דוגמיות לשלוט ללא חומרים נוגדי חמצון, ריכוז adduct טיפוסי בנזן מוערך על ידי השוואה של הספקטרום נפרד כפולה עם קשת אינטגרלי כפול ריכוז ידוע של קצב היה 1.24 מיקרומטר (Fig.2). מאז כמות האוויר עבר כל סיגריה בזמן העישון ~ 350 מ"ל, זה נותן אומדן ריכוז רדיקלים חופשיים גז בשלב של MCS של ~ 7.1X10 מ ^-9, וכן סך של רדיקלים לכודים משלב גז סיגריה שלמה של ~ 1.5X10 ^15. אומדן הסכום הכולל של הרדיקלים החופשיים בעשן הסיגריה כולה, כולל גז והן בשלב חלקיקים, היה 10 ~ ¹⁶ רדיקלים חופשיים ^9.

רמות שונות של השפעת הדחה של הצמח חומרים נוגדי חמצון על גז שלב הרדיקלים החופשיים בעשן סיגריות הזרם המרכזי נצפו. שיעורי הדחה שלהם הוצגו איור. 4. ליקופן ותמצית זרעי ענבים הראו את השיעורים הגבוהים ביותר תוך נמוךשיעור אה נצפתה פיקנוגנול (Fig.4).

באיור 1. תרשים של תכנון סימולציה משופר עישון לאיסוף גז שלב הרדיקלים החופשיים בעשן הסיגריות המיינסטרים (MCS) באמצעות מלכודת ספין. MCS צויר על ידי aspirator מים דרך מסנן CA, אז קיימברידג' מסנן (מסנן צהוב) ועבר דרך מלכודת חנקן נוזלי כדי להסיר H ₂ O. הגז בשלב מוצרים ולבסוף הלך ספין מלכודת מבעבע דרך הפתרון למלכודת הספין. נוגדי חמצון הצמח הונח בין שתי פיסות מסננים אצטט קונבנציונאלי (מוגדל במעגל) מצורף סיגריה כדי לחפש רדיקלים חופשיים MCS.

באיור 2. הערכה כמותית של ריכוז ספין השמנה adduct ב בנזן דורש הפחתת אות רקע רחב של Integra firstאני קשת. פיצול hyperfine הפרמטרים adduct ספין השמנה הם = 1.95 G _{H, N} = 13.7G.

באיור 3. כשעברו LN2 מלכודת משמעותי משפר את איכות אותות שקיעת דם מתקבל על ידי לכידה ספין של MCS.

איור 4. השפעת נוגדי חמצון טבעיים על ריכוז של רדיקלים חופשיים MCS. עוצמות אות יחסית הם: שליטה - 100%, פיקנוגנול - 55%, תמצית זרעי ענבים - 12%, ליקופן - 10%.

אומדן מהימן של ההשפעה של רדיקלים חופשיים נבלות שונים בעשן הטבק דורש טכניקה לשחזור לגילוי כמותי של רדיקלים חופשיים. ¹ בעבר, הוכח כי כמויות קטנות של ספין גבוה יותר ריכוז פתרונות מלכודת קוטבי ממיסים יעילים ביותר השמנה רדיקלים חופשיים מתוך עשן טבק. עשן סיגריות מכיל תמיד אדי מים מן הבעירה של תרכובות אורגניות ואת הלחות שאריות טבק אשר יכול בסופו של הממס השמנה. זו תערובת של מים הפתרון למלכודת הספין PBN מקטין באופן משמעותי את חייו של adducts השמנה ספין את עוצמת האותות שקיעת דם שלהם. הסרת הלחות באמצעות MCS פשוט עובר דרך צינור בצורת U מקורר עם חנקן נוזלי באופן דרמטי לשפר את איכות ספקטרה שקיעת דם בניסויים שלנו, למרות שחלק שבריר של גז שלב הרדיקלים יכול להיות לכוד גם על משטח קפוא.

שימוש לאהטכניקה שלו השווינו את היעילות היחסית של שונות הרדיקלי הדחה תרכובות טבעיות הציג לתוך פילטרים של סיגריות. מצאנו כי הליקופן ואת זרעי ענבים לחלץ מיד לאחר שילוב לתוך פילטרים לסיגריות יכולים לחפש עד 90% של רדיקלים חופשיים מ MSC השלב גז. כזו יכולת הדחה מדרג גבוה התרכובות הללו זול טבעי וזמין בין מגיני דיווח היעילה ביותר רדיקלים חופשיים כמו המוגלובין shikonine ^8,14. ובכל זאת, מסננים בניסויים שלנו סיגריה עמוסה למד נוגדי חמצון טבעיים איבד חלק ניכר של כושר הדחה שלהם לאחר שבוע של אחסון בטמפרטורת החדר. לפתרון בעיה זו יכולה לגרות היישום העתידי של ליקופן ותמצית זרעי ענבים מסננים סיגריות מסחריות.

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות, NIH מענק מס / NCRR P41-RR 016292 (עבור ACERT).

1. Baum, S.L., Anderson, I.G.M., Baker, R.R, Murphy, D.M., & C.C., Rowlands. Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure. Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).
2. Bluhm, A.L., Weinstein, J., & Sousa, J.A. Free radicals in tobacco smoke. Nature. 229, 500 (1971).
3. Church, D.F. & Pryor W.A. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications. Environ. Health. Perspect. 64, 111-126 (1985).
4. Deliconstantinos, G., Villiotou, V., & Stavrides, J.C. Scavenging effects of hemoglobin and related heme containing compounds on nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke. a new method for protection against the dangerous cigarette constituents. Anticancer. Res. 14, 2717-2726 (1994).
5. Hecht, S.S. Tobacco smoke carcinogens and lung cancer. Journal of the National Cancer Institute. 91, 1194-1210 (1999).
6. Kodama, M., Kaneko, M., Aida, M., Inoue, F., Nakayama, T., & Akimoto, H. Free radical chemistry of cigarette smoke and its implication in human cancer. Anticancer. Res. 17, 433-437 (1997).
7. Nair, A.K. & Brandt, E.N. Effects of smoking on health care costs. Journal of Oklahoma State Medical Association. 93, 245-250 (2000).
8. Nishizawa, M., Kohno, M., Nishimura, M., Kitagawa, A., & Niwano, Y. Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment. Chem. Pharm. Bull. 53, 796-799 (2005).
9. Pryor, W.A. Cigarette smoke and the involvement of free radical reactions in chemical carcinogenesis. Br. J. Cancer. 8, 19-23 (1987).
10. Pryor, W.A. Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity. Environ. Health. Perspect. 105, 875-882 (1997).
11. Rozzi, N.I., Singh, R.K., Vierling, R.A., & Watkins, B.A. Supercritical fluid extraction of lycopene from tomato processing byproducts. J. Agric. Food. Chem. 50, 2638-2643 (2002).
12. Shopland, D.R. Tobacco use and its contribution to early cancer mortality with a special emphesis on cigarette smoking. Environmental. Health. Perspectives. 103, 131-142 (1995).
13. Shrikhandle, A.J. Wine products with health benefits. Food Res. Int. 33, 469-474 (2000).
14. Valavanidis, A. & Haralambous, E.A comparative study by electron paramagnetic resonance of free radical species in the mainstream and sidestream smoke of cigarettes with conventional acetate filters and 'bio-filters'. Redox. Rep. 6, 161-171 (2001).
15. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., & Fiotakis, K. Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).

4 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.